Տեղեկատվություն

Ինչպե՞ս են միացված պառակտված ինտինները


Արդյո՞ք նրանք կազմում են պեպտիդային կապ: Թե՞ դա պարզապես ինչ-որ հարազատության/վան դեր Վալսի փոխազդեցություն է:

Արդյո՞ք մեխանիզմ ֆերմենտը կատալիզացված է:

Հայտնի՞ են միացման վայրի մնացորդները/հատվածները: Հնարավո՞ր է նրանց ծանոթացնել սինթեզված պեպտիդների բեկորների հետ ՝ հասնելու ինչ -որ բանի, ինչպիսին է հայրենի քիմիական կապը:


Սպիտակուցների ձևավորում քիմիական փոփոխություններով, օգտագործելով պառակտված ինտեիններ

Դեռ Biology101-ում մենք իմացանք, որ յուրաքանչյուր սպիտակուցի կառուցվածքն ու գործառույթը հիմնականում որոշվում է նրա ամինաթթուների հաջորդականությամբ, որն իր հերթին կոդավորված է ԴՆԹ-ի համընդհանուր գենետիկ կոդով: Մանիպուլյացիա արեք ԴՆԹ-ի հաջորդականությամբ, և մենք կարող ենք ստիպել բջիջին արտադրել ցանկացած սպիտակուց, որը մենք ցանկանում ենք: Դե, ոչ այնքան, քանի որ մենք կսահմանափակվենք 20 ամինաթթուների տարրերով, որոնք տրված են գենետիկ ծածկագրով: Մյուս կողմից, քիմիկոսները նախընտրում են պեպտիդներն ու սպիտակուցները սինթեզել զրոյից, ինչը թույլ է տալիս նրանց ներդնել ոչ կանոնական ամինաթթուներ (ncAAs) `ցանկալի հատկություններով և գործառույթներով: Այնուամենայնիվ, սպիտակուցի չափը և տեսակը, որը մենք կարող ենք սինթեզել այս կերպ, դեռ սահմանափակ է:

Վերջին տարիներին գիտնականները հաջողությամբ փորձել են վերածրագրավորել գենետիկ կոդը՝ հնարավորություն տալով տեղանքում ավելի էկզոտիկ ncAA-ների ներմուծումը սպիտակուցների մեջ 1: Այնուամենայնիվ, մնացորդների քանակը և տեսակը, որոնք կարող են արդյունավետ կերպով ներմուծվել, դեռևս անսահման չէ, և մի քանի անգամ, լաբորատորիայում այլ նախագծերի ընթացքում, մենք բախվել ենք այս խնդիրների մի մասի հետ 2,3: Սպիտակուցները մանիպուլյացիայի ենթարկելու կիսասինթետիկ պողոտաները դիտելիս մենք հանդիպեցինք պառակտված ինտեինների, որոնք սպիտակուցների ճարտարագիտության համար անվերջ թվացող ներուժ են առաջարկում 4:

Պառակտված ինտինները բնականորեն առաջացող սպիտակուցային տիրույթներ են, որոնք ըստ էության իրենց պահում են որպես միակցիչներ ՝ սպիտակուցի առանձին հատվածներին միանալու համար գրեթե առանց հետքի (Նկար 1) 4:

Նկար 1. Երկու սպիտակուցների կապակցում, օգտագործելով պառակտված ինտեիններ:

Մենք կարծում էինք, որ պետք է հնարավոր լինի վերականգնել ամբողջ երկարությամբ թաղանթային սպիտակուցը երեք տարբեր բեկորներից՝ օգտագործելով երկու ուղղանկյուն ճեղքված ինտեիններ (Int-A և Int-B)՝ մի մոտեցում, որը կոչվում է տանդեմ սպիտակուցի տրանս միացում (tPTS): Սա մեզ թույլ կտա արդյունավետորեն փոխարինել սպիտակուցի մի ամբողջ հատվածը սինթետիկ պեպտիդով ՝ այն կովալենտորեն միացնելով բջջում արտահայտված մեմբրանի սպիտակուցի մնացած բեկորներին ՝ պառակտված ինտինների միջոցով (Նկար 2): Տեսականորեն սա նշանակում է, որ այն ամենը, ինչ կարող է քիմիապես սինթեզվել պեպտիդի համատեքստում, կարող է ներառվել սպիտակուցի մեջ:

Նկար 2. Սինթետիկ պեպտիդի (Պեպտիդ X) ներդիրը թաղանթային սպիտակուցի ներբջջային կապիչի մեջ:

Որոշ հնարավոր կիրառություններ ցուցադրելու համար մենք օգտագործեցինք մեր մոտեցումը՝ ա) փոփոխություններ մտցնել GFP-ում՝ նրա քրոմոֆոր հատկությունները շահարկելու համար, բ) տեղադրել բազմաթիվ հետթարգմանական փոփոխություններ (PTMs) սրտային նատրիումի ալիքի ներբջջային կապողներ Nav1.5 և գ) ներմուծել ոչ -լիզինի կանոնական ածանցյալները P2X2 ընկալիչի արտաբջջային ATP- ի պարտադիր վայրում (Նկար 3) 5:

Մեր աշխատանքն էվկարիոտ բջիջներում tPTS- ի միջոցով լիարժեք սպիտակուցների վերականգնման առաջին օրինակն է: Մոտեցումը կարող է ներդնել գործնականում ցանկացած ncAAs, PTMs, քիմիական բռնակներ, ֆտորոֆորներ և դրանց համադրություն սպիտակուցի ընտրված վայրում ՝ դրանով իսկ ներկայացնելով նոր գործիք սպիտակուցային ճարտարագիտության ոլորտում: Այնուամենայնիվ, կարևոր է հաշվի առնել, որ tPTS- ի եկամտաբերությունը, որը մենք փորձեցինք մեր փորձերում, սովորաբար 5%-ից պակաս էր, մի արժեք, որը, հավանաբար, չափազանց ցածր է որոշ անալիզների համար: Այնուամենայնիվ, դա բավարար է սպիտակուցների հետազոտման համար, որոնք կարող են ուսումնասիրվել բարձր զգայուն մեթոդներով, ինչպիսիք են էլեկտրոֆիզիոլոգիան կամ պատկերումը:

Գծապատկեր 3. Որոշ PTM նմանակներ և ncAA- ներ հաջողությամբ ներդրվել են tPTS- ի միջոցով:

Թեև դա հզոր գործիք է, սակայն ապագայում տեխնիկայի կատարելագործման համար հստակ տեղ կա: Ավելի արդյունավետ և անառակ ինտինների օգտագործումը էապես կբարձրացնի այս մոտեցմանը համապատասխանող սպիտակուցների և պեպտիդների տեղադրման վայրերի թիվը:

Իրոք, կենսաբանության և քիմիայի մասին մեր գիտելիքներով և պառակտված ինտինինի մի փոքր օգնությամբ, հնարավոր է թվում ապագայում կառուցել և մշակել որոշ իսկապես նոր սպիտակուցներ:

1 Chin, J. W. Ընդլայնելով և վերագրագրավորելով գենետիկական ծածկագիրը: Բնություն 550, 53-60, դոի ՝ 10.1038/nature24031 (2017):

2 Lynagh, T., Mikhaleva, Y., Colding, J. M., Glover, J. C. & Pless, S. A. Թթվային զգայուն իոնային ուղիները առաջացել են ավելի քան 600 Mya և պահպանվել են դեյտերոստոմներում: Պրոց. Նատլ. ակադ. Գիտ. ԱՄՆ. 115, 8430-8435, դոի ՝ 10.1073/pnas.1806614115 (2018):

3 Բորգ, Ք.Բ. et al. ASIC1a- ի վրա մեծ դինորֆինի գործողության մեխանիզմը և վայրը: Պրոց. Նատլ. ակադ. Գիտ. ԱՄՆ. 117, 7447-7454, doi:10.1073/pnas.1919323117 (2020):

4 Thompson, R. E. & amp Muir, T. W. Chemoenzymatic Semisynthesis of Proteins. Քիմ. Վրդ., doi:10.1021/acs.chemrev.9b00450 (2019):

5 Խոո, Կ Կ. et al. Սպիտակուցների քիմիական փոփոխություն `սինթետիկ պեպտիդների տեղադրմամբ` օգտագործելով տանդեմ սպիտակուցների փոխկապակցումը: Նատ. Կոմունա 11, 2284, դոի ՝ 10.1038/s41467-020-16208-6 (2020):


Վերացական

Քիմիապես ձևափոխված սպիտակուցները անգնահատելի գործիքներ են կենսաբանական գործընթացների մոլեկուլային մանրամասների ուսումնասիրման համար, և դրանք նաև մեծ ներուժ ունեն որպես նոր թերապևտիկ գործակալներ: Սպիտակուցների տեղանվան փոփոխման մի քանի մեթոդներ են մշակվել, որոնցից ամենաընդունվածներից մեկը արտահայտված սպիտակուցային կապն է (EPL), որի դեպքում ռեկոմբինանտ α-թիոստերը կապվում է C- պարունակող N- տերմինալ պեպտիդի հետ: Չնայած EPL-ի լայն տարածմանը, անհրաժեշտ ռեկոմբինանտ սպիտակուցի α-թիոէսթերների առաջացումը և մեկուսացումը մնում է դժվար: Մենք այստեղ նկարագրում ենք ռեկոմբինանտ սպիտակուցի α-թիոէսթերների պատրաստման և մաքրման նոր մեթոդ՝ օգտագործելով բնական պառակտված DnaE ինտեինների մշակված տարբերակները: Ինքնամշակման ֆերմենտների այս ընտանիքը սերտորեն կապված է սպիտակուցների α-thioester սերնդի համար ներկայումս օգտագործվող ինտինների հետ, սակայն դրանք ավելի արագ կինետիկ են և բաժանված են երկու անգործուն պոլիպեպտիդների, որոնք ակտիվանալու համար անհրաժեշտ է միանալ: Օգտվելով երկու պառակտված ինտե բեկորների միջև ամուր կապից ՝ մենք մշակեցինք բջջային լիզատներից α-thioesters սպիտակուցի մաքրման և առաջացման պարզ ընթացակարգ և կիրառեցինք այս ռազմավարությունը մի շարք սպիտակուցների կիսասինթեզի համար, ներառյալ ացետիլացված հիստոնը և տեղանքը: - հատուկ ձևափոխված մոնոկլոնալ հակամարմին:


ԱՐԴՅՈՒՆՔՆԵՐ

Intein միջնորդավորված split SpCas9-ի ձևավորում

Ինտինները հեշտությամբ կարելի է բացատրել որպես սպիտակուցի ինտրոններ. Նրանք իրենց ենթակա են հաջորդականությունից և միանում են մնացած կողային շրջաններին (էքստեիններին) պեպտիդային կապով ՝ առանց սպի թողնելու (24): Ցիանոբակտերիայից ԴՆԹ պոլիմերազ III DnaE-ի կատալիտիկ ենթամիավորի կոդավորման շրջանները Nostoc punctiforme (Npu) գտնվում են երկու գեներում, dnaE-n եւ dnaE-c. The dnaE-n կոդավորված սպիտակուցը բաղկացած է N- տերմինալ DnaE հատվածից գումարած N-intein, մինչդեռ dnaE-c կոդավորում է մի սպիտակուց, որը բաղկացած է C-տերմինալ DnaE հատվածից, որին նախորդում է C-Intein էությունը: N-intein-ը և C-Intein-ը ճանաչում են միմյանց, միաձուլվում և միաժամանակ կապում են կողային N- և C-տերմինալ էքստերինները, ինչը հանգեցնում է ամբողջ երկարությամբ DnaE-ի վերականգնմանը (24):

Մենք օգտագործում ենք այս բնական երևույթը՝ փոխանակելով էքստեյնի շրջանները SpCas9-ի համապատասխան կեսերի հետ (Նկար 1ա): SpCas9- ի պառակտման վայրերը ուշադիր ընտրվել են Glu573- ի և Cys574- ի միջև ՝ առաջին տարբերակի համար (v1) կամ Lys637- ի և Thr638- ի միջև ՝ երկրորդ տարբերակի համար (v2), քանի որ C-Cas9- ի C- Intein_C- ում N- տերմինալ ամինաթթուն: -Cas9 միաձուլումը պետք է լինի Cys, Ser կամ Thr, որպեսզի ապահովի բարձր միացման արդյունավետությունը (7, 25) (Նկար 1 ա): Ավելին, հատուկ ուշադրություն է դարձվել այնպիսին, որ պառակտման տեղերը մակերևույթի վրա ենթարկվել են սպիտակուցների միացման ստերիստական ​​անհրաժեշտության պատճառով (26):

Split-inteins-ի օգտագործումը split–Cas9-ի վերականգնման համար: (Ա) Split-intein վերակազմավորման արդյունքում պառակտված intein շերտերը բաժանվում են իրենց և կապում կողային N- և C- վերջավոր SpCas9 կիսաեզրափակիչները (exteins), ինչը հանգեցնում է ակտիվ երկարաժամկետ SpCas9- ի վերականգնման: (Բ) Split-SpCas9 տարբերակ 1. DnaE N-intein (նարնջագույն) միաձուլվում է SpCas9 1-573-ի C-վերջին (N-Cas9, կարմիր), մինչդեռ DnaE C-intein (կանաչ) միաձուլվում է SpCas9-ի N-վերջին: 574- 1368 (C-Cas9, կապույտ): Split-SpCas9 տարբերակ 2. DnaE N-ինտեինը միաձուլվում է SpCas9 1-637-ի C-վերջին, մինչդեռ DnaE C-ինտեինը միաձուլվում է SpCas9 638-1368-ի N-վերջին: (Գ) Նուկլեյզների գործունեությունը չափելու և HDR- ից NHEJ- ի իրադարձությունները տարբերելու համար օգտագործվել է լուսացույցի լուսաբանող համակարգ: NHEJ միջոցառումները, որոնք ներկայացվել են SpCas9- ի կողմից, հաճախ կստեղծեն ինդելներ, որոնք կհանգեցնեն շրջանակների փոփոխման մուտացիաների, ինչը կհանգեցնի TagRFP- ի արտահայտմանը: HDR իրադարձությունները կհանգեցնեն կտրված Վեներայի վերականգնմանը տրված վերանորոգման ձևանմուշով (դոնորի ԴՆԹ-ի ձախ հոմոլոգիայի թեւը՝ 0,4 կբ, աջ հոմոլոգիայի թեւը՝ 1,4 կբ) և Վեներայի կենտրոնում կանգառի կոդոնի հեռացումը, ինչը հանգեցնում է արտահայտման։ ամբողջ երկարությամբ Վեներա. Թարգմանված շրջանները նշվում են որպես տողեր սխեմատիկ ԴՆԹ-ի տակ՝ թարգմանության սկզբնական տեղով և վերջակետային կոդոնով: Տուփի ներդիրը ցույց է տալիս թիրախային հաջորդականության մանրամասները, որոնք ճանաչվում են gRNA-ների crTLR#1 և crTLR#3-ի կողմից: CAG. Սինթետիկ կաթնասունների խթանող CAG bGH. Խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնի պոլիադենիլացման վայր:

Split-inteins- ի օգտագործումը split-Cas9 վերականգնման համար: (Ա) Split-intein վերակազմավորման արդյունքում պառակտված intein շերտերը բաժանվում են իրենց և կապում կողային N- և C- վերջավոր SpCas9 կիսաեզրափակիչները (exteins), ինչը հանգեցնում է ակտիվ երկարաժամկետ SpCas9- ի վերականգնման: (Բ) Split-SpCas9 տարբերակ 1. DnaE N-intein (նարնջագույն) միաձուլված է SpCas9 1- 573- ի C- վերջավորությանը (N-Cas9, կարմիր), մինչդեռ DnaE C-intein (կանաչ) միաձուլված է SpCas9- ի N- վերջավորությանը 574- 1368 (C-Cas9, կապույտ): Split-SpCas9 տարբերակ 2. DnaE N-intein- ը միաձուլված է SpCas9 1- 637- ի C- վերջավորին, մինչդեռ DnaE C-intein- ը `SpCas9 638- 1368- ի N- տերմինալին: (Գ) Նուկլեյզների գործունեությունը չափելու և HDR- ից NHEJ- ի իրադարձությունները տարբերելու համար օգտագործվել է լուսացույցի լուսաբանող համակարգ: NHEJ միջոցառումները, որոնք ներկայացվել են SpCas9- ի կողմից, հաճախ կստեղծեն ինդելներ, որոնք կհանգեցնեն շրջանակների փոփոխման մուտացիաների, ինչը կհանգեցնի TagRFP- ի արտահայտմանը: HDR- ի իրադարձությունները կհանգեցնեն կտրված Վեներայի նորոգմանը ՝ տրված վերանորոգման ձևանմուշով (դոնորի ԴՆԹ ձախ հոմոլոգիայի թև ՝ 0,4 կբ, աջ հոմոլոգիական թև ՝ 1,4 կբ) և Վեներայի կենտրոնում կանգառի կոդոնի հեռացում, ինչը կհանգեցնի արտահայտման ամբողջ երկարությամբ Վեներա. Թարգմանված շրջանները նշվում են որպես գծեր սխեմատիկ ԴՆԹ -ի տակ `թարգմանության սկզբնակետի և կանգառի կոդոնի հետ: Տուփի ներդիրը ցույց է տալիս թիրախային հաջորդականության մանրամասները, որոնք ճանաչվում են gRNA-ների crTLR#1 և crTLR#3-ի կողմից: CAG. Սինթետիկ կաթնասունների խթանող CAG bGH. Խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնի պոլիադենիլացման վայր:

Split-intein-Cas9 համակարգերը ստեղծվել են SpCas9- ի N- կամ C- տերմինալային կիսամյակներին համապատասխան ինտեին կիսատերի միաձուլման միջոցով. N-Cas9_N-Intein_v1 և C-Intein_C-Cas9_v1 v2- ն օգտագործում է SpCas9 1- 637 և SpCas9 638- 1368 որպես պառակտված – Cas9 մասեր, ինչը հանգեցնում է միաձուլման երկու կոնստրուկցիայի ՝ N-Cas9_N-Intein_v2 և ​​C-Intein_C-Cas9_v2 (Նկար 1 բ):

Ինտեին միջնորդավորված SpCas9- ը նույնքան ակտիվ է, որքան վայրի տիպի SpCas9- ը փոխնակ լրագրողների համակարգերում

Փորձարկելու համար, թե արդյոք ինտեգրված վերակառուցված պառակտումը Cas9- ն ակտիվ է, մենք օգտագործեցինք Neuro-2a բջջային գիծը, որը կրում էր մեկ պատճենված ինտեգրված փոխնակ լուսացույցի լրագրող (TLR): Այս թղթակիցը հնարավորություն է տալիս տարբերակել երկու հիմնական վերանորոգման ուղիները կրկնակի շղթայի ընդմիջումից հետո, որը միջնորդվում է բջջի վերանորոգման մեխանիզմով: Սա (i) սխալի հակված ոչ հոմոլոգ վերջի միացումն է (NHEJ) և (ii) բարձր հավատարմության հոմոլոգիայի ուղղորդված վերանորոգումը (HDR) (Նկար 1c): NHEJ- ն լրագրողների շրջանում առաջացնում է ինդելներ, որոնք TagRFP- ն դնում են ընդհանուր իրադարձությունների մեկ երրորդի մեջ ՝ թույլ տալով դրա արտահայտումն ու հայտնաբերումը (կարմիր ֆլուորեսցենցիա), մինչդեռ HDR- ն հանգեցնում է վերանորոգված mVenus- ի (կանաչ ֆլուորեսցենցիա) արտահայտությանը (Նկար 1c): 48 ժամ անցողիկ տրանսֆեկցիայից հետո split-intein համակարգի երկու տարբերակներով (N-Cas9_N-Intein և C-Intein_C-Cas9 v1 և v2-ի համար) և U6 արտահայտված gRNA (Նկար 2ա), արդյունքում ստացված լյումինեսցենտային բջիջների քանակը. ոչ հոմոլոգ վերջի միացումից (NHEJ) և հոմոոլոգիայի ուղղորդված վերանորոգումից (HDR) իրադարձությունների գումարին համապատասխանում է SpCas9 վայրի տիպի արժեքները՝ օգտագործելով ամբողջ երկարությամբ SpCas9 և gRNA (Նկար 2ա և բ): Ի տարբերություն դրա, բացասական հսկիչ սարքերում ֆլյուորեսցենտային ազդանշան չի հայտնաբերվել, որտեղ SpCas9-ն արտահայտվել է առանց gRNA-ի (Նկար 2b) կամ երբ միայն SpCas9-ի ինտեին-կեսերը համակցված են եղել gRNA-ի հետ (Նկար 2b):

Split – Cas9 արդյունավետության փորձարկում Neuro-2a TLR բջջային տողերում: (Ա) Օգտագործված WT և split–Cas9 արտահայտչական պլազմիդների ակնարկ (Cas9, N-Cas9_N-Intein_v1, C-Intein_C-Cas9_v1, N-Cas9_N-Intein_v2, C-Intein_C-Cas9_v2, gRNA crTLR#1/#): Բարձր արտահայտություն ապահովելու համար օգտագործվել է կաթնասունների ուժեղ սինթետիկ խթանող (CAG, կանաչ) և խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնի (bGH, կարմիր) պոլիադենիլացման տեղ: Cas9 cDNA- ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein- ը `մուգ շագանակագույնով և C-Intein- ը` բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG և HA պիտակը ցուցադրվում են համապատասխանաբար բաց և մուգ մոխրագույն գույներով: gRNA արտահայտման համար (փիրուզագույն) ընտրվել է U6 պրոմոուտեր (մուգ կանաչ): (ԲԱրդյունքները FACS-ից հետո. միայն 1-ին (v1) և 2 (v2) տարբերակի համար split-intein-Cas9 համակարգի N- և C-տերմինալ մասերի հետ վարակումը հանգեցրել է նուկլեազի ակտիվության, որը նման է վայրի տիպի SpCas9-ին, որը ներկայացված է HDR-ում: կամ NHEJ իրադարձությունների փոխակերպումը միայն մեկ շերտով ցույց չտվեց որևէ դիտարկելի HDR կամ NHEJ իրադարձություն: Ownույց են տրված միջոցներ three SD երեք անկախ փորձերի: (Գ) Split-intein-Cas9 համակարգը v1 օգտագործվել է սարկոմայի (Fus) գենի երկրորդ վերջին էկզոնի միաձուլման համար: Համապատասխան հատվածը PCR- ով ուժեղացվել է ծանոթագրված այբբենարաններով `հետագա անալիզի համար: T7 էնդոնուկլեազ I-ի վերլուծությունը կատարվել է PCR-ից հետո նմուշների վրա՝ հետազոտելու NHEJ-ի դեպքերի առաջացումը: Անալիզից հետո նմուշները վերլուծվել են կենսաալիզատորով: Երկրորդ ժապավենի հայտնվելը ցույց է տալիս NHEJ իրադարձությունների արդյունքում առաջացած ինդելների առկայությունը: (Դ) Rosa26 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rosa26#1-ով: Հայտնաբերվեցին միայն ինդելներ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկու SpCas9 տիպերը տեղափոխվեցին: (Ե) Rosa26 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rosa26#3 gRNA- ով: Indels- ը հայտնաբերվել է RFLP վերլուծությամբ: XbaI-ի դիմացկուն արտադրանքը կարելի է դիտարկել միայն այն ժամանակ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկուսն էլ SpCas9 մասերը փոխակերպվել են: (Ֆ) Rab38 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rab38#2-ով: Indels- ը հայտնաբերվել է RFLP վերլուծությամբ: XcmI-ի դիմացկուն արտադրանքը կարելի է դիտարկել միայն այն ժամանակ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկուսն էլ SpCas9 մասերը փոխակերպվել են: (Գ) Նուկլազի գործունեության քանակականացում յուրաքանչյուր թիրախային հաջորդականությամբ: FU: ֆլուորեսցենտային միավորներ, վ: վայրկյան:

Split–Cas9 արդյունավետության փորձարկում Neuro-2a TLR բջջային գծերում: (Ա) Օգտագործված WT և split-Cas9 արտահայտիչ պլազմիդների ակնարկ (Cas9, N-Cas9_N-Intein_v1, C-Intein_C-Cas9_v1, N-Cas9_N-Intein_v2, C-Intein_C-Cas9_v2, gRNA crTLR#1/#2): Բարձր արտահայտություն ապահովելու համար օգտագործվել է կաթնասունների ուժեղ սինթետիկ խթանող (CAG, կանաչ) և խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնի (bGH, կարմիր) պոլիադենիլացման տեղ: Cas9 cDNA- ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein- ը `մուգ շագանակագույնով և C-Intein- ը` բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG և HA պիտակը համապատասխանաբար ցուցադրվում են բաց և մուգ մոխրագույնով: ԳՌՆԹ արտահայտման համար (փիրուզագույն) U6 խթանողն ընտրվել է (մուգ կանաչ): (ԲԱրդյունքներ FACS- ից հետո. Միայն տրանսֆեկցիան split-intein-Cas9 համակարգի ինչպես N-, այնպես էլ C- տերմինալային մասերով 1-ին (v1) և 2-րդ տարբերակի համար (v2) հանգեցրեց նուկլազային ակտիվության, որը նման է վայրի տեսակի SpCas9- ին, որը ներկայացված է HDR- ով: կամ NHEJ իրադարձությունների տրանսֆեկցիան միայն մեկ մասով չի ցույց տվել որևէ դիտարկելի HDR կամ NHEJ իրադարձություն: Ownույց են տրված միջոցներ three SD երեք անկախ փորձերի: (Գ) Split-intein-Cas9 համակարգը v1 օգտագործվել է սարկոմայի (Fus) գենի երկրորդ վերջին էկզոնի միաձուլման համար: Համապատասխան հատվածը PCR- ով ուժեղացվել է ծանոթագրված այբբենարաններով `հետագա անալիզի համար: T7 endonuclease I- ի անալիզը PCR- ից հետո կատարվել է նմուշների վրա `NHEJ- ի իրադարձությունների առաջացումը հետաքննելու համար: Անալիզից հետո նմուշները վերլուծվել են կենսաալիզատորով: Երկրորդ խմբի տեսքը ցույց է տալիս NHEJ- ի իրադարձություններից բխող ինդելների առկայությունը: (Դ) Rosa26 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rosa26#1 gRNA- ով: Հայտնաբերվեցին միայն ինդելներ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկու SpCas9 տիպերը տեղափոխվեցին: (Ե) Rosa26 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rosa26#3 gRNA- ով: Ինդելները հայտնաբերվել են RFLP վերլուծության միջոցով: XbaI դիմացկուն արտադրանքը կարող էր դիտվել միայն այն ժամանակ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկու SpCas9 տիպերը տեղափոխվել էին: (Ֆ) Rab38 տեղանքի թիրախավորում gRNA Rab38#2-ով: Indels- ը հայտնաբերվել է RFLP վերլուծությամբ: XcmI դիմացկուն արտադրանքը կարող էր դիտվել միայն այն ժամանակ, երբ SpCas9 վայրի տիպի կամ երկուսն էլ SpCas9 տիպերը տեղափոխվել էին: (Գ) Նուկլեազի ակտիվության քանակականացում յուրաքանչյուր թիրախային հաջորդականության մեջ. FU: ֆլուորեսցենտային միավորներ, վ: վայրկյան:

Ինտեին միջնորդավորված split–Cas9 համակարգով էնդոգեն գեների թիրախավորման արդյունավետությունը համեմատելի է վայրի տիպի SpCas9-ի հետ։

Հետագա փորձերի ժամանակ մենք հաստատեցինք մեր Intein-Cas9 համակարգը մի քանի էնդոգեն տեղանքում (Ֆուս, Ռոզա 26 եւ Rab38) Neuro-2a բջիջներում: Առաջին ընտրված գենը եղել է Fus (միաձուլված է սարկոմայի մեջ), քանի որ այն կարևոր է որպես կողային ամիոտրոֆիկ սկլերոզի մոդել (27): Բջջի ամբողջ պոպուլյացիայի ԴՆԹ-ն մեկուսացվել է անցողիկ փոխպատվաստումից 48 ժամ անց: CRISPR/Cas9 թիրախային վայրը պարունակող տարածաշրջանը PCR- ով ուժեղացված է և կատարվել է T7 էնդոնուկլազեզ I անալիզը: Ինդելները անհամապատասխան դուպլեքսներ կստեղծեն դենատուրացիայի և վերամիավորման քայլից հետո: T7 endonuclease I- ն ճեղքում է այս անհամապատասխան շրջանները, և ինդելների առկայությունը պարզվում է մարսված PCR արտադրանքների առկայությամբ (Նկար 2c): Ինչպես և սպասվում էր, SpCas9- ի կամ երկու խմբերի ենթարկված բջիջներից միայն նմուշները ներկայացրեցին մարսողության կանխատեսվող արտադրանքը ՝ ցույց տալով ինդելների համանման տոկոսը (համապատասխանաբար ՝ 23.1 և 22.7%), մինչդեռ բացասական ստուգումներից ոչ մեկը չի հայտնաբերվել (Նկար 2 գ և է)

Ստուգված արդյունքները թիրախավորելու համար Fus գենը, թիրախավորվեցին երկու այլ գենային տեղանքներ: Մենք թիրախավորեցինք Ռոզա 26 որպես երկրորդ գենոմային տեղանք երկու տարբեր gRNA- ներով (Նկար 2 դ և ե): Ռոզա 26 լայնորեն օգտագործվում է որպես անվտանգ տեղանք մկների մեջ օտար ԴՆԹ-ի մեջ թակելու համար (28): Ինչպես նախորդ փորձի ժամանակ, այնպես էլ կանխատեսված թիրախային հաջորդականությունը պարունակող տարածաշրջանը ուժեղացվեց PCR- ով: Ինդելների առկայությունը, երբ օգտագործվում էր gRNA-Rosa26#1-ը, բացահայտվել է T7 էնդոնուկլազես I անալիզով, իսկ gRNA-Rosa26#3 պարտադիր տեղում XbaI կայքի առկայությունը թույլ է տվել մեզ վերլուծել RFLP- ով ինդելների գոյությունը: Երբ օգտագործվում էր gRNA-Rosa26#1, սպասվող մարսվող արտադրանքը հայտնաբերվում էր միայն SpCas9 կամ SpCas9 երկու մասերի ավելացման դեպքում (համապատասխանաբար `64.0 և 48.1%) (Նկար 2 դ, է): Այս տվյալները հաստատվել են ՝ օգտագործելով երկրորդ gRNA ՝ gRNA-Rosa26#3: Այս դեպքում ինդելները կխաթարեն XbaI տեղանքը, ինչի արդյունքում կստեղծվեն XbaI-ի դիմացկուն մուտանտ ԴՆԹ-ի բեկորներ (Նկար 2e): Կրկին մենք նկատեցինք, որ SpCas9 ինտեր-պառակտված տարբերակով դիտված նուկլազային ակտիվությունը (42.9%) համեմատելի էր վայրի տիպի SpCas9- ի (50.2%) հետ (Նկար 2 ե և է):

Որպես երրորդ տեղ, մենք թիրախավորեցինք Ռաբ38 տեղանք (Նկար 2f): Այս լոկուսը մեր կողմից նախկինում օգտագործվել էր որպես հիմնական գենոմային շրջանի ապացույց `ZFN, TALEN և CRISPR/Cas9 (21, 29) նուկլեզային ակտիվությունը ստուգելու համար: gRNA-Rab38#2-ի թիրախային հաջորդականությունը պարունակող շրջանը PCR-ով ուժեղացվել է և վերլուծվել RFLP-ով: Ինդելների առկայությունը բացահայտվեց XcmI տեղանքի կորստով, մինչդեռ վայրի տիպի ԴՆԹ-ն մարսվեց (Նկար 2 զ): Չմարսված արտադրանքը հայտնաբերվում էր միայն այն ժամանակ, երբ օգտագործվում էին երկու մասնատված SpCas9 (24.9%) կամ SpCas9 (22.7%) (Նկար 2f և g):

Interin- միջնորդավորված split-Cas9 համակարգը կարող է արդյունավետ մատուցվել rAAV- ի միջոցով

Intein միջնորդավորված split–Cas9 համակարգի մշակման նպատակն էր թույլ տալ արդյունավետ առաքում rAAV-ների միջոցով: Սա ցույց տալու համար արտադրվել է երկու ռեկոմբինանտ AAV, որոնցից յուրաքանչյուրը կրում է համակարգի պառակտված կեսը (pAAV_crTLR#1_Nv1 և pAAV_crTLR#1_Cv1) (Նկար 3 ա): Մեր համակարգի վավերացման համար օգտագործվել են մարդկային բջջային գիծ ՝ AAVS1 TLR/+ (18) և մկների բջիջներ ՝ Neuro-2a TLR: Երբ AAVS1 TLR/+ բջջային շարանը փոխարկվում էր երկու rAAV- ներով, նուկլեազի հարաբերական ակտիվությունը բացասական վերահսկողությունից ավելի երկու կարգի էր կամ երբ օգտագործվում էր միայն մեկ rAAV (Նկար 3 բ): Նեյրո-2ա TLR-ի դեպքում նման արդյունք է նկատվել։ Նուկլեազի հարաբերական ակտիվությունը մեկ կարգով ավելի մեծ էր, քան բացասական վերահսկողությունը և մեկ rAAV փորձերը (Նկար 3c): Երկու դեպքում էլ, փաստացի նկատված ակտիվությունը նույնիսկ ավելի բարձր էր, քանի որ այս ռեպորտաժային համակարգով հայտնաբերվում է տեսական ընդհանուր նուկլեազի ակտիվության միայն մեկ երրորդը: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ CRISPR/Cas9 ամբողջական համակարգի առաքումը հնարավոր է երկու rAAV- ի միջոցով ՝ առանց կաշկանդված տարրերի կողմից կաշկանդվելու:

Demույց, որ split-intein split-SpCas9 համակարգը կարող է մատուցվել rAAV- ի միջոցով: (Ա) Պառակտման – Cas9 rAAV կառուցվածքների ակնարկ (pAAV_crTLR#1_Nv1, pAAV_crTLR#1_Cv1): Բարձր արտահայտվածություն ապահովելու համար օգտագործվել է ուժեղ սինթետիկ կաթնասունների խթանող (CBh, կանաչ) և խոշոր եղջերավոր կենդանիների աճի հորմոն (bGH, կարմիր) պոլիադենիլացման տեղ: Split Cas9 cDNA-ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein-ը՝ մուգ շագանակագույնով, իսկ C-Intein-ը՝ բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG և HA պիտակը ցուցադրվում են համապատասխանաբար բաց և մուգ մոխրագույն գույներով: gRNA արտահայտման համար (փիրուզագույն) ընտրվել է U6 պրոմոուտեր (մուգ կանաչ): Շրջված տերմինալի կրկնությունները (ITR) ցուցադրվում են բաց կապույտ և բաց կանաչ գույներով: (Բ եւ Գ) Միայն նուկլազի ակտիվությունը հայտնաբերելի էր, երբ երկու տիպերը կրող երկու rAAV- ն ավելացվեցին AAVS1 TLR/+ (b) կամ Neuro-2a TLR բջիջներին (c): Մասերից միայն մեկի հետ փորձերի ժամանակ նուկլեազի ակտիվությունը չէր տարբերվում բացասական վերահսկողությունից: Ցուցադրված են երեք անկախ փորձերի միջին ± SD:

Ցույց, որ split-intein split-SpCas9 համակարգը կարող է մատուցվել rAAV-ի կողմից: (Ա) Պառակտման – Cas9 rAAV կառուցվածքների ակնարկ (pAAV_crTLR#1_Nv1, pAAV_crTLR#1_Cv1): Բարձր արտահայտություն ապահովելու համար օգտագործվել է կաթնասունների ուժեղ սինթետիկ խթանող (CBh, կանաչ) և խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոն (bGH, կարմիր) պոլիադենիլացման տեղ: Split Cas9 cDNA- ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein- ը `մուգ շագանակագույնով և C-Intein- ը` բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG և HA պիտակը ցուցադրվում են համապատասխանաբար բաց և մուգ մոխրագույն գույներով: ԳՌՆԹ արտահայտման համար (փիրուզագույն) U6 խթանողն ընտրվել է (մուգ կանաչ): Շրջված տերմինալի կրկնությունները (ITR) ցուցադրվում են բաց կապույտ և բաց կանաչ գույներով: (Բ եւ Գ) Միայն նուկլազի ակտիվությունը հայտնաբերելի էր, երբ երկու տիպերը կրող երկու rAAV- ն ավելացվեցին AAVS1 TLR/+ (b) կամ Neuro-2a TLR բջիջներին (c): Միայն երկու խմբերի վրա կատարված փորձերի ժամանակ, նուկլեզային ակտիվությունը չի տարբերվում բացասական վերահսկողությունից: Ownույց են տրված միջոցներ three SD երեք անկախ փորձերի:

Ինտերմիջնորդավորված Cas9 D10A նիկասը ֆունկցիոնալ է և համեմատելի SpCas9 D10A- ի հետ

Հաղորդվել է, որ SpCas9 D10A նիկազները զգալիորեն նվազեցնում են գենոմային թիրախները արհեստական ​​պայմաններում, որը մեծ նշանակություն ունի գենային թերապիայի մեջ CRISPR-Cas9- ի օգտագործման համար (30): Հետևաբար, մենք նախագծեցինք intein միջնորդավորված split–Cas9 համակարգ (Նկար 4ա)՝ համեմատելու դրա արդյունավետությունը HDR-NHEJ հարաբերակցությամբ չփոփոխված SpCas9D10A նիկազի հետ՝ օգտագործելով լուսացույցի ռեպորտաժի բջջային գիծը և երկու gRNAs (crTLR#1 և crTLR#3): (Նկար 1c) և SpCas9 վայրի տիպին: Հետաքրքիր է, որ նիկազներն ավելի բարձր նախապատվություն են տվել HDR-ին, քան վայրի տիպի SpCas9-ը (Նկար 4c)՝ կրճատված NHEJ արժեքներով: Պառակտված-նիկազը նաև կիսում է HDR- ի և NHEJ- ի նույն հարաբերակցությունը, քան SpCas9D10A նիկասը, բայց մի փոքր ընդհանուր ակտիվությամբ ՝ վայրի տիպի համեմատ: Նրա HDR արդյունավետությունը, այնուամենայնիվ, նույնքան արդյունավետ էր, որքան վայրի տիպի SpCas9-ը, բայց զգալիորեն կրճատված NHEJ-ով (Նկար 4c):

Պլազմիդի տրանսֆեկցիայի փորձ SpCas9 վայրի տիպի և նիկազայի համեմատության համար իր համապատասխան բաժանված տարբերակների հետ, և դոնոր ԴՆԹ-ի որպես առանձին պլազմիդի կամ ուղղակիորեն տեղավորված AAV պլազմիդի վրա: (ԱSplit – Cas9 պլազմիդների ակնարկ, որոնք օգտագործվում են SpCas9, SpCas9D10A և դրա պառակտված տարբերակները արտահայտելու համար (Cas9, Cas9D10A, N-Cas9_N-Intein_v1, C-Intein_C-Cas9_v1, gRNA crTLR#1/#2: (Բ) rAAV պլազմիդներ ՝ առանց դոնորական հաջորդականության (pAAV_crTLR#1_Nv1), որը կրում է դոնորի ԴՆԹ-ն ՝ CRISPR կայքերի կողքով (pAAV_crTLR#1_CRISPR-Donor_Nv1) կամ կողային չէ (pAAV_crTLR#1_Donor_NA1) .Cr1V1) CBh խթանողը ցուցադրվում է կանաչ, խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնով (bGH, կարմիր): Split Cas9 cDNA- ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein- ը `մուգ շագանակագույնով և C-Intein- ը` բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG-ը և HA պիտակը համապատասխանաբար ցուցադրվում են բաց և մուգ մոխրագույնով: ԳՌՆԹ արտահայտման համար (փիրուզագույն) U6 խթանողն ընտրվել է (մուգ կանաչ): Շրջված տերմինալի կրկնությունները (ITR) ցուցադրվում են բաց կապույտ և բաց կանաչ գույներով: Դոնոր ԴՆԹ-ի հաջորդականություն (Դոնոր, մուգ կանաչ) (Գ) Կրկնակի նիկավորման ռազմավարությունը՝ SpCas9D10A-ը երկու gRNA-ի հետ համատեղ, ցույց տվեց HDR-ի նախապատվությունը վայրի տիպի համեմատ: Այս էֆեկտը նկատվել է նաև split-SpCas9D10A-ի դեպքում, բայց ակտիվության նվազումով: ԴՆԹ -ի դոնորների տարբեր ռազմավարությունների դեպքում ոչ մի տարբերություն չի նկատվում, բայց դոնորական ԴՆԹ -ի հետ, որը շրջապատված է CRISPR կայքերով, դիտվել է նվազեցված HDR: Ցուցադրված են երեք անկախ փորձերի միջին ± SD:

Պլազմիդի տրանսֆեկցիայի փորձ SpCas9 վայրի տիպի և նիկազայի համեմատության համար իր համապատասխան բաժանված տարբերակների հետ, և դոնոր ԴՆԹ-ի որպես առանձին պլազմիդի կամ ուղղակիորեն տեղավորված AAV պլազմիդի վրա: (ԱSplit – Cas9 պլազմիդների ակնարկ, որոնք օգտագործվում են SpCas9, SpCas9D10A և դրա պառակտված տարբերակները արտահայտելու համար (Cas9, Cas9D10A, N-Cas9_N-Intein_v1, C-Intein_C-Cas9_v1, gRNA crTLR#1/#2: (Բ) rAAV պլազմիդներ ՝ առանց դոնորական հաջորդականության (pAAV_crTLR#1_Nv1), որը կրում է դոնորի ԴՆԹ-ն ՝ CRISPR կայքերի կողքով (pAAV_crTLR#1_CRISPR-Donor_Nv1) կամ կողային չէ (pAAV_crTLR#1_Donor_NA1) .Cr1V1) CBh խթանողը ցուցադրվում է կանաչ, խոշոր եղջերավոր անասունների աճի հորմոնով (bGH, կարմիր): Split Cas9 cDNA- ն ցուցադրվում է նարնջագույնով, N-intein- ը `մուգ շագանակագույնով և C-Intein- ը` բաց շագանակագույնով: NLS (մուգ կարմիր). Միջուկային տեղայնացման ազդանշան: FLAG և HA պիտակը ցուցադրվում են համապատասխանաբար բաց և մուգ մոխրագույն գույներով: gRNA արտահայտման համար (փիրուզագույն) ընտրվել է U6 պրոմոուտեր (մուգ կանաչ): Շրջված տերմինալի կրկնությունները (ITR) ցուցադրվում են բաց կապույտ և բաց կանաչ գույներով: Դոնոր ԴՆԹ-ի հաջորդականություն (Դոնոր, մուգ կանաչ) (Գ) Կրկնակի նիկավորման ռազմավարությունը՝ SpCas9D10A-ը երկու gRNA-ի հետ համատեղ, ցույց տվեց HDR-ի նախապատվությունը վայրի տիպի համեմատ: Այս ազդեցությունը նկատվել է նաև split-SpCas9D10A- ի դեպքում, սակայն ակտիվության նվազման դեպքում: ԴՆԹ -ի դոնորների տարբեր ռազմավարությունների դեպքում ոչ մի տարբերություն չի նկատվում, բայց դոնորական ԴՆԹ -ի հետ, որը շրջապատված է CRISPR կայքերով, դիտվել է նվազեցված HDR: Ownույց են տրված միջոցներ three SD երեք անկախ փորձերի:

Դոնոր ԴՆԹ-ն կարող է տեղավորվել նույն պլազմիդի վրա, որը կոդավորում է split–CRISPR/Cas9 համակարգը։

Շատ ժառանգական հիվանդություններ մոնոգենետիկ են `ծագող համապատասխան գենի կետային մուտացիայից, ինչը, հետևաբար, տեսականորեն կարող է շտկվել, եթե DSB- ի իրադարձությունից հետո տրամադրվի կաղապարի շրջան: Մինչև 5 կբ-ին հասնելը երկվեկտորային համակարգի վրա մնացել է մոտ 0,9 կբ՝ լրացուցիչ հաջորդականություններ ինտեգրելու համար: Այսպիսով, մենք ներառեցինք դոնորային հաջորդականություն split–Cas9 պլազմիդներից մեկի մեջ (Նկար 4b) և փորձարկեցինք դրանց արդյունավետությունը՝ օգտագործելով մեր TLR ռեպորտաժային համակարգը՝ համեմատած դոնորին որպես անկախ պլազմիդ ավելացնելու հետ: Բացի այդ, ստեղծվել են rAAV-վեկտորով կոդավորված վերանորոգման ձևանմուշի երկու տարբերակ. առաջին տարբերակը պարունակում էր դոնորային շրջան, մինչդեռ, երկրորդ տարբերակում, դոնոր շրջանը լրացուցիչ շրջապատված էր CRISPR ճանաչման կայքերով (pAAV_crTLR#1_CRISPR-Donor_Nv1, pAAV_crTL: #1_Նվիրող_վ 1, Նկար 4 բ): Երբ այս համակարգը փորձարկվել է պլազմիդի տրանսֆեկցիայի միջոցով, ոչ թևավոր դոնորի հետ դիտարկված HDR- ի արժեքները համեմատելի էին վայրի տիպի և պառակտված SpCas9 տարբերակների հետ `լրացուցիչ դոնոր պլազմիդի առկայության դեպքում (Նկար 4c): Անկողնային դոնորի դեպքում նուկլեազի ակտիվությունն ավելի ցածր էր: Սա, հավանաբար, կարող է պայմանավորված լինել ԴՆԹ-ի անկայունությամբ SpCas9-ով կտրվելուց հետո (Նկար 4c): Այս արդյունքները կարող են օգտակար լինել գենոմի ճարտարագիտության համար վեկտորային համակարգի նախագծման համար՝ ավելի քիչ թվով պլազմիդներով՝ հեշտացնելով դրանց բոլորի տրանսֆեկցիան:


Ինտեիններ

Շատ դեպքերում, յուրաքանչյուր գեն կոդավորում է մեկ սպիտակուց, բայց բջիջները գտել են այս սահմանափակման շուրջ ուղիներ: Վիրուսներն իրենց փոքրիկ գենոմներով հաճախ պարունակում են երկար պոլիպրոտեիններ կոդավորող գեներ, որոնք այնուհետև ֆերմենտների միջոցով մանրացված են մի քանի ֆունկցիոնալ կտորների: Ինտինները մեկ այլ գենից բջիջների մի քանի սպիտակուցներ պատրաստելու միջոց են: Ինտինի առաջին օրինակը հայտնաբերվել է խմորիչ վակուոլային ATPase- ում (այստեղ ցուցադրված է BՀԳ 1jva մուտքից): Գենը կոդավորում է ATPase սպիտակուցը մեջտեղում ներկառուցված լրացուցիչ սպիտակուցի հետ միասին: Այս ներկառուցված սպիտակուցը կոչվում է ան ինտեին (պատկերված է այստեղ կանաչով), և ATPase- ի երկու կեսերը կոչվում են exteins (այստեղ ցույց է տրված կարմիր և կապույտ գույներով. ուշադրություն դարձրեք, որ այս կառուցվածքը ներառում է էքստրեյնների միայն մի փոքր մասը): Երբ սպիտակուցը պատրաստվում է, ինտեինը միանում է իրեն շղթայից և միացնում երկու էքստեինները ՝ ստեղծելով ֆունկցիոնալ ATPase:

Տնային էնդոնուկլեազներ

Շատ ինտեիններ ներառում են երկու մաս. Մի հատված, որը միավորում է ինտինը ամբողջ սպիտակուցային շղթայից և մի հատված, որը գործում է որպես ԴՆԹ-կտրող ֆերմենտ: Այս ֆերմենտը հաճախ կոչվում է ա տնային էնդոնուկլազիա քանի որ այն պարունակում է ԴՆԹ, որը չի կոդավորում ինտեինը: Տնային էնդոնուկլեազները գործում են որպես եսասեր գենետիկական տարրեր ՝ գեների տարբեր պատճենների միջև իրենց տարածելու ստոր մեթոդով: Նրանք չեն հարձակվում գեների վրա, որոնք արդեն իսկ կոդավորում են ինտեինները, բայց առանց դրանց բաժանում են գեները: Այնուհետև, բջջի նորմալ վերականգնման մեխանիզմը կշտկի խզումը, բայց որպես ձևանմուշ օգտագործելով ինտեյն-ներառյալ գենը: Այսպիսով, երբ վնասը շտկվում է, գենին մնում է ինտին: Այնուամենայնիվ, սա խնդիր չէ, քանի որ ինտեյնը պատրաստվում է սպիտակուցից:

Ինտեինները լաբորատորիայում

Ինտեինները սպիտակուցների միացման մոդուլային մեքենաներ են և, հետևաբար, օգտակար են եղել կենսատեխնոլոգիայի համար: Աշխատանքային ինտինները մեկուսացվել են բջիջներից, այնուհետև մշակվել են նոր սպիտակուցների մեջ ՝ որոշակի գործառույթների համար ինքնալարող սպիտակուցներ ստեղծելու համար: Օրինակ, ինժեներական ինտեինները օգտագործվել են պեպտիդները միացնելու համար տարբեր տեսակի պիտակներով՝ օգնելու NMR փորձերին, կամ սպիտակուցին ոչ բնական ամինաթթուներ ավելացնելու կամ նույնիսկ սպիտակուցները քվանտային կետերին միացնելու համար: Ինտինները նույնպես օգտագործվել են շղթայի երկու ծայրերը միացնելու համար ՝ ստեղծելով ցիկլային սպիտակուց:

Մեծ ու Փոքր

Ոչ բոլոր ինտեինները ներառում են տնային նուկլեյզա: Որոշ ձևեր, որոնք կոչվում են mini-inteins, ներառում են միայն միացման հատվածը: Յուրաքանչյուրի օրինակները ներկայացված են այստեղ: Ձախ կողմում տիպիկ խոշոր ինտեին է, որն իր մեջ ներառում է տնամերձ էնդոնուկլեազ, որն այստեղ ցուցադրված է իր սպիտակուցից միացված և կապված ԴՆԹ-ի հետ (PDB մուտք 1lws): Աջ կողմում տեղադրված է մինի-ինտեին, որը հայտնաբերված է միկոբակտերիալ գիրազայի գենի մեջ (BՀԳ մուտք 1am2): Այն ներառում է ընդամենը այնքան սպիտակուց, որը կարող է կատարել միացման ռեակցիան:

Կառուցվածքի ուսումնասիրություն

Վակուոլային ATPase intein- ի երկու կառույցներ ցույց են տալիս սպիտակուցը դրա միացման ռեակցիայի առաջ և հետո: Երկու դեպքում էլ կատալիտիկ ամինաթթուներից մի քանիսը մուտացիայի ենթարկվեցին ռեակցիան դանդաղեցնելու համար, որպեսզի կառուցվածքը լուծվեր: PDB գրառումը 1jva (ձախ) ցույց է տալիս ինտեինը (կանաչ) արձագանքից առաջ, կցված է exteins- ի փոքր հատվածներով (կարմիր և կապույտ): PDB մուտքագրում 1um2 (աջ) արձագանքից հետո է, և երկու էքստեյնները միացված են միասին: In the actual protein, the exteins are much larger, and when joined they form part of a large proton pump. To compare these two structures in more detail, click on the image for an interactive Jmol.

Topics for Further Discussion

  1. Structures are available for many different inteins. Can you find them in the PDB? Do the structures include the homing endonuclease, or are they mini-inteins?
  2. Do the structures include portions of the exteins? Why is it difficult to determine structures that include exteins?

Related PDB-101 Resources

Հղումներ

  1. S. Elleuche and S. Poggeler (2010) Inteins, valuable genetic elements in molecular biology and biotechnology. Applied Microbiology and Biotechnology 87, 479-489.
  2. Y. Anraku and Y. Satow (2009) Reflections on protein splicing: structures, functions and mechanisms. Proceedings of the Japan Academy, Series B, 85, 409-421.
  3. Y. Anraku, R. Mizutani and Y. Satow (2005) Protein splicing: its discovery and structural insight into novel chemical mechanisms. IUBMB Life 57, 563-574.

November 2010, David Goodsell

About PDB-101

PDB-101 helps teachers, students, and the general public explore the 3D world of proteins and nucleic acids. Learning about their diverse shapes and functions helps to understand all aspects of biomedicine and agriculture, from protein synthesis to health and disease to biological energy.

Why PDB-101? Researchers around the globe make these 3D structures freely available at the Protein Data Bank (PDB) archive. PDB-101 builds introductory materials to help beginners get started in the subject ("101", as in an entry level course) as well as resources for extended learning.


BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

The present invention provides robust split inteins and methods of using the same. The split inteins are active over a large temperature range, over a wide pH range, and in the presence of chaotropic salts. They also show high tolerance to sequence variability in fused heterologous polypeptides. These features make the split inteins especially useful in protein purification and engineering techniques.

In particular, fusion proteins comprising (i) an intein domain at least 75% identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 16, 24, 38 and 65 and (ii) a heterologous polypeptide, wherein the heterologous polypeptide is C-terminal to the intein domain are provided. In some embodiments, the last amino acid of the intein domain is asparagine or glutamine. In some embodiments, the last amino acid of the intein domain is an amino acid other than asparagine or glutamine, e.g., an alanine In some embodiments, the penultimate amino acid of the intein domain is an amino acid other than histidine. In some embodiments, the heterologous polypeptide is directly linked to the intein domain via a peptide bond. In some embodiments, the first amino acid of the heterologous polypeptide is serine, cysteine, or threonine. In some embodiments, the last amino acid of the intein domain is an amino acid other than asparagine or glutamine, e.g., an alanine and the first amino acid of the heterologous polypeptide is other than serine, threonine or cysteine, e.g. alanine In some embodiments, the fusion protein further comprises a linker between the heterologous polypeptide and the intein domain. In some embodiments, the first amino acid of the linker is serine, cysteine, or threonine. In some embodiments, the first amino acid of the linker is an amino acid other than serine, cysteine, or threonine, i.e an alanine In some embodiments, the last amino acid of the intein domain is an amino acid other than asparagine or glutamine, e.g., an alanine and the first amino acid of the linker is an amino acid other than serine, threonine or cysteine. e.g an alanine In some embodiments, the linker comprises 1-5 amino acids of a native extein sequence. Fusion proteins comprising an intein domain having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 16, 24, 38 and 65 and (ii) a heterologous polypeptide, wherein the heterologous polypeptide is C-terminal to the intein domain are also provided.

In addition, fusion proteins comprising (i) an intein domain at least 75% identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 12, 20, 34 and 64 and (ii) a heterologous polypeptide, wherein the heterologous polypeptide is N-terminal to the intein domain are provided. In some embodiments, the first amino acid of the intein domain is a cysteine. In some embodiments, the first amino acid of the intein domain is an amino acid other than serine or cysteine, e.g., an alanine In some embodiments, the heterologous polypeptide is directly linked to the intein domain via a peptide bond. In some embodiments, the fusion protein further comprises a linker between the heterologous polypeptide and the intein domain. In some embodiments, the linker comprises 1-5 amino acids of a native extein sequence. Fusion proteins comprising an intein domain having a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 12, 20, 34 and 64 and a heterologous polypeptide, wherein the heterologous polypeptide is N-terminal to the intein domain are also provided.

Furthermore, fusion proteins comprising a first intein domain, a second intein domain, and a heterologous polypeptide are provided. Furthermore, fusion proteins comprising a first intein domain, a second intein domain, and a heterologous polypeptide are provided wherein the heterologous polypeptide is N-terminal to the first intein domain, and the heterologous polypeptide is

C-terminal to the second intein domain. Furthermore, fusion proteins comprising a first intein domain, a second intein domain, and a heterologous polypeptide are provided wherein the heterologous polypeptide is N-terminal to the first intein domain (N-terminal splicing domain), and the heterologous polypeptide is C-terminal to the second intein domain (C-terminal splicing domain). In some embodiments, (a) the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:3 and the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:7 (b) the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:12 and the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:16 (c) the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID

NO:20 and the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:24 (d) the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:34 and the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:38 or (d) the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:64 and the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:65. In some embodiments, the first amino acid of the heterologous polypeptide is serine, cysteine, or threonine. In some embodiments, the fusion protein further comprises a linker between the heterologous polypeptide and the second intein domain, wherein the first amino acid of the linker is serine, cysteine, or threonine. In some embodiments, the first amino acid of the linker is serine.

Polynucleotides encoding the fusion proteins according to the invention are also provided herein.

Compositions comprising fusion proteins are also provided. Such compositions are useful, for example, for C-terminal cleavage reactions, N-terminal cleavage reactions, trans-splicing reactions, and protein-cyclization methods.

Host cells comprising the proteins, fusion proteins, polynucleotides, or compositions are also provided.

Methods of using polypeptides and fusion proteins provided herein in, for example, C-terminal cleavage reactions, N-terminal cleavage reactions, trans-splicing reactions, and protein-cyclization are provided. Such methods can occur at temperatures of about 0° C. to about 60° C. at a pH of about 6 to about 10 , and/or in the presence of about 0.5 M to about 6 M urea.

In some embodiments, the reaction rate constant of the reactions provided herein is at least about 1×10 −1 s− 1 , or at least about 2×10 −1 s− 1 . In some embodiments, the reaction rate half-life is less than about 100 seconds, less than about 50 seconds, or less than about 25 seconds or less than about 15 seconds.

The reactions can be initiated, for example, by a shift in temperature or pH or mixing proteins.

The invention also provides a vector which comprises a polynucleotide encoding an intein domain at least 75% identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7, 16, 24, 38 and 65 and at least a cloning site downstream of said polynucleotide which allows the cloning of a polynucleotide of interest such that a polynucleotide is formed which encodes a fusion protein comprising the intein domain and the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest.

The invention also provides a vector which comprises a polynucleotide encoding an intein domain at least 75% identical to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 12, 20, 34 and 64 and at least a cloning site upstream of said polynucleotide which allows the cloning of a polynucleotide of interest such that a polynucleotide is formed which encodes a fusion protein comprising the polypeptide encoded by the polynucleotide of interest and the intein domain.

    • ա if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:7, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:3
    • բ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:16 then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:12
    • գ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:24, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:20
    • դ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:38, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:34.
      • ա if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:7, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:3
      • բ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:16 then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:12
      • գ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:24, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:20
      • դ. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:38, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:34 or
      • ե. if the first intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:65, then the second intein domain is at least 75% identical to SEQ ID NO:64.

      From the Back Cover

      This volume focuses on applications of split inteins, and the progress that has been made in the past 5 years on discovery and engineering of fast and more efficient split inteins. The first few chapters in Split Inteins: Methods and Protocols explore new techniques on how to use split inteins for affinity purification of overproduced proteins, and split-intein based technologies to prepare cyclic peptides and proteins. The next few chapters discuss semisynthetic protein trans-splicing using one synthetic intein piece, synthetic intein-extein pieces used to deliver other cargos for chemical modification both of purified proteins and of proteins in living cells, as well as isotopic labeling of proteins for NMR studies, and a discussion on how protein block copolymers can be generated by protein trans-splicing to form protein hydrogels. The last few chapters deal with intein applications in transgenic plants and conditional inteins that can be regulated in artificial ways by small molecules or light, a cassette-based approach to quickly test many intein insertion positions, and a computational approach to predict new intein split sites (the approach also works for other proteins). Written in the highly successful Methods in Molecular Biology series format, chapters include introduction to their respective topics, lists of the necessary materials and reagents, step-by-step, readily reproducible laboratory protocols, and tips on troubleshooting and avoiding known pitfalls.

      Cutting-edge and thorough, Split Inteins: Methods and Protocols is a valuable resource that will provide guidance toward possibilities of split intein applications, explore proven and detailed protocols adaptable to various research projects, and inspire new method developments.


      Group I Introns and Inteins: Disparate Origins but Convergent Parasitic Strategies

      FIG. 1. (A) Predicted secondary structure of a group I intron (Cbu.L1951) (93). Paired, conserved helices common to group I introns are designated P1 to P10. The 5′- and 3′-terminal intron bases are encircled. The intron sequence is in uppercase 5′ and 3′ exons are in lowercase and colored red and blue, respectively. P1 and P10 together form the IGS. The site of HE insertion in P8 is indicated in green. (B) Mechanism of group I intron splicing (110). 5′ and 3′ exons are in red and blue, respectively. ΩG, terminal intron guanine. G*, exogenous guanosine. (Step 1) Nucleophilic attack on the 5′ splice site by the 3′-OH of G* in GBS. (Step 2) Nucleophilic attack on the 3′ splice site by the free 3′-OH of the 5′ exon. (Step 3) Free intron and spliced exons. FIG. 2 . (A) Intein modular structure (87, 90). An intein with flanking exteins is shown. The N- and C-terminal splicing domains and the optional HE domain with their conserved motifs are shown. Conserved amino acids Cys or Ser at the 5′ end of the intein, Asn at the 3′ end of the intein, and Cys, Ser, or Thr at the first position on the 3′ extein are also indicated. (B) Intein splicing chemistry (39, 87). N and C exteins are in red and blue, respectively. FIG. 3 (A) Intein or group I intron homing through HE-mediated DNA double-strand-break repair and recombination. (B) Cycle model of HE gain, degeneration, and loss within host populations (37, 38, 39). FIG. 4 . Convergence of evolutionary paths of group I introns, inteins, and HEs.

      Supporting information

      S1 Fig

      (A) A phylogenetic tree of Prp8 inteins was reconstructed based on an amino acid multiple sequence alignment of the splicing blocks (A, B, F, G) using the NJ algorithm and an interior-branch test with 1,000 replicates. Fifty representatives covering Prp8 intein diversity were selected, and the full name of each intein-containing organism is listed. Colored symbols represent the insertion site and correspond to colors in Fig 1A . Letters (a1, a2, b, c, d, e, f, g) represent each of the 7 unique insertion sites. (B) A phylogenetic tree of Prp8 inteins was reconstructed based on an amino acid multiple sequence alignment of the splicing blocks (A, B, F, G) using the ML method and evaluated with SH-aLRT. The substitution model, WAG+G+I, was selected using ProtTest 3 (https://github.com/ddarriba/prottest3). ML tree follows the same formatting as in panel A and shows similar architecture as NJ tree. Amoebo, Amoebozoa Asco, Ascomycota Basidio, Basidiomycota Blasto, Blastocladiomycota Choano, Choanoflagellida Chloro Viridipl, Chlorophyta Viridiplantae Chytridio, Chytridiomycota ML, maximum likelihood Mucoro, Mucoromycota NJ, neighbor-joining Opistho, Opisthokonta Prp8, pre-mRNA processing factor 8 SH-aLRT, Shimodaira–Hasegawa nonparametric approximate likelihood-ratio test

      S2 Fig

      Comparative analysis of amino acid residues found in Blocks A, B, F, and G from the selected 50 representative Prp8 inteins, shown with abbreviated species names (full names in S1 Fig). Letters (a1, a2, b, c, d, e, f, g) represent each of the 7 unique insertion sites. Shading is as follows: black, identical amino acid dark gray, conserved amino acid light gray, similar amino acid substitution. Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S3 Fig

      In the amoeba Asu, an intein was identified at a new site in Prp8, here termed g. This is the seventh site in which a Prp8 intein has been found. The full site g intein sequence is shown, plus 10 flanking N-extein (blue) and C-extein (green) amino acids. The Asu C1 (yellow) and terminal asparagine (red) are highlighted. Residue numbering corresponds to the Asu Prp8 exteins. Accession number: XP_0127532. Asu, Acytostelium subglobosum Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S4 Fig

      (A) A phylogenetic tree of Prp8 exteins corresponding to inteins (see S1 Fig) was reconstructed based on an amino acid multiple sequence alignment using the NJ algorithm and an interior-branch test with 1,000 replicates. Extreme conservation among Prp8 exteins is observed along with grouping by host organism phylogeny. Colored symbols represent the intein insertion site of the exteins and correspond to colors in Fig 1A . Letters (a1, a2, b, c, d, e, f, and g) represent each of the 7 unique insertion sites. Phylum abbreviations are listed in the S1 Fig legend. (B) A phylogenetic tree of Prp8 exteins was reconstructed based on an amino acid multiple sequence alignment of the splicing blocks (A, B, F, G) using the ML method and evaluated with SH-aLRT. The substitution model, LG+G, was selected using ProtTest 3 (https://github.com/ddarriba/prottest3). Tree follows the same formatting as in panel A. ML, maximum likelihood NJ, neighbor-joining Prp8, pre-mRNA processing factor 8 SH-aLRT, Shimodaira–Hasegawa nonparametric approximate likelihood-ratio test.

      S5 Fig

      (A) Overlay of the Sce VMA1 intein and Cne Prp8 intein active sites. The Sce VMA1 intein (cyan, PDB 1GPP) was overlaid with the Cne Prp8 intein (red). The active site residues, crucial to protein splicing, are shown as sticks and labeled. A majority of these conserved residues overlap exactly, such as the catalytic C1, and the Block B TxxH motif. The Sce VMA1 intein uses an asparagine (N76) rather than threonine in the TxxH motif, but the positioning is similar to the threonine (T62) of the Cne Prp8 intein. The penultimate histidines (H170 and H453) are in comparable positions except for the side chains, whose chi angles are different by 45°. The Sce VMA1 intein was not solved with the terminal asparagine. (B) Structural comparison of bacterial Mtu RecA intein and fungal Cne Prp8 intein. Overlay of the Mtu RecA intein (brown, PDB 2IMZ), and the Cne Prp8 intein (red) reveals structural similarities in major intein features, such as the anti-parallel β-sheet folding, that contribute to the horseshoe shape. The Hint domain, comprised of splicing Blocks A, B, F, and G, are generally aligned between the 2 inteins. The structures deviate at sequences between Blocks B and F, where the Cne Prp8 intein encoded a linker or endonuclease domain. The 2 structures have an RMSD value of 2.22 Å. Cne, Գ. neoformans Mtu, Mycobacterium tuberculosis PDB, Protein Data Bank Prp8, pre-mRNA processing factor 8 RMSD, Root-mean-square deviation Sce, Saccharomyces cerevisiae

      S6 Fig

      (A) Diverse Prp8 intein splicing patterns. Several Prp8 inteins from other fungal pathogens Afu, Bde, և Hca were cloned into MIG. Splicing was observed over time by the loss of precursor (P) and increase in LE, or simply by the presence of ligated exteins (for Afu): The gel shows that not all Prp8 inteins splice similarly, despite being placed in an identical extein context. (B) Precursor amounts vary greatly. A quantitation of precursor (P) at each time point shows that these Prp8 inteins are active but splice at variable rates. The Afu Prp8 intein is almost entirely spliced at the start of the assay (0 h), whereas Bde has 31% precursor at 0 h and Hca has 14% precursor at 0 h. Initial splicing rates were determined by calculating the loss of precursor over time (Pt0−Pt1/60 min) with standard error for MIG Bde Prp8 and MIG Hca Prp8, and are (5.9 ± 0.4) × 10 𢄢 % per min and (2.7 ± 0.9) × 10 𢄢 % per min, respectively. This suggests intein-mediated control of protein splicing. Data are representative of 3 biological replicates and mean standard deviations are shown. Trend lines are fit to show the decay curve. Data available in S1 Data. Afu, Aspergillus fumigatus Bde, Batrachochytrium dendrobatidis Hca, Histoplasma capsulatum LE, ligated exteins MIG, MBP-Intein-GFP Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S7 Fig

      (A) Copper treatment causes inhibition. Induced MIG Prp8 A-1V cells were lysed and treated with 0 or 1 mM CuSO4. The lysates were incubated for the indicated time at 30ଌ and then frozen. Samples were separated on SDS-PAGE and scanned for GFP fluorescence. In the absence of copper, MIG Prp8 A-1V spliced well over 30 h, converting P into LE. There was little to no conversion of P to LE over time with copper addition. Quantitation is shown below in a stacked plot. Data are representative of 3 biological replicates and mean standard deviations are shown. Data available in S1 Data. (B) Relative position of 2 cysteines. There are only 2 cysteines present in the Cne Prp8 intein. Using the solved structure, a measurement of the distance between C1 and C61 (shown as sticks) was calculated to be 8.9 Å. (C) Valine is the preferred residue at position 61. A sequence logo was constructed of Block B from the 50 representative Prp8 inteins (S1 Fig). This shows absolute conservation of the histidine (position 10) and a strong preference for threonine (position 7) in the TxxH motif. However, the Block B cysteine (position 6, red box) is not highly conserved across Prp8 inteins, and most encode valine at this site. Cne, Գ. neoformans GFP, green fluorescent protein LE, ligated exteins MIG, MBP-Intein-GFP P, precursor Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S8 Fig

      (A) Mutations to C61 in MIG Prp8 A-1V slow down splicing. The B block C61 was mutated to valine (C61V), alanine (C61A), and serine (C61S), and splicing was observed over time in MIG. Initial splicing rates were determined by calculating the loss of precursor over time (Pt0−Pt1/60 min) with standard error and are as follows: WT, (1.01 ± 0.07) × 10 𢄡 % per min C61V, (1.07 ± 0.08) × 10 𢄡 % per min C61A, (6.22 ± 0.50) × 10 𢄢 % per min, and C61S, (2.92 ± 1.04) × 10 𢄢 % per min. The C61V mutant splices similarly to WT, whereas C61A and C61S are slower. A quantitation is shown to the right with the amount of precursor (P) at each time point. Data are representative of 3 biological replicates and mean standard deviations are shown. Trend lines are fit to show the decay curve. Data available in S1 Data. (B) MIG Prp8 A-1V B block cysteine mutants are inhibited by copper. To test whether copper inhibition was caused by C1 oxidation, C61 mutants were treated with CuSO4. After induction of MIG, the cells were lysed, and 1 mM CuSO4 was added. The lysates were incubated at 30ଌ, and aliquots were collected at the indicated time. Samples were run on SDS-PAGE and scanned for GFP fluorescence. None of the C61 mutants show an increase in LE over time, with little loss of precursor (P). This indicates that at least C1 oxidation by copper is sufficient to cause the observed splicing inhibition and that disulfide bonds are not involved. Quantitation is shown below in a stacked plot. Data are representative of 3 biological replicates, and mean standard deviations are shown. Data available in S1 Data. GFP, green fluorescent protein LE, ligated exteins MIG, MBP-Intein-GFP Prp8, pre-mRNA processing factor 8 WT, wild type.

      S9 Fig

      (A) Intact Cne Prp8 intein shows small mass shift. Purified Cne Prp8 intein was untreated or treated with 10× excess copper and separated and analyzed using LC-MS. The peaks were deconvoluted, and the expected mass of the Prp8 intein, 19,588 Da, is seen as the largest peak. A small, 32 Da shift (19,620 Da) was visible with both no treatment and copper treatment only (arrow). This suggests that highly reactive cysteines are modified by atmospheric oxygen alone. (B) C1 and C61 are oxidized with copper treatment. Trypsin-digested fragments of copper-treated Cne Prp8 intein were separated and sprayed using LC-MS/MS (insets). Peptides (red peaks) containing C1 or C61 were detected and further analyzed using multiple reaction MIDAS to confirm the identity and location of oxidation. The chromatogram shows elution time for both cysteines consistent with a single additional oxygen or a sulfenic acid modification. Cne, Գ. neoformans LC-MS, liquid chromatography-mass spectrometry LC-MS/MS, liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry MIDAS, monitoring-initiated detection and sequencing Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S10 Fig

      The 7 unique insertion sites (a–g) were mapped to a solved structure of Prp8 from a Ս. cerevisiae C complex spliceosome (PDB 5GMK, chain A from Wan and colleagues, 2016) by locating the +1 residue. This Prp8 structure was used because the insertion sites are all resolved. The +1 residues are shown as red spheres and labeled a through g. Most Prp8 inteins localize close to the active center of Prp8. Some insertions are in the N-terminal domain, which provides structural integrity to the spliceosome. A corresponding line diagram of Prp8 exteins shows the domains of the host protein from amino acid residues 127 to 2084 with arrows indicating the site of intein insertion with the residue number and insertion site letter. The domains are as follows: N-terminal domain, gray RT Palm/Finger, dark blue Thumb/X, light blue linker, green endonuclease, yellow and RNase H-like, orange. PDB, Protein Data Bank Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S11 Fig

      The Prp8 intein-containing Prp8 precursor model was docked into a cryo-EM tri-snRNP structure from Sce (PDB 5GAN) to look for intein-spliceosome disruptions. Prp8 is shown as lavender, and the Prp8 intein is shown as red, and the rest of the tri-snRP components are colored by chain. This reveals that the Prp8 intein would occupy a relatively crowded, centralized location of the tri-snRNP (circled). The intein clashes are shown here (with labels) and noted in Fig 7B . Cne, Գ. neoformans cryo-EM, cryogenic electron microscopy PDB, Protein Data Bank Prp8, pre-mRNA processing factor 8 Sce, Ս. cerevisiae tri-snRNP, triple small nuclear ribonucleoprotein.

      S1 Table

      A list of bacterial strains used for various cloning, overexpression, and purification studies is provided. Strains of fungi and yeast used for in vivo studies are also listed.

      S2 Table

      A list of MIG constructs and purification vectors with corresponding backbones are provided. MIG, MBP-Intein-GFP.

      S3 Table

      Primers used for the construction of various vectors or for the mutation of plasmids are provided.

      S4 Table

      Data collection, refinement statistics, and model details for (A) the unbound and (B) the Zn 2+ -bound Cne Prp8 intein crystal structures. Cne, Գ. neoformans Prp8, pre-mRNA processing factor 8

      S1 Data

      Individual numerical values that underlie any graphs (Figs ​ (Figs4B, 4B , ​ ,4C, 4C , ​ ,5A, 5A , ​ ,5B, 5B , and S6B, S7A, S8A and S8B Figs) are provided in separate sheets. Values were calculated from biological triplicate gel images using ImageJ software. Levels of precursor (P), LE, and OPC products are given out of a total of 100. Some graphs use percent precursor as a proxy for splicing. Time points are indicated. LE, ligated exteins MIG, MBP-Intein-GFP OPC, off-pathway cleavage Prp8, pre-mRNA processing factor 8


      Suffix: -dactyl

      Adactyly (a - dactyl - y) - a condition characterized by the absence of fingers or toes at birth.

      Anisodactyly (aniso - dactyl - y) - describes a condition in which corresponding fingers or toes are unequal in length.

      Artiodactyl (artio - dactyl) - even-toed hoofed mammals which include animals such as sheep, giraffes, and pigs.

      Brachydactyly (brachy - dactyl - y) - a condition in which fingers or toes are unusually short.

      Camptodactyly (campto - dactyl - y) - describes the abnormal bending of one or more fingers or toes. Camptodactyly is usually congenital and most often occurs in the little finger.

      Clinodactyly (clino - dactyl - y) - of or relating to the curvature of a digit, whether a finger or a toe. In humans, the most common form is the smallest finger curving toward the adjacent finger.

      Didactyl (di - dactyl) - an organism that only has two fingers per hand or two toes per foot.

      Ectrodactyly (ectro - dactyl - y) - a congenital condition in which all or part of a finger (fingers) or toe (toes) is missing. Ectrodactyly is also known as a split hand or split foot deformity.

      Hexadactylism (hexa - dactyl - ism) - an organism that has six toes per foot or six fingers per hand.

      Macrodactyly (macro - dactyly) - possessing overlay large fingers or toes. It is typically due to an overgroth of bone tissue.

      Monodactyl (mono - dactyl) - an organism with only one digit per foot. A horse is an example of a monodactyl.

      Oligodactyly (oligo - dactyl - y) - having fewer than five fingers on the hand or five toes on the foot.

      Pentadactyl (penta - dactyl) - an organism with five fingers per hand and five toes per foot.

      Perissodactyl (perisso - dactyl) - odd-toed hoofed mammals such as horses, zebras, and rhinoceroses.

      Polydactyly (poly - dactyl - y) - the development of extra fingers or toes.

      Pterodactyl (ptero - dactyl) - an extinct flying reptile that had wings covering an elongated digit.

      Syndactyly (syn - dactyl - y) - a condition in which some or all of the fingers or toes are fused together at the skin and not bone. It is commonly referred to as webbing.

      Zygodactyly (zygo - dactyl - y) - a type of syndactyly in which all the fingers or toes are fused together.


      Դիտեք տեսանյութը: Թոզ են փչում ժողովրդի աչքին. քաղաքացիները վերջին պաշտոնանկությունների մասին (Դեկտեմբեր 2021).