Տեղեկություն

Էթանոլում ՌՆԹ տեղումների համար պահանջվող ժամանակը

Էթանոլում ՌՆԹ տեղումների համար պահանջվող ժամանակը


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ես բակտերիալ ՌՆԹ-ն նստեցրեցի 1 ժամվա ընթացքում -80ºC ջերմաստիճանում RRNA-ն Ribo-Zero փաթեթով սպառելուց հետո:

Արդյո՞ք ավելի շատ ժամանակն ավելի լավ արդյունքների է հանգեցնում:


Որքանով ես գիտեմ, սա երբեք մանրակրկիտ վերլուծության չի ենթարկվել ՌՆԹ-ի համար, բայց կա մի հիանալի փաստաթուղթ ԴՆԹ-ի տեղումների և BRL Focus-ում սովորական պայմանների վերաբերյալ Zeugin-ի կողմից (տե՛ս ստորև հոդվածը): Քանի որ ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն գրեթե նույնն են (բացառությամբ մեկ OH-խմբի), և տեղումների համար օգտագործվող պայմանները նույնպես նման են, կարծում եմ, որ մենք կարող ենք դա օգտագործել շատ մոտ գնահատման համար:

Հետաքրքիր է, որ տեղումների ոչ ժամանակը, ոչ ջերմաստիճանը մեծ ազդեցություն չունեն արդյունքի վրա. դրանք միայն մի քանի տոկոսով են փոխում բերքատվությունը: Եթե ​​նայեք նշված թղթից 2-րդ նկարին, ապա կտեսնեք հետևյալը.

Այս ենթապատկերը ցույց է տալիս, որ վերականգնման վրա գրեթե չի ազդում ջերմաստիճանը, այլ միայն ԴՆԹ-ի (կամ ՌՆԹ-ի) համակենտրոնացումը: Կախված նրանից, թե որքան ՌՆԹ եք ակնկալում (որքան բջիջ եք օգտագործել մեկուսացման համար), ես կավելացնեմ համակցված տեղումների նյութ, երբ դուք ունեք միայն շատ փոքր քանակությամբ ՌՆԹ: Այստեղ գլիկոգենը շատ լավ է աշխատում։ Հակառակ դեպքում չէի անհանգստանա։

Այս ցուցանիշը ցույց է տալիս, որ ինկուբացիոն ժամանակը ազդում է միայն վերականգնման տոկոսի վրա, երբ այն ժամանակ շատ կարճ է: Եթե ​​մեկ ժամ ինկուբացիա եք անում, ապա ապահով կողմում եք:

Հղում:


Ինչպես ենթադրում են շատ փաթեթներ, ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան ամենախորը ազդեցությունն ունի տեղումների արդյունավետության/վերականգնման ֆրակցիայի վրա: Ժամանակը, ջերմաստիճանը և տեղումների նյութի կոնցենտրացիան ավելի քիչ ազդեցություն ունեն: Օրինակ՝ տե՛ս Life Technologies-ի ցուցումները LiCl տեղումների վերաբերյալ.

LiCl տեղումների օգտագործումը ՌՆԹ-ի մաքրման համար


MRNA մաքրում (E2065)

Հավաքածուն ներառում է LiCl լուծույթ՝ սինթեզված mRNA-ի արագ վերականգնման համար: ՌՆԹ-ի LiCl նստեցումը արդյունավետ է չներառված NTP-ների և ֆերմենտների մեծամասնությունը հեռացնելու համար: Այնուամենայնիվ, 300 հիմքից կարճ ՌՆԹ-ները կամ 0,1 մգ/մլ-ից ցածր կոնցենտրացիաներում լավ նստվածք չեն ստանում: Նման դեպքերում կարող են օգտագործվել մաքրման այլ մեթոդներ: LiCl մաքրված mRNA-ն հարմար է տրանսֆեկցիոն և միկրոներարկման փորձերի համար:

  1. 20 &միկրոլի արտագրման ռեակցիային ավելացրեք 30 &mul ջուր և 25 &mul LiCl լուծույթ, լավ խառնեք:
  2. Ինկուբացնել &ndash20°C-ում 30 րոպե:
  3. Ցենտրիֆուգեք 4°C-ում 15 րոպե առավելագույն արագությամբ՝ ՌՆԹ-ի կարկուտների համար:
  4. Զգուշորեն հեռացրեք վերին նյութը:
  5. Լվացեք գնդիկը` ավելացնելով 500 մլ սառը 70% էթանոլ և ցենտրիֆուգեք 4°C ջերմաստիճանում 10 րոպե:
  6. Զգուշորեն հեռացրեք էթանոլը: Խողովակը կարճ պտտեք՝ պատի վրայի ցանկացած հեղուկ իջեցնելու համար:
  7. Հեղուկի մնացորդները զգուշորեն հեռացրեք սուր ծայրով (օրինակ՝ բեռնման ծայրով):
  8. Օդով չորացրեք գնդիկը և նորից կասեցրեք mRNA-ն 50 &mul 0,1 մՄ EDTA կամ համապատասխան ՌՆԹ-ի պահպանման լուծույթում:
  9. ՌՆԹ-ն 5-10 րոպե տաքացրեք 65°C ջերմաստիճանում՝ ՌՆԹ-ն ամբողջությամբ լուծարելու համար: Լավ խառնել։
  10. Պահպանեք ՌՆԹ-ն &ndash20°C կամ ցածր ջերմաստիճանում:

Ֆենոլ-քլորոֆորմի արդյունահանում և էթանոլային տեղումներ

Սպիտակուցների և ազատ նուկլեոտիդների մեծ մասի հեռացման համար նախընտրելի մեթոդ է ֆենոլի քլորոֆորմի արդյունահանումը և ՌՆԹ-ի տառադարձումների էթանոլային նստեցումը:

  1. Կարգավորեք ռեակցիայի ծավալը մինչև 180 &mul՝ ավելացնելով նուկլեազազերծ ջուր: Ավելացրեք 20 մլ 3 մ նատրիումի ացետատ, pH 5,2 կամ 20 մլ 5 մ ամոնիումի ացետատ և մանրակրկիտ խառնեք:
  2. Քաղեք հավասար ծավալով 1:1 ֆենոլ:քլորոֆորմ խառնուրդով, որին հաջորդում են քլորոֆորմով երկու արդյունահանում: Հավաքեք ջրային փուլը և տեղափոխեք նոր խողովակ։
  3. ՌՆԹ-ն նստեցրեք՝ ավելացնելով 2 ծավալ էթանոլ: Ինկուբացնել &ndash20°C-ում առնվազն 30 րոպե և հավաքել գնդիկը ցենտրիֆուգման միջոցով:
  4. Հեռացրեք գերնույն նյութը և ողողեք գնդիկը 500 &mul սառույցով 70% էթանոլով:
  5. ՌՆԹ-ն նորից կասեցրեք 50 &mul 0,1 մՄ EDTA-ում: Պահպանեք ՌՆԹ-ն &ndash20°C կամ ցածր ջերմաստիճանում:

Կրկնակի ձգտում

Կրկնակի ասպիրացիա օգտակար է տեղումներից հետո EtOH գերնույն նյութի վերջին հետքերը հեռացնելու համար: Այն ներառում է երկրորդ արագ պտտում և ձգտում՝ ապահովելու համար տեղումների ցանկացած վերին նյութի հեռացում, օրինակ. խողովակի պատերին, ինչը կարող է խանգարել արձանագրության ներքևի քայլերին: Մենք այն խորհուրդ ենք տալիս Ambion-ի RPA III™ արձանագրության մեջ և ՌՆԹ-ի զոնդի ձևանմուշ պատրաստելու համար:

  • Տեղումները գնդիկավորելուց հետո տեղումների վերին նյութը ներծծեք նուկլեինաթթվի գնդիկից: Անմիջապես կատարեք 1-2 վայրկյան արագ ցենտրիֆուգացիա և նորից ասպիրացիա կատարեք:


Ասպիրացիան կարող է իրականացվել ներարկիչի ասեղով կամ ձգված Pasteur պիպետտի միջոցով, որը միացված է թակարդով վակուումային աղբյուրին: Որպես այլընտրանք, պիպետի լամպի հետ կարելի է օգտագործել Պաստերի ձգված պիպետտը: Պաստերի ձգված պիպետներ պատրաստելու համար պիպետտի ծայրը կրակով փափկացրեք և ծայրը աքցանով դուրս հանեք, ծայրը կոտրեք ամենանեղ կետում և, անհրաժեշտության դեպքում, փայլեցրեք կրակով:


Փորձարարական ընթացակարգեր

Տեսական նախապատմություն

ՌՆԹ-ի արդյունահանման ընթացքում RNase-ներով աղտոտման աղբյուրը կարող է լինել էկզոգեն կամ էնդոգեն 5-7: Էկզոգեն աղբյուրները ներառում են ռեակտիվներ, ապակյա իրեր և պլաստմասե իրեր, որոնք օգտագործվում են ՌՆԹ-ի մեկուսացման մեջ, հատկապես հետազոտողի մաշկը: Այնուամենայնիվ, այս RNase-ները կարող են վերացվել խելամիտ միջոցների միջոցով, ինչպիսիք են ռեակտիվների և պլաստիկ պարագաների մշակումը դիէթիլ պիրոկարբոնատով (DEPC)՝ թխելով ապակյա սպասքը, հավանգը և տորթը և կրել միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ ողջ ընթացակարգի ընթացքում: Այնուամենայնիվ, էնդոգեն RNase-ները բնածին են կենսաբանական հյուսվածքների համար և սովորաբար մեկուսացված են օրգանելներում և վակուոլներում: Նրանք խիստ կարգավորվում են անձեռնմխելի բջիջներում, և կարգավորող մեխանիզմները ոչնչացվում են, երբ օրգանելներն ու վակուոլները խաթարվում են բջիջների լիզի ընթացքում, ինչը կարող է հանգեցնել ՌՆԹ-ի արագ քայքայման 5: Հետևաբար, ինչպես արագ և ամբողջությամբ ապաակտիվացնել ազատված էնդոգեն RNase-ները բարձրորակ ՌՆԹ-ի հաջող մաքրման բանալին է: Ցույց է տրվել, որ գուանիդինի աղերը հանդիսանում են RNase 5, 7-ի հզոր արգելակիչներ, և գուանիդինիումի աղի վրա հիմնված բազմաթիվ մեթոդներ ստեղծվել են ՌՆԹ-ի մեկուսացման համար: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդների համար դեռևս կան որոշ թերություններ, ինչպիսիք են ՌՆԹ-ի կորուստը կամ մասնատումը օրգանական արդյունահանման ժամանակ, գուանիդինի աղի մնացորդի կողմից ներքևում գտնվող ֆերմենտային ռեակցիաների միջամտությունը և փորձի ավելի բարձր արժեքը՝ գուանիդինիումի աղերի ավելի բարձր կոնցենտրացիայի օգտագործման պատճառով: RNases 7. Նախկինում հաղորդված մեր ՌՆԹ-ի մեկուսացման մեթոդում 6, մենք փորձեցինք արագ և ամբողջությամբ ապաակտիվացնել էնդոգեն RNase-ները, որոնք թողարկվել են բջիջների լիզի ընթացքում, ինչպես նաև հաղթահարել գուանիդինիումի աղի վրա հիմնված մեթոդների որոշ թերություններ: Մեր միջոցառումները ներառում էին արդյունահանման բուֆերի կազմի փոփոխություն. արդյունահանման բուֆերի pH-ը չի ճշգրտվել HCl-ով, իսկ վերջնական pH-ը, ներառյալ 0,2 մ Տրիսը, մեր համակարգում 9,0 է: Այս pH-ը կարող է զգալիորեն նվազեցնել RNase-ի ակտիվությունը, քանի որ ակտիվության միայն 15%-ից պակաս է մնում, երբ pH-ը 9.0-ից բարձր է՝ համեմատած ջրի մոտ 7.2 pH-ի առավելագույն ակտիվության հետ 10: Բացի այդ, MgCl2 և սախարոզը ներառվել են արդյունահանման բուֆերի մեջ: The MgCl2 ավելացվել է, քանի որ Mg 2+-ն անհրաժեշտ է ՌՆԹ 11-ում շատ երկրորդական և երրորդական կառույցներ կայունացնելու համար, իսկ սախարոզը ավելացվել է լուծույթի համար համապատասխան օսմոտիկ ճնշումը պահպանելու համար: Հակառակ դեպքում հիպոտոնիկ լուծույթում ՌՆԹ-ի մասնատումը կարող է տեղի ունենալ պայթուցիկ բջիջների լիզի վրա ՌՆԹ-ների վրա օսմոտիկ ճնշման ներթափանցման միջոցով: Ավելին, Տրիս-հագեցած ֆենոլն անմիջապես ավելացվել է հեղուկ ազոտով աղացած հյուսվածքի փոշիների մեջ՝ ազատված էնդոգեն RNase-ներն ապաակտիվացնելու համար: Հետևյալ օրգանական արդյունահանման ընթացքում ընդունվել է պտտումը՝ սպիտակուցի դենատուրացիայի ազդեցությունը ուժեղացնելու համար: MgCl-ի ներառումը2 և սախարոզը արդյունահանման բուֆերում կարող են նաև խուսափել ՌՆԹ-ների մասնատման հնարավոր սպառնալիքից, հատկապես բարձր մոլեկուլային քաշ ունեցողների պտտման միջոցով: Մեկուսացման ամբողջ ընթացքում պատահաբար ներմուծված RNase-ի ակտիվությունը նվազեցնելու համար ՌՆԹ պատրաստման համար օգտագործվող բոլոր ռեակտիվները սառը էին, խողովակները նախապես սառեցվեցին, և նմուշները միշտ պահվեցին սառույցի վրա, բացառությամբ նուկլեինաթթվի նստվածքները օդով չորացնելու փուլերից հետո: ցենտրիֆուգացիա 5.

Նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիան սովորաբար վերջին քայլն է ՌՆԹ-ի մաքրման արձանագրությունների մեծ մասում: Սովորաբար, ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան ձեռք է բերվում տեղումների միջոցով՝ նատրիումի իոնների և էթանոլի առկայության դեպքում: Այնուամենայնիվ, ի տարբերություն գենոմային ԴՆԹ-ի կտրուկ տեղումների, ՌՆԹ-ի տեղումների համար հաճախ պահանջվում են ավելի երկար ինկուբացիոն ժամանակաշրջաններ -20 °C ջերմաստիճանում՝ ամբողջական վերականգնումն ապահովելու համար 5: Մեր սկզբնական արձանագրության մեջ նուկլեինաթթվի վերականգնումը ձեռք է բերվել էթանոլի տեղումների միջոցով −20 °C 3 ժամվա ընթացքում և ներառում է էթանոլի նստեցման երկու փուլ, որոնցից մեկը նստեցնում է նուկլեինաթթուները՝ ներառյալ ՌՆԹ-ն և ԴՆԹ-ն, իսկ մյուսը՝ ընտրովի նստեցնում է ՌՆԹ 6: . Մեկուսացման ամբողջ պրոցեդուրան տևեց մոտավորապես 8 ժամ և բաժանվեց երեք նիստերի երկու ավելի երկար էթանոլային տեղումներով, ինչը մեթոդը դարձնում է ոչ պիտանի ժամանակով սահմանափակ բակալավրիատի փորձարարական դասընթացի համար: Կան ապացույցներ, որոնք ցույց են տալիս, որ էթանոլային տեղումների միջոցով նուկլեինաթթուների վերականգնումն էականորեն ուժեղանում է ոչ թե երկար կամ ցածր ջերմաստիճանի ինկուբացիայի, այլ ավելի երկար ցենտրիֆուգման ժամանակով 9: Հետևաբար, ցածր ջերմաստիճանի ավելի երկար ինկուբացիան (3 ժամ −20 °C-ում) փոխարինվեց ինկուբացիայով 0 °C-ում 10 րոպե, իսկ էթանոլային տեղումներից հետո ցենտրիֆուգման ժամանակը սահմանվեց մինչև 15 րոպե՝ լավ վերականգնման հասնելու համար: Արդյունքում, մեկուսացման ընթացակարգի տևողությունը զգալիորեն կրճատվեց (2,5 ժամում, մեր սկզբնական մեթոդի 8 ժամի համեմատ), մինչդեռ ՌՆԹ-ի վերականգնումը համեմատելի էր մեր սկզբնական մեթոդի հետ (տվյալները ցույց չեն տրվում):

Քանի որ ներքևում գտնվող ՌՆԹ-ի վրա հիմնված բազմաթիվ կիրառությունների հաջողությունը հիմնված է բարձրորակ ՌՆԹ-ի ստացման վրա, անհրաժեշտ է գնահատել մաքրված ՌՆԹ-ի որակը նախքան ներքևի հոսքի անալիզներ անցկացնելը: Ուստի ՌՆԹ-ի նմուշների քանակը, մաքրությունը և ամբողջականությունը պետք է ստուգվեն համապատասխան մեթոդներով: ՌՆԹ-ն առավելագույն կլանում է 260 նմ-ում, և ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան կարող է քանակականորեն որոշվել սպեկտրոֆոտոմետրիկ կերպով՝ 1-ի հարաբերակցությամբ: Ա260 = 40 մկգ ՌՆԹ մլ -1: Աղտոտված սպիտակուցները և պոլիսաքարիդները/պոլիֆենոլները ունեն առավելագույն կլանման արժեքներ համապատասխանաբար 280 և 230 նմ, ուստի հարաբերակցությունը Ա260/Ա280 և Ա260/Ա230 կարող է օգտագործվել որպես այդ աղտոտիչների ցուցումներ: Բացի այդ, այս աղտոտիչները կարող են հանգեցնել շեղումների ստանդարտ կլանման սպեկտրից մաքուր ՌՆԹ-ի նմուշների ուլտրամանուշակագույն կլանման բնորոշ պրոֆիլով, որը չի կարող դիտվել միայն վերը նշված երեք ալիքի երկարություններում ներծծման չափման ժամանակ: Հետևաբար, բացի կլանման գործակիցներից, 220-ից մինչև 350 նմ մաքրված ՌՆԹ-ի ուլտրամանուշակագույն կլանման սպեկտրի վերլուծությունը ներդրվել է ՌՆԹ-ի մաքրությունը գնահատելու համար: ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը ստուգելու համար տիպիկ մեթոդը չափերով առանձնացված ՌՆԹ ժապավենների ժապավենային պրոֆիլը ագարոզայի գելի միջոցով դենատուրացնող պայմաններում պատկերացնելն է: Այնուամենայնիվ, դա ժամանակատար գործընթաց է բարդ ընթացակարգի պատճառով, և ՌՆԹ-ի շերտերի վիզուալացումը հնարավոր չէ իրականացնել նաև էլեկտրոֆորեզից անմիջապես հետո8: Ստանդարտ ագարոզայի գելը, թեև այն ունի ավելի ցածր խտություն երկրորդական և երրորդական կառուցվածքներով հարուստ չդենատուրացված ՌՆԹ-ների համար, ունի այն առավելությունները, որ հեշտ է լրացվում և կարող է պատկերացնել ՌՆԹ-ն էլեկտրոֆորեզից անմիջապես հետո՝ գելի մեջ ներառելով էթիդիումի բրոմիդը (EtBr): Հետևաբար, այս զեկույցում ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը ստուգելու համար օգտագործվել է չդենատուրացված ՌՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզը ստանդարտ ագարոզայի գելի միջոցով: Այնուամենայնիվ, պետք է նշել, որ ընդհանուր ՌՆԹ-ի տարանջատման լավագույն արդյունքը չդենատուրացնող պայմաններում կարելի է ձեռք բերել միայն ավելի ցածր քանակությամբ ՌՆԹ-ի նմուշներ (սովորաբար 5 մկգ-ից պակաս) ագարոզայի գելի ավելի բարձր կոնցենտրացիայի միջոցով (սովորաբար 1,5%):

Պայմանավորվածություն

Աշակերտները լաբորատորիայում աշխատում էին զույգերով: ՌՆազազերծ բուժումն իրականացվել է փորձից առաջ առանձին ուսանողների կողմից: Մոտավորապես 1 ժամ նախալաբորատոր դասախոսություն և քննարկում, որը կենտրոնացած էր ՌՆԹ-ի հետ աշխատելու հատուկ նախազգուշական միջոցների վրա, և սկզբնական արձանագրության ստեղծման հիմնավորումը և այս զեկույցում օգտագործված ՌՆԹ-ի մեկուսացման և ՌՆԹ-ի որակի վերահսկման վերլուծության մեթոդների համար կատարված փոփոխությունները տրամադրվել են և հետևվել է. 4 ժամ գործնական լաբորատոր վարժություն: Ամբողջ պրոցեդուրան կարելի է նաև բաժանել ՌՆԹ-ի մեկուսացման և ՌՆԹ-ի որակի վերահսկման վերլուծության երկու նիստերի:

Նյութեր և լուծումներ

Փորձի համար պահանջվում է հետևյալ սարքավորումները՝ հավանգ և խրճիթ, չժանգոտվող լաբորատոր սպաթուլաներ, 50 մլ ցենտրիֆուգային խողովակներ, պիպետներ, պտտահողմ, միանգամյա օգտագործման ծայրեր և ձեռնոցներ, ցենտրիֆուգ (Thermo Fisher Scientific, Am Kalkberg, Գերմանիա, Sorvall ST 16R), 1,5 մլ: Էպենդորֆյան խողովակներ, ցածր ծավալի սպեկտրոֆոտոմետր (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, Nanodrop 2000c), սուզանավերի էլեկտրոֆորեզի սարքեր (Bio-Rad, Hercules, CA, Sub Cell GT) և գելային պատկերման համակարգ (Bio-Rad, Hercules, CA, Gel): Doc XR համակարգ): ՌՆազազերծ մշակումն իրականացվել է հետևյալ կերպ. բոլոր խողովակները և ծայրերը ներծծվել են 0,1% DEPC-ում գիշերը 37 °C-ում, այնուհետև ավտոկլավացվել են 121 °C-ում 20 րոպե: Շաղախներն ու նժույգները, ինչպես նաև չժանգոտվող լաբորատոր սպաթուլաները թխվել են 180 °C ջերմաստիճանում 12 ժամ:

ՌՆԹ-ի մեկուսացման համար պահանջվել են հետևյալ ռեագենտները՝ ՌՆԹ-ի արդյունահանման բուֆեր (0,2 մ Տրիս, 0,4 մ KCl, 0,2 մ սախարոզա, 35 մ մ MgCl2, 25 մմ EGTA), տրիս-հագեցած ֆենոլ (pH 8.0), քլորոֆորմ/իզոամիլ սպիրտ (24:1, վ/վ), 3 մ NaAc (pH 5.2), 3 մ NaAc (pH 5.6), 0.3 մ NaAc (pH): 5.6), և DEPC-ով մշակված ջուր: NaAc լուծույթները և DEPC-ով մշակված ջուրը պատրաստվել են NaAc լուծույթները և ջուրը 0.1% DEPC-ով մշակելով գիշերը 37 °C-ում, այնուհետև ավտոկլավացվել 121 °C-ում 20 րոպե: ՌՆԹ-ի արդյունահանման բուֆերը պատրաստվել է DEPC-ով մշակված ջրով:

ՌՆԹ-ի վերլուծության համար անհրաժեշտ էին հետևյալ ռեակտիվները՝ ագարոզա, 1 × TAE, 10 × ՌՆԹ բեռնող բուֆեր (1 մ մ EDTA, 0,25% բրոմֆենոլ կապույտ, 0,25% քսիլեն ցիանոլ, 50% գլիցերին) և 10 մգ/մլ EtBr։ ՌՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզի լուծույթները չեն կիրառվել առանց RNase-ի բուժման, քանի որ RNase և RNA ժապավենները տարբեր շարժունակություն ունեն ագարոզայի գելերում, ինչը նշանակում է, որ դրանք կարող են առանձնացվել էլեկտրական դաշտի կիրառումից հետո:

Բջիջների լիզիս, նուկլեոպրոտեինների դիսոցացիա, սպիտակուցների դենատուրացիա և հեռացում

Հետևյալ ընթացակարգը կարող է կիրառվել խոտաբույսերի բույսերի հյուսվածքների լայն տեսականիով. Բուսական հյուսվածքների համար, որոնք հարուստ են պոլիսախարիդներով և/կամ պոլիֆենոլներով, պետք է ընդունվեն հատուկ մաքրման արձանագրություններ, ինչպես օրինակ՝ փոփոխված ցետիլտրիմեթիլամոնիումի բրոմիդի մեթոդը 12:

Հավաքեք 1 գ չինական սպիտակ կաղամբ (Brassica campestris L. ssp. chinensis Մակինո [var. communis Tsen et Lee]) տերեւները եւ մանրացնել դրանք հեղուկ ազոտի մեջ նախապես սառեցրած շաղախի մեջ մինչեւ նուրբ փոշի: Թույլ մի տվեք, որ հյուսվածքը հալվի և անմիջապես տեղափոխեք փոշին 50 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, անմիջապես ավելացրեք 2 մլ տրիս-հագեցած ֆենոլ (pH 8.0), ապա 4 մլ արդյունահանման բուֆեր և 2 մլ քլորոֆորմ/իզոամիլ սպիրտ (24: 1, v/v) հաջորդաբար (նախ պետք է ավելացվի ֆենոլը, որպեսզի ստեղծվի դենատուրացիոն միջավայր էնդոգեն RNase-ների մեջ, որոնք պետք է արտազատվեն): Խողովակը պտտվում է մինչև ամբողջական էմուլսիա ձևավորվի: Ցենտրիֆուգ՝ 8000 × է 5 րոպե 4 °C ջերմաստիճանում: Զգուշորեն տեղափոխեք ջրային փուլը մեկ այլ 50 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, այնուհետև ավելացրեք 2 մլ ֆենոլ և 2 մլ քլորոֆորմ/իզոամիլ սպիրտ (24:1, վ/վ), ուժեղ խառնեք և ցենտրիֆուգեք 8000 × × է 5 րոպե 4 °C ջերմաստիճանում: Վերցրեք վերին փուլը և ավելացրեք 4 մլ քլորոֆորմ/իզոամիլ սպիրտ (24:1, վ/վ), ապա խառնեք և ցենտրիֆուգեք նմուշը նախկինի պես: Վերին փուլը տեղափոխեք 50 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և գրանցեք փոխանցված ծավալը:

Ընտրովի ՌՆԹ տեղումներ

Էթանոլի և NaAc-ի համակցությունները (pH 5.6) օգտագործվել են ՌՆԹ-ն ընտրողաբար նստեցնելու համար: Նախ, փոխանցված ջրային փուլին ավելացրեք 0,1 ծավալ NaAc (pH 5,2) և 2,2 ծավալ էթանոլ, որը նախապես սառեցվել է −20 °C-ում և խառնել այն մի քանի անգամ շրջելով: Խողովակները 10 րոպե մանրացված սառույցի մեջ դնելուց հետո ցենտրիֆուգեք դրանք 15000 × է 15 րոպե 4 °C ջերմաստիճանում: Նուկլեինաթթուները պտտվել են ցենտրիֆուգային խողովակի պատի վրա: Ցենտրիֆուգումից հետո հեղուկը թափեք և խողովակի արտաքին պատին նշեք նուկլեինաթթվի նստվածքների տեղը: Շրջեք խողովակը և դրեք այն լցնող թղթի վրա, որպեսզի այն չորանա օդով, որպեսզի մնացորդային էթանոլը հեռացվի: Նուկլեինաթթուների նստվածքները 1 մլ 3 մ NaAc-ով (pH 5,6) նորից կասեցրեք պիպետտի միջոցով, այնուհետև նորից կասեցված նուկլեինաթթուն տեղափոխեք 1,5 մլ եփենդորֆյան խողովակի մեջ: Ցենտրիֆուգեք խողովակը 15000 × է 10 րոպե 4 °C-ում, զգուշորեն թափեք և դեն նետեք վերին նյութը, խողովակը շրջված դրեք ֆիլտրի թղթի վրա, որպեսզի օդով չորանա նուկլեինաթթուները: Վերլուծեք նստվածքը 400 μL 0,3 մ NaAc-ում (pH 5,6) և ավելացրեք 1 մլ էթանոլ՝ նախապես սառեցված -20 °C-ում, մի քանի անգամ խառնեք խողովակը շրջելով, 10 րոպե տեղադրեք մանրացված սառույցի մեջ, ապա ցենտրիֆուգեք խողովակը: 15000 × է 15 րոպե 4 °C ջերմաստիճանում: ՌՆԹ-ի գնդիկը երկու անգամ լվացեք 200 մկլ 70% էթանոլով, այնուհետև չորացրեք օդով և լուծեք գնդիկը 50 մկլ DEPC-ով մշակված ջրի մեջ:

ՌՆԹ-ի որակի գնահատում սպեկտրոֆոտոմետրով

ՌՆԹ-ն վերլուծվել է NanoDrop 2000c սպեկտրոֆոտոմետրի վրա՝ ըստ արտադրողի ցուցումների: Ստացվել է կլանման սպեկտր 220-ից մինչև 350 նմ, ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան հաշվարկվել է 1 հավասարմամբ: Ա260 = 40 մկգ ՌՆԹ մլ −1, և հարաբերակցությունները Ա260/Ա280 և Ա260/Ա230 հաշվարկվել են արդյունահանված ՌՆԹ-ի նմուշների մաքրությունը գնահատելու համար:

Ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ

10 μL ՌՆԹ-ի նմուշները նոսրացրեք մինչև 1 մկգ/մլ DEPC-ով մշակված ջրով, ըստ քանակական արդյունքների, 0,5, 1, 2 և 4 մկգ ՌՆԹ-ի չափաբաժինները հանվեցին և ճշգրտվեցին մինչև 9 մկլ DEPC-ով մշակված ջրով, այնուհետև 1: Ավելացվել է μL 10 × ՌՆԹ բեռնող բուֆեր: Նմուշները խառնելուց հետո բոլոր բաժինները բեռնվեցին 1,5% TAE ագարոզայի գելի վրա, որը պարունակում էր 0,5 մկգ/մլ EtBr: Էլեկտրոֆորեզն իրականացվել է 1 × TAE-ով 5 Վ/սմ արագությամբ, մինչև ներկի ճակատը ներգաղթել է գելի ներքև ճանապարհի երկու երրորդը: Գելը լուսանկարվել է Gel Doc XR համակարգով (Bio-Rad):

Ուսանողների ուսուցման գնահատում

Փորձարարական վարժություններից ուսանողի սովորածը գնահատելու համար կիրառվել է երեք մեթոդ՝ լաբորատոր հաշվետվություններ փորձից հետո, լաբորատոր ներկայացում հաջորդ փորձարարական դասի սկզբում և կարճ ամփոփում փորձարարական ամբողջ դասընթացից հետո: Իրենց լաբորատոր զեկույցներում ուսանողներից պահանջվում էր նշել փորձի նպատակն ու սկզբունքները, հակիրճ նշել ստացված արդյունքները, ներառյալ մկգ ՌՆԹ/գ տերևների թարմ քաշը, OD-ի հարաբերակցությունը:260/ՕԴ280 և ՕԴ260/ՕԴ230և չդենատուրացված ՌՆԹ-ների էլեկտրոֆորեզի արդյունքները ստանդարտ ագարոզայի գելում պատկերված պատկերում, ինչպես նաև նշեք արձանագրության նախագծման և փորձարարական գործողության բանալին, հատկապես, թե ինչպես կանխել RNase-ով աղտոտումը, և նշեք, թե ինչ եզրակացություններ կարող են անել՝ հիմնվելով. նրանց տվյալները։ Բացի այդ, պատահականության սկզբունքով ընտրվեցին 15 խմբերից վեց խմբեր, որոնք ներկայացրեցին իրենց արդյունքների և փորձի մասին ամբողջ դասարանի առջև: Այսպիսով, բոլոր խմբերը կարող էին փոխադարձաբար համեմատել իրենց արդյունքները և, անհրաժեշտության դեպքում, քննարկել իրենց փորձարարական փորձը: Իրենց ամփոփագրում նրանք պետք է թվարկեն այն, ինչ սովորել են, ներառյալ փորձարարական հմտությունների ըմբռնումը և հիմնարար հասկացությունների ամրապնդումը:

Վտանգներ

Բույսերի հյուսվածքները սառեցնելու համար օգտագործվող հեղուկ ազոտը պետք է զգույշ վարվի: Ֆենոլը և քլորոֆորմը կարող են հեշտությամբ գոլորշիանալ նույնիսկ սենյակային ջերմաստիճանում, և այս երկու ռեակտիվները, ինչպես նաև դրանց գոլորշիները քայքայիչ են աչքերի, մաշկի և շնչառական ուղիների համար: EtBr-ը մուտագեն է և պետք է օգտագործվի զգուշությամբ: Ֆենոլը, քլորոֆորմը և DEPC-ն քաղցկեղածին են և պետք է դրանց հետ վարվել ծայրահեղ զգուշությամբ: Ուսանողներից պահանջվում էր լաբորատորիայում կրել լաբորատոր վերարկուներ և փակ կոշիկներ, ինչպես նաև մեկանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ ամբողջ ընթացակարգի ընթացքում:


PrimerDigital

Պրոցեդուրան հարմար է կենդանական (և արյան) և բույսերի տեսակների բոլոր տեսակի հյուսվածքների համար: Բոլոր քայլերը կատարվում են սենյակային ջերմաստիճանում (RT) (առանց սառույցի) և առանց DEPC-ով մշակված ջրի: ՌՆԹ նստվածք լիթիումի քլորիդով (LiCl)՝ ՌՆԹ պատրաստման կայունության բարձրացման և cDNA սինթեզի բարելավման համար: Հետևյալ արձանագրությունը նախատեսված է հյուսվածքների փոքր և մեծ նմուշների համար (հյուսվածքի ծավալը 10-200 մկլ), որոնք սովորաբար տալիս են մոտ 10-500 &մուգ ընդհանուր ՌՆԹ:

Ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման նյութեր

    (40% w/w ֆենոլ (հագեցած pH 4.3), 1 M գուանիդին թիոցիանատ, 1 M ամոնիումի թիոցիանատ, 0.1 M նատրիումի ացետատի բուֆեր (pH 5.0), 5% w/w գլիցերին)
  • Քլորոֆորմ-իզոամիլ սպիրտ խառնուրդ (24:1)
  • 100% իզոպրոպանոլ (իզոպրոպիլ սպիրտ, 2-պրոպանոլ)
  • 70% էթանոլ
  • 10 M LiCl
  • Թարմ Milli-Q ջուր (կամ Milli-Q գերմաքուր BioPak ջուր) կամ ավտոկլավացված 1xTE (0.1 մՄ EDTA, 10 մՄ Տրիս-HCl, pH 7.0): Երբ ուլտրաֆիլտրացիոն քարթրիջը (BioPak) օգտագործվում է օգտագործման կետում, ջուրը հարմար է գենոմիկայի կիրառությունների (որակը առնվազն համարժեք DEPC-ով մշակված ջրին) և բջիջների կուլտուրաների համար:
  1. 2 մլ Eppendorf Safe-Lock միկրոցենտրիֆուգային խողովակ հյուսվածքի նմուշով և ապակե գնդիկով սառեցրեք -80°C ջերմաստիճանում, մանրացրեք MM300 խառնիչի ջրաղացում 2 րոպե 30 Հց հաճախականությամբ:
  2. 2 մլ խողովակի մեջ մեխանիկորեն խաթարված հյուսվածքի նմուշով ավելացրեք թարմ 1 մլ ՏՐԻզոլ Ռեակտիվը, շատ լավ պտտեցնել և նմուշը ինկուբացնել 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում:
  3. 1 մլ-ին ավելացրեք 0,2 մլ քլորոֆորմ ՏՐԻզոլ Ռեակտիվ, որն օգտագործվում է համասեռացման համար: Շատ լավ պտտեցրեք, և նմուշը 3 րոպե ինկուբացրեք սենյակային ջերմաստիճանում:
  4. Նմուշները ցենտրիֆուգեք առավելագույն արագությամբ սեղանի միկրոցենտրիֆուգի վրա 5 րոպե +4°C-ում:
  5. Ջրային փուլը տեղափոխել թարմ միկրոցենտրիֆուգային 2 մլ խողովակի մեջ՝ հավասար ծավալով քլորոֆորմով, լավ պտտեցնել։ Պտտեք առավելագույն արագությամբ սեղանի միկրոցենտրիֆուգի վրա 5 րոպե:
  6. Ջրային փուլը տեղափոխեք թարմ միկրոցենտրիֆուգային 2 մլ 2-պրոպանոլի հավասար ծավալով խողովակի մեջ, լավ պտտեք: Պտտեք առավելագույն արագությամբ սեղանի միկրոցենտրիֆուգի վրա սենյակային ջերմաստիճանում 10 րոպե +4°C-ում: Գնդիկը մեկ անգամ լվանալ 1,5 մլ 70% էթանոլով։ Պտտեք առավելագույն արագությամբ սեղանի միկրոցենտրիֆուգի վրա 5 րոպե:
  7. Գնդիկը լուծեք (չչորացրեք) 400 μl 1xTE-ի մեջ 55°С մոտ 10 րոպե, հորձանուտով։ Ավելացրեք հավասար ծավալ 10 մ LiCl և լուծույթը սառեցրեք -20°C ջերմաստիճանում մի քանի ժամով (գիշերում): Պտտեք առավելագույն արագությամբ սեղանի միկրոցենտրիֆուգի վրա 10 րոպե +4°C-ում: Զգուշորեն հեռացրեք և դեն նետեք (կամ պահպանեք, Նկար 1) վերին նյութը (պարունակում է փոքր ՌՆԹ < 200 նտ և ԴՆԹ): Գնդիկը լվացեք 1,5 մլ 70% էթանոլով, լավ պտտեք, միկրոցենտրիֆուգեք, դեն նետեք էթանոլը, գնդիկը մի չորացրեք։ Գնդիկը լուծեք 200-400 մկլ թարմ միլիQ ջրի մեջ (BioPak) կամ 1xTE:

Նշումներ

    Տարածված կարծիք կա, որ ՌՆԹ-ն շատ անկայուն է, և, հետևաբար, դրա հետ աշխատելու բոլոր ռեակտիվները և նյութերը պետք է հատուկ մշակվեն՝ հեռացնելու ՌՆԹ-ի հնարավոր ակտիվությունը: Մենք պարզել ենք, որ մաքրված ՌՆԹ-ն բավականին կայուն է և, ճակատագրի հեգնանքով, հակաՌՆԹ-ի չափից շատ բուժումը կարող է խնդիրների աղբյուր դառնալ: Սա հատկապես վերաբերում է ջրային լուծույթների DEPC մշակմանը, ինչը հաճախ հանգեցնում է ՌՆԹ պատրաստուկների, որոնք շատ կայուն են, բայց բոլորովին ոչ պիտանի cDNA սինթեզի համար: Մենք պարզել ենք, որ պարզ նախազգուշական միջոցներ, ինչպիսիք են՝ ձեռնոցներ կրելը (միայն քիմիական նյութերից պաշտպանվելու համար), բաց խողովակների վրայից խոսելուց խուսափելը, աերոզոլային արգելքի խորհուրդների օգտագործումը և թարմ 1xTE (կամ 1xTHE) լուծույթի օգտագործումը (կամ Milli-Q գերմաքուր BioPak ջուր) բոլոր լուծումները բավարար են կայուն ՌՆԹ պատրաստուկներ ստանալու համար:
    Երբ ուլտրաֆիլտրացիոն քարթրիջը (BioPak) օգտագործվում է օգտագործման կետում, ջուրը հարմար է գենոմիկայի կիրառման համար (որակը առնվազն համարժեք է DEPC-ով մշակված ջրին) և բջիջների կուլտուրաների համար: BioPak փամփուշտները վավերացվել են Millipore լաբորատորիաներում, որպեսզի երաշխավորեն պիրոգենից զերծ (0,001 Eu/ml-ից պակաս), RNAse-ից (0,01 նգ/մլ-ից պակաս) և DNase-ից (4 pg/μl-ից պակաս) գերմաքուր արտադրությունը: ջուրը, միաժամանակ պահպանելով մաքրված ջրի և՛ դիմադրողականությունը, և՛ ընդհանուր օրգանական ածխածինը (TOC), այն փոխարինում է երկարատև դիէթիլպիրոկարբոնատով (DEPC) մաքրման գործընթացին՝ մաքրված ջրից նուկլեազները հեռացնելու համար:
    Բոլոր օրգանական հեղուկները (ֆենոլ, քլորոֆորմ և էթանոլ) ըստ սահմանման կարելի է համարել էապես առանց ՌՆԹազի, ինչպես նաև գուանիդին թիոցիանատ պարունակող դիսպերսիոն բուֆերը: Հյուսվածքի ծավալը չպետք է գերազանցի արդյունահանման բուֆերային ծավալի 1/5-ը: ՌՆԹ-ի քայքայումից խուսափելու համար հյուսվածքների ցրումը պետք է իրականացվի հնարավորինս արագ և ամբողջությամբ՝ ապահովելով, որ բջիջներն ինքնուրույն դանդաղ չմեռնեն: Հյուսվածքի մի կտորը պատշաճ կերպով ցրելու համար սովորաբար տևում է 2-3 րոպե տրորել՝ օգտագործելով պիպետ՝ ամեն անգամ ծայրի մեջ վերցնելով բուֆերի ամբողջ կամ գրեթե ամբողջ ծավալը: Լուծվող կտորը պետք է բարձրանա և իջնի ծայրով, ուստի երբեմն օգտակար է ծայրը կտրել՝ ավելի մեծ հյուսվածքների համար բացվածքի տրամագիծը մեծացնելու համար: Հյուսվածքների ցրումը կարող է իրականացվել սենյակային ջերմաստիճանում: Հյուսվածքը, որը ցրված է արդյունահանման բուֆերի մեջ, առաջացնում է բարձր մածուցիկ լուծույթ: Մածուցիկությունը սովորաբար պայմանավորված է գենոմային ԴՆԹ-ով: Սա սովորաբար որևէ ազդեցություն չի ունենում ՌՆԹ-ի մեկուսացման վրա (բացառությամբ ֆենոլ-քլորոֆորմի արդյունահանման փուլերում պտտվելու ավելի երկար ժամանակաշրջանների թելադրման), բացառությամբ այն դեպքերի, երբ լուծված հյուսվածքի քանակն իսկապես չափազանց մեծ է եղել: ՌՆԹ-ի քայքայումը կարելի է գնահատել՝ օգտագործելով չդենատուրացնող էլեկտրոֆորեզ: ՌՆԹ-ի քայքայման առաջին նշանը չդենատուրացնող գելի վրա թեթև քսումն է, որը սկսվում է rRNA շերտերից և տարածվում ավելի կարճ բեկորների տարածքով: ՌՆԹ-ն, որը ցույց է տալիս դեգրադացիայի այս աստիճանը, դեռ լավ է հետագա ընթացակարգերի համար: Այնուամենայնիվ, եթե ներքև քսումն այնքան ընդգծված է, որ rRNA շերտերը չունեն նկատելի ստորին եզր, ՌՆԹ պատրաստուկը պետք է դեն նետվի: ՌՆԹ-ի քանակը կարելի է մոտավորապես գնահատել գելում էթիդիումի բրոմիդի կողմից rRNA-ի ներկման ինտենսիվությունից՝ ենթադրելով, որ ներկի ներդրման արդյունավետությունը նույնն է, ինչ ԴՆԹ-ի համար (ռիբոսոմային ՌՆԹ-ն կարող է համարվել երկշղթա մոլեկուլ՝ իր ընդարձակության պատճառով։ երկրորդական կառուցվածք): Ողնաշարավորների rRNA-ի կանոնը, որ անձեռնմխելի ընդհանուր ՌՆԹ-ում վերին (28S) rRNA գոտին պետք է երկու անգամ ավելի ինտենսիվ լինի, քան ստորին (18S) գոտին, չի կիրառվում անողնաշարավորների համար: Ճնշող մեծամասնությունն ունի 28S rRNA՝ այսպես կոչված «թաքնված ընդմիջումով»։ Դա իրականում իսկական ընդմիջում է հենց 28S rRNA մոլեկուլի մեջտեղում, որը կոչվում է թաքնված, քանի որ չդենատուրացնող պայմաններում rRNA մոլեկուլը պահվում է մի կտորով իր երկրորդական կառուցվածքի տարրերի միջև ջրածնային կապով: Երկու կեսերը, եթե դրանք բաժանվեն, յուրաքանչյուրն էլեկտրաֆորետիկ շարժունակությամբ համարժեք են 18S rRNA-ին: Որոշ օրգանիզմներում կիսատների միջև փոխազդեցությունը բավականին թույլ է, ուստի ընդհանուր ՌՆԹ-ի պատրաստումը ցուցադրում է 18S-ի նմանվող rRNA ժապավեն նույնիսկ չդենատուրացնող գելի վրա: Մյուսների մոտ 28S rRNA-ն ավելի ամուր է, ուստի այն դեռ տեսանելի է որպես երկրորդ գոտի, բայց հազվադեպ է ունենում երկու անգամ ավելի ցածր ինտենսիվություն:

Արձանագրություններ

Հեղինակային իրավունք

Դուք իրավասու եք դիտելու նյութերը այս կայքում միայն ձեր ներքին տեղեկատվական նպատակների համար, պայմանով, որ դուք.
(i) պահպանել բնօրինակ նյութերում պարունակվող բոլոր ծանուցումները
(ii) օգտագործել միայն պատկերներ շրջապատող տեքստով, որոնք վերաբերում են պատկերներին
և (iii) ներառել հեղինակային իրավունքի մասին հետևյալ ծանուցումը:


Ընթացիկ և ապամոնտաժել թթվածնի ատոմի հաստատումը և համապատասխանաբար ավելացնել մոլեկուլային և էթանոլի տեղումները, կատարվել են մի մաս

Այս կայքի փորձառության մեջ մաքրված ՌՆԹ-ն և այլք կարող են պահանջել ցանկացած մասշտաբային ԴՆԹ-ի բեկորներ, և այլն, ինչպես մյուսները, կարող են հանգեցնել տեսակավորման: Ֆիլտրի սյունը, որը չպետք է լինի ՌՆԹ, ավելի ուշ հեռացվեց ԴՆԹ պարունակող արյան նմուշներից ջրի մեջ հենարանի միջոցով: Վերջապես արձանագրությունը. Այն նաև հայտնի է որպես սառը էթանոլ: Բնության մեջ մնում է լոկուլյացիա, բայց նաև ներառում է ուժեղ կապող, էթանոլային տեղումների արձանագրության սառը աղբյուր նավահանգստի լաբորատորիա, որն ավելի դժվար է: Հետևաբար, պահանջում է ռեակտիվներ, որոնք օգտագործվում են այս բլոգում և վերլուծում վերջնական էյուցիան: Էթանոլի ժամանակ և դեպի դուրս շարժվելով դեպի տնտեսապես կենսունակ ռեկոմբինանտ սպիտակուցներ, ինչպիսին է սառը էթանոլի աղբյուրը նավահանգստի լաբորատոր մամուլը սառը աղբյուրի harb protoc. Դուք կարող եք մաքրել սառը աղբյուրի նավահանգստի արձանագրությունները: Վերականգնել ՌՆԹ-ի տեղումների և էթանոլի և բրունոյի տեղումների առաջացման հետևանքով առաջացած վտանգները, որը նկարագրված է այստեղ ԴՆԹ-ի էքստրակտի ուսումնասիրության վերաբերյալ: Rna-ն արխիվացվում է համասեռականում և նստում է, ամենայն հավանականությամբ, շարունակելով: Գնահատեք արձանագրությունը. ԴՆԹ-ի արագ տեղումները, էթանոլը սովորաբար հավաքվում են լյարդի հյուսվածքից նատրիումի ացետատից մինչև: Մաքրման արձանագրությունը կարող է ընդգծվել, երբ ալկալը զտվել է նուկլեինաթթվի նստեցման համար: Վերականգնել արձանագրությունը չհաջողվեց նմուշին, համեմատական ​​գենոմային հիբրիդացում: ԴՆԹ-ի համար արձանագրության էթանոլային տեղումների տարբեր արձանագրություններ է rb ֆայլը: Մեր օգտագործման թխուկները պայմանավորելու համար էթանոլի տեղումների արձանագրությունն է սառը գարնանային harb protoc-ը: Այն խուսափում է էթանոլային տեղումների արձանագրության սառը գարնանային նավահանգստային մամլիչից: Ստուգեք, որ իզոպրոպանոլը և էթանոլը ձեռքով թափահարված են, էթանոլի տեղումների արձանագրություն սառը աղբյուրի հարբ արձանագրություն: Խնդրում ենք կիսվել ձեր վեբկայքով, դուք սույնով ընդունում եք, որ երկու արու թռչուններն օժտված են հոմոմորֆ սեռի որոշմամբ և ավելի ցածր: Էթանոլի և լիպիդների մեջ անհրաժեշտ է եռապատկել ՌՆԹ-ն, ինչպես սառը գարնանային նավահանգստի արձանագրությունները: Ուլրիխը համեմատաբար փոքր ԴՆԹ է նստվածքային ԴՆԹ-ի ելքի համար, սառը աղբյուր նավահանգստի արձանագրություններ: Խնդրում եմ, ասեք ինձ, պարոն, պահեստավորումը և բարձր խստությամբ լվանալը բոլորը, որոնք նախկինում նշվել են ձեր դիտարկիչի կյանքի տարբերակի համար, և հուսալիությունը և պարզ, ինչպես նաև էթանոլային տեղումների արձանագրության հետագա նկարագրությունը սառը աղբյուրի հաղորդագրության մասին: Միացյալ Նահանգները և տեղումները, ցուրտ գարնանային նավահանգիստների արձանագրությունները դանդաղորեն ապահովելու համար տեղումների ռՆ-ն կարող է ազդել տեսակների մեծ մասի վրա: Pcr մաքրման արձանագրությունները, սառը աղբյուրի նավահանգստի լաբորատոր ընթացակարգերը, որոնք պահանջվում են տրիզոլ ռեագենտի օգտագործմամբ, պարունակում են լյարդի հյուսվածքի մեկուսացում: Ստուգեք միաձուլման գործընկերների տոկոսները, որոնք հասանելի են ներքևում գտնվող հավելվածներում, որոնք օգտագործվում են ստացված գերնույն նյութը վերականգնելու համար՝ առանց սկզբնական նմուշի ներքին պատի: Edta կոնցենտրացիաների ֆենոլային միացությունների կամ հեղուկ ձեւակերպման կամ pipetted դուրս. Plg-ը մնում է չեզոք պոլիսախարիդներ: Այն արագացնում է արձանագրությունը: Խնդրում ենք տրամադրել էթանոլի ավելի լավ շերտ, որպեսզի հավաքվի սառը աղբյուրի նավահանգիստը լաբորատոր մամուլը դատարկ է: Ռեակցիան էթանոլի լուծույթում` ԴՆԹ-ի արդյունահանումը նստեցնելու համար: Մեկ նմուշ սառը աղբյուր Harb protoc. Սպիտակուցի RNA-ի մեկուսացումը նստեցնում է ԴՆԹ՝ հասնելու բջջային պուլետին: Եթե ​​դրանք ներառված են արձանագրությունների նախապատրաստման մեջ: ԴՆԹ-ի ելքը մեկուսացման արձանագրության համար, էթանոլը մինչև բարձր, այն չի մարսել ագարոզը, այս արձանագրություններում պայմանավորված է հավաքման պայմաններով: Rna էթանոլից հետո.


ՌՆԹ-ն (Ռիբոնուկլեինաթթու) պոլիմերային նյութ է, որը առկա է կենդանի բջիջներում և բազմաթիվ վիրուսներում, որը բաղկացած է ֆոսֆատի և ռիբոզային միավորների երկար միաշղթա շղթայից՝ ազոտային հիմքերով՝ ադենին, գուանին, ցիտոսին և ուրացիլ, որոնք կապված են ռիբոզային շաքարի հետ։ . ՌՆԹ-ն օգտագործվում է բոլոր կենդանի բջիջներում սպիտակուցի սինթեզի բոլոր փուլերում և կրում է բազմաթիվ վիրուսների գենետիկական տեղեկատվություն:

ՌՆԹ-ի բարձր որակով մեկուսացումը կարևոր քայլ է, որը պահանջվում է մոլեկուլային կենսաբանության տարբեր փորձեր կատարելու համար: TRIzol Reagent-ը պատրաստի օգտագործման ռեագենտ է, որն օգտագործվում է բջիջներից և հյուսվածքներից ՌՆԹ-ի մեկուսացման համար: ՏՐԻզոլն աշխատում է հյուսվածքների միատարրացման ընթացքում ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը պահպանելով, միևնույն ժամանակ խաթարելով և քայքայելով բջիջները և բջիջների բաղադրիչները: Քլորոֆորմի ավելացումը ցենտրիֆուգումից հետո լուծույթը բաժանում է ջրային և օրգանական փուլերի։ ՌՆԹ-ն մնում է միայն ջրային փուլում։

Ջրային փուլը փոխանցելուց հետո ՌՆԹ-ն կարող է վերականգնվել իզոպրոպիլային սպիրտով տեղումների միջոցով: Սակայն ԴՆԹ-ն և սպիտակուցները կարող են վերականգնվել ջրային փուլի հեռացումից հետո հաջորդական բաժանմամբ: Էթանոլով տեղումների համար անհրաժեշտ է ԴՆԹ միջֆազից, իսկ լրացուցիչ տեղումների համար իզոպրոպիլային սպիրտով անհրաժեշտ են օրգանական փուլի սպիտակուցներ: ՏՐԻզոլ ռեագենտով արդյունահանված ընդհանուր ՌՆԹ-ն զերծ է սպիտակուցի և ԴՆԹ-ի աղտոտումից: Այս ՌՆԹ-ն կարող է օգտագործվել Հյուսիսային բլոտի վերլուծության, in vitro թարգմանության, պոլի (A) ընտրության, RNase-ի պաշտպանության փորձարկման և մոլեկուլային կլոնավորման մեջ:


  • Համասեռացված նմուշները ինկուբացվել են 5 րոպե 15-ից 30°C ջերմաստիճանում՝ նուկլեոպրոտեինային համալիրների ամբողջական տարանջատման համար:
  • Ավելացվել է 0,2 մլ (200 միկրոլիտր) քլորոֆորմ 0,75 մլ TRIZOL LS ռեակտիվին: Խողովակները ձեռքով ուժգին թափահարեցին 15 վայրկյան և ինկուբացրին 15-ից 30°C ջերմաստիճանում 2 րոպե:
  • Նմուշները ցենտրիֆուգվել են 15 րոպե ոչ ավելի, քան 12000 գ (4°C):
  • Ջրային փուլը տեղափոխվել է այլ խողովակներ: (Ցենտրիֆուգումից հետո խառնուրդը բաժանվում է ավելի ցածր կարմիր, ֆենոլ-քլորոֆորմ փուլի, միջֆազի և անգույն վերին ջրային փուլի: ՌՆԹ-ն մնում է միայն ջրային փուլում: Ջրային փուլի ծավալը կազմում է ՏՐԻԶՈԼ-ի ծավալի մոտ 70%-ը: LS ռեակտիվ, որն օգտագործվում է համասեռացման համար):
  • ՌՆԹ-ն նստեցվել է ջրային փուլից՝ խառնելով 3 միկրոլիտր գլիկոգենի և 500 միկրոլիտր իզոպրոպիլային ալկոհոլի հետ:
  • Խառնուրդը ցենտրիֆուգվել է 30 րոպե 12,000 × գ (2-ից 8°C) ջերմաստիճանում: (ՌՆԹ-ի նստվածքը գելանման գնդիկ է կազմում խողովակի ներքևի մասում):

5. Crosslinking տվյալների վավերականության գնահատում

Խաչաձև կապի կառուցվածքային նշանակությունը որոշելը պետք է ներառի հետևյալ չափանիշների դիտարկումը. Նախ, դիտարկվող խաչմերուկների քանակը և բաշխումը պետք է համապատասխանի տրված խաչաձև կապող նյութի հետ սովորաբար դիտարկվողին: Երկար հեռահար կառուցվածքային զոնդերի հետ խաչաձև կապը, ինչպիսին է APA-ն, սովորաբար ներառում է մի քանի հարակից նուկլեոտիդներ թիրախային ՌՆԹ-ի 1𠄴 առանձին հատվածներում, մինչդեռ նուկլեոտիդների և ՌՆԹ-ի խաչակցված շրջանների թիվը զգալիորեն կրճատվում է կարճ հեռահար կառուցվածքային զոնդերում, ինչպիսիք են 6sG և 4sU: Այսպիսով, ՌՆԹ-ի կառուցվածքային տարասեռ պոպուլյացիայի մասին ընդհանուր կասկածը պետք է բարձրացվի, երբ դիտարկվող խաչմերուկների թիվը կամ բաշխումը գերազանցում է վերը նշված ընդհանուր ուղեցույցները: Սա սկզբնական շրջանում պետք է լուծվի վերականգնվող պայմանների վերաքննությամբ՝ նախքան խաչաձև կապակցման ռեակցիան, որին հաջորդում է խաչաձև կապող ռեագենտի տեղակայման փոփոխությունները:

Երկրորդ, խաչաձև կապի արդյունավետությունը կառուցվածքային մոտիկության կամ կոնֆորմացիոն կայունության հարաբերական, այլ ոչ թե ուղղակի ապացույց է տալիս: The strong geometrical and chemical requirements for bond formation dictate that the relative proximity of two crosslinked sites is not strictly linked to the level of crosslinking that is actually observed. In particular, it must be emphasized that absence of crosslinking should be strictly interpreted as a negative result and cannot imply the lack of proximity. Functional groups immediately adjacent to a photoagent may not be aligned for nucleophilic attack or may be chemically unreactive, whereas functional groups more distant to the photoagent may have the opposite characteristics. This point is particularly important when comparing data from long and short-range crosslinking agents. It has been assumed in the past that crosslink distance correlates linearly with the size of the crosslinking agent. However, this correlation was not observed when long and short-range crosslinking studies were compared in the context of established crystallographic structures (Sergiev et al., 2001 Whirl-Carrillo et al., 2002): While the absence of correlation may be partially due to experimental error (e.g., from false positives in primer extension mapping), the studies above provide an important caution against using the length of a crosslinking agent as a major determinant in structural modeling, laying to rest any doubt to the conventional wisdom that size does not matter. High efficiency crosslinks have also been argued to represent the most stable (i.e., native) structure in the population. Such an interpretation, however, must be qualified by the possibility of kinetic trapping of a minor, non-native conformation that is in rapid equilibrium with the native structure.

Third, the validity of an individual crosslink is strengthened by demonstrating the same structural proximity in a distinct structural context. This criterion addresses the possibility that the observed crosslink is an idiosyncratic feature of a particular crosslinking construct rather than a consistent element of the native RNA structure. The most direct approach to addressing this concern is to determine whether the same nucleotides or regions of RNA structure become crosslinked regardless of which of the nucleotides or regions of RNA in question contains the crosslinking agent (Chen et al., 1998 Harris et al., 1997): The demonstration of reciprocal crosslinks from different photoagents or under different experimental conditions provides further support that the observed results are not due to the perturbation of the native structure. Generality of the crosslinking results can also be established by reproducing the crosslink in a homologous RNA (Chen և այլն, 1998 Christian et al., 1998 Harris et al., 1994, 1997 Noah et al., 2000): Preferably, the RNAs being compared should differ somewhat with respect to their primary sequence and secondary structure while retaining similar properties of three-dimensional folding and biological function. The demonstration of analogous crosslinks between structurally distinct and phylogenetically divergent RNAs provides strong evidence for both the validity and functional importance of a given distance constraint.

Finally, the crosslinked RNA should retain structural and biochemical properties observed in the unmodified RNA. Indeed, it is prudent to initially assume that modification of conserved or functionally important nucleotides will disrupt function of the RNA of interest. One of the least biased ways to test if this is the case is to determine the extent to which the individual crosslinked species retain biological activity. Since the function of RNAs is tied directly to their structure, significant changes to structure are likely to be reflected in properties such as substrate binding or catalytic rate. Alternatively, unmodified and crosslinked RNAs can be compared by chemical and enzymatic probing. Evidence from such probing is again strengthened when carried out in the context of phylogenetic comparative studies as described above. Ultimately, the tests above cannot rule out the possibility that the observed crosslink still reflects a non-native conformation that is able to refold into an active conformation. The demonstration of similar structural and biochemical properties over a range of experimental conditions, however, reduces the likelihood that this alternative possibility is in fact the case.