Տեղեկատվություն

Բետա-լակտամազի արտահայտությունը կապող կլանման հետ

Բետա-լակտամազի արտահայտությունը կապող կլանման հետ


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Երբ հեղուկ միջավայրում պենիցիլինի դիմացկուն բակտերիաներ են աճում, β- լակտամազը արտազատվում է միջավայրում: Նման միջավայրի վերին նյութը կարող է որոշվել β-լակտամազային ակտիվության համար: Ստացվել են տարբեր օրգանիզմներ, որոնց կասկածում են պենիցիլինի դիմացկուն լինելու համար, և հետազոտվել են β-lactamase գործունեության համար: Համապատասխան կլանման արժեքը չափվել է որոշակի ալիքի երկարությամբ:

Ենթադրենք, որ օրգանիզմի 1 -ի կուլտուրաներն ունեն X- ի, իսկ 2 -ը `Y- ի կլանման արժեք:

Իմ հարցը. Եթե X> Y, արդյո՞ք դա նշանակում է, որ ավելի շատ β-լակտամազ է արտադրվում 1 օրգանիզմի կողմից:


β-լակտամազային թեստի ժամանակ մշակման միջավայրի նմուշին ավելացվում է β-լակտամազի ինհիբիտոր: Արգելակիչը կապվում է ֆերմենտին և փոխում նրա գույնը, որն ուղղակիորեն կապված է β-լակտամազի կոնցենտրացիայի հետ։ Ավելի շատ β-լակտամազա նշանակում է ավելի շատ արգելակիչների միացում, և դա հանգեցնում է ավելի շատ գույնի զարգացման, ինչը հանգեցնում է ավելի բարձր կլանման: Այսպիսով, ավելի մեծ կլանումը նշանակում է ավելի շատ β- լակտամազ `գերեզմանում:


Բետա լակտամազ TEM 1

-Ի TEM-1 β-lactamase- ը Ե. coli պլազմիդ pBR322 բաղկացած է 286 ամինաթթուների մնացորդներից (Mr 28,500) ( 41, 42 ). (Նշում: A դասի β- լակտամազներն ունեն միջին չափս 25–30 kDa, ակտիվ են որպես մոնոմերներ և չեն պարունակում ածխաջրեր կամ կոֆակտորներ:) Առաջին 23 ամինաթթուների շրջանը (մնացորդներ 3–25) ազդանշանային պեպտիդ է և չի հայտնվում հասուն ֆերմենտը. Հասուն ֆերմենտն ունի His և Trp ՝ համապատասխանաբար որպես N- տերմինալ (ABL 3) և C- տերմինալ (ABL 290) մնացորդներ:

Հասուն TEM β-lactamase- ն պարունակում է Cys- ի երկու մնացորդ (C77, C123): Նրանք կազմում են դիսուլֆիդային կամուրջ, որը եզակի է Ա դասի ֆերմենտների մեջ: Ֆերմենտը չի արգելվում PCMB- ի կամ IAA- ի կողմից: Դիսուլֆիդային կապի վերացումը տեղամասային մուտագեն փոխարինման միջոցով (Cys-77–Ser) չի ազդում կատալիտիկ ակտիվության և սպիտակուցի կայունության վրա 40°C-ից ցածր ջերմաստիճանում (11): Cys-ի երկու մնացորդների փոխարինումը Ala-ով (Cys-Ala կրկնակի մուտանտ) չի ազդում ծալման գործընթացի և գործունեության վրա. պարզվել է, որ կինետիկ պարամետրերը նման են վայրի տիպի ֆերմենտի (43): Վայրի տիպի β-lactamase- ի դեպքում, սակայն, օպտիմալ ծալումը տեղի է ունենում շատ օքսիդացնող պայմաններում, օրինակ ՝ & lt0.4 մՄ գլուտատիոն (GSH) և 4-8 մՄ GSSG (օքսիդացված GSH), որը հակադրվում է էուկարիոտիկ սպիտակուցներին (օրինակ ՝ խոշոր եղջերավոր ենթաստամոքսային գեղձի RNase), որոնք օպտիմալ ծալման համար նվազեցնող միջավայր են պահանջում, այսինքն ՝ 1 մՄ GSH և 0.2 մ GSSG (44):

TEM β-լակտամազը կոդավորված է բլա pBR322 գենի վրա Gln- ը 39-րդ տեղում է: Այս ֆերմենտը կոչվում է TEM-1 β-lactamase և ունի pԵս 5.4-ից (28, 45): TEM-2 β-lactamase- ը նույնական է TEM-1 ֆերմենտի հետ, բացառությամբ, որ այն ունի Lys-39 և pԵս արժեքը 5.6 (46):

Այժմ TEM-ի β-լակտամազների ընտանիքում կա ավելի քան 15 անդամ, որոնք տարբերվում են TEM-1 նախատիպից մեկ կամ մի քանի ամինաթթուներով: Β-lactamase- ի տարանջատման ենթակա մնացորդները ներառում են Gln-39 (Q39K), Glu-104 (E104K), Arg-164 (R164S), Gln-205 (Q205L), Ala-237 (A237T), Gly-238 (G238S) , և Glu-240 (E240K) (47): Այս TEM-1 տարբերակները, որոնք կոչվում են երկար սպեկտրի β- լակտամազներ, ցուցադրում են տարբեր աստիճանի ենթաշերտի փոփոխված առանձնահատկություններ, որոնք բնութագրվում են դասական β- լակտամների նկատմամբ գործունեության նվազեցմամբ (օրինակ ՝ բենզիլպենիցիլին) և α-մեթոքսի- և օքսիիմինո- β- լակտամների նկատմամբ ակտիվության աճով: Վերոնշյալ մնացորդների տեղաբաշխման հատուկ փոխարինումները, ընդհանուր առմամբ, հաստատում են սուբստրատի պրոֆիլների փոփոխությունը դեպի նոր սերնդի β- լակտամ հակաբիոտիկներ:


Նպատակը: Բացահայտել գենային արտահայտման պրոֆիլները, որոնք հատուկ են մարդու բջիջների ռադիոկայունությանը:

Մեթոդներ և նյութեր. Ընդհանուր առմամբ 15 ուռուցքային և նորմալ ֆիբրոբլաստային բջիջների գենային արտահայտման պրոֆիլները վերլուծվել են ԴՆԹ -ի միկրոզանգվածների և վիճակագրական խմբավորման մեթոդների միջոցով: Սկզբում բջջային գծերից վեցը դասակարգվել են ռադիոդիմացկուն (RG) կամ ոչ ռադիոդիմացկուն (NRG) խմբերի՝ ըստ ճառագայթման չափաբաժնի, որն անհրաժեշտ է նրանց գոյատևումը մինչև 10% նվազեցնելու համար (D):10) Գեները, որոնց արտահայտությունը հատուկ էր յուրաքանչյուր խմբին ճառագայթումից 1 կամ 3 ժամ հետո, հայտնաբերվեցին վիճակագրական ընթացակարգերի միջոցով, ներառյալ շեղման վերլուծությունը և երկչափ հիերարխիկ խմբավորման մեթոդը: Մնացած ինը բջջային տողերը ենթարկվեցին k- մոտակա հարևանների օրինաչափության դասակարգմանը:

Արդյունքները: Ինը փորձարկվող բջջային տողերը հաջողությամբ դասակարգվեցին իրենց D- ով10 արժեքը `օգտագործելով 46 և 44 գեներ, որոնց համար տառադարձման մակարդակը զգալիորեն փոխվել է համապատասխանաբար ճառագայթումից 1 և 3 ժամ հետո: Այս գեներից 25 -ը ցույց են տվել փոփոխված արտահայտություն NRG- ի կամ RG- ի երկու ժամանակային կետերում, սակայն ինքնուրույն չեն կարողացել դասակարգել փորձարկվող բջջային տողերը:

Եզրակացություններ. Այս ուսումնասիրության մեջ վերլուծված ռադիոդիմացկուն բջջային գծերը ցույց են տվել որոշակի ճառագայթման հետևանքով առաջացած փոփոխություններ գեների արտահայտման պրոֆիլներում, որոնք տարբերվում են ավելի զգայուն բջջային գծերի պրոֆիլային փոփոխություններից:


Լրագրողի գենի անալիզի կատեգորիաներ

Luciferase Reporter Assays & Vectors

Լյուցիֆերազի լրագրող-ռեակտիվներ, բազմակի տեղաբաշխման վեկտորներ, ինչպես նաև սպեկտրալապես լուծելի հիման վրա կիրառվող բռնկման, շիկացման և երկակի սպեկտրալ լյուցիֆերազի անալիզի հավաքածուներ: Prիպրիդինա, Գաուսիա, Ռենիլլա և firefly luciferases

Chemiluminescent Reporter Gene Assays

Լրագրողի գենի անալիզներ, որոնք առաջարկում են լրագրողի գենային գործունեության քիմիալուսին չափիչ չափում, որն ավելի զգայուն է, քան գունաչափական կամ լյումինեսցենտային հայտնաբերումը

Cypridina Luciferase Assays & Vectors

Լյուցիֆերազի լրագրող-ռեակտիվներ, կլոնավորման վայրի մի քանի վեկտորներ և բռնկման, շողերի և երկ-սպեկտրալ լյուցիֆերազի անալիզի հավաքածուներ ՝ հիմնված բնականաբար գաղտնիացված Կիպրիդինա լյուսիֆերազա

Gaussia & Gaussia-Dura Luciferase Assays & Vectors

Լյուցիֆերազի լրագրող-ռեակտիվներ, բազմակի տեղաբաշխման վեկտորներ, և լուսաբռնկիչ և երկ-սպեկտրալ լյուցիֆերազի անալիզի հավաքածուներ ՝ հիմնված բնականաբար գաղտնիացված Գաուսիա & Գաուսիա Dura luciferases

Renilla Luciferase Assays & Vectors

Լյուցիֆերազի թղթակից ռեակտիվներ, կլոնավորման վայրի մի քանի վեկտորներ, ինչպես նաև ներբջջային արտահայտված վրա հիմնված լույսիֆերազի լուսավորման, լուսավորության և երկակի սպեկտրալ հետազոտության հավաքածուներ: Ռենիլլա լյուցիֆերազ

Firefly Luciferase Assays & Vectors

Լյուցիֆերազի ռեակտիվ ռեակտիվներ, բազմաթիվ կլոնավորման վայրերի վեկտորներ և լուսաբռնկման, փայլի և կրկնակի սպեկտրալ լյուցիֆերազի փորձարկման հավաքածուներ, որոնք հիմնված են ներբջջային արտահայտված ֆիֆլայ լյուցիֆերազի վրա

Turbo Luciferase Assays & Vectors

Լյուցիֆերազ ռեակտիվ ռեակտիվներ, բազմաթիվ կլոնավորման վայրերի վեկտորներ, փայլի լյուցիֆերազի փորձարկման հավաքածու՝ հիմնված ներբջջային արտահայտված Turbo luciferase-ի վրա

NovaBright Chemiluminescent β-Galactosidase Reporter Gene Assays

Բետա-գալակտոզիդազայի լրագրողի գենի անալիզ կաթնասունների կամ խմորիչ բջիջների համար, որոնք համատեղում են բջիջների անմիջական լիզացիան և բետա-գալակտոզիդազա հաղորդիչ ֆերմենտի արագ ուլտրաձայնային հայտնաբերումը համասեռ վերլուծության ձևաչափով

NovaBright Chemiluminescent Luciferase & β-Galactosidase Reporter Gene Assay Systems

Բետա-գալակտոզիդազա և կրակոտ լուցիֆերազա երկակի ֆերմենտային հաղորդիչ գենի քիմիալյումինեսցենտ հայտնաբերման հավաքածուներ, որոնք ապահովում են նույն նմուշի երկու հաղորդիչ գենի ֆերմենտների արագ և զգայուն հաջորդական հայտնաբերում:

NovaBright Chemiluminescent SEAP Reporter Gene Assays

Պլասենցայի ալկալային ֆոսֆատազի (SEAP) փաթեթներ, որոնք պարունակում են ալկալային ֆոսֆատազի սուբստրատ, լյումինեսցենցիայի ուժեղացուցիչ և եզակի բուֆերային համակարգ, որը հատուկ արգելակում է էնդոգեն ոչ պլասենցային ալկալային ֆոսֆատազի ակտիվությունը, իսկ փորձարկման ազդանշանի կայուն փայլը թույլ է տալիս օգտագործել պարզ լյումինոմետրեր:


Լրագրողի գենային անալիզի ընտրված ապրանքներ

Պիրս Լյուսիֆերազայի անալիզներ

NovaBright Chemiluminescent Assays

Երկակի լույսի լյուցիֆերազի և β-գալակտոզիդազի փորձարկումներ

Գենի երկու ֆունկցիոնալ մասերը ներառում են կոդավորման շրջանը և խթանող շրջանը: Կոդավորման շրջանը ԴՆԹ -ի հաջորդականությունն է, որը պարունակում է տեղեկատվություն սպիտակուցի մասին, որը կարտադրվի սղագրության և թարգմանության մեխանիզմների միջոցով: Պրոմոտոր շրջանը ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունն է, որը կարգավորում է գենի տրանսկրիպցիան և կարող է ակտիվացնել կամ ճնշել գենի արտահայտությունը:

Լրագրողի գենի անալիզները սովորաբար օգտագործվում են անհայտ ԴՆԹ-հաջորդականության կարգավորիչ կարողությունը չափելու համար: Դա արվում է անհայտ խթանող հաջորդականությունը կապելով հեշտությամբ հայտնաբերվող լրագրողի գենի հետ, որի արտադրանքը կարելի է հեշտությամբ հայտնաբերել և քանակապես չափել:

Ընդհանուր ռեպորտաժային գեները ներառում են բետա-գալակտոզիդազ, լյուցիֆերազ, բետա-լակտամազ, ալկալային ֆոսֆատազ և GFP (կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուց): Լյումինեսցենցիայի, ներծծման և ֆլուորեսցենցիայի հայտնաբերման մեթոդները սովորաբար օգտագործվում են արտահայտված հաղորդիչ գենային սպիտակուցը չափելու համար:

Մենք առաջարկում ենք հակամարմիններ, ռեակտիվներ, վեկտորներ և հավաքածուներ `զեկուցող տարբեր գեների արտահայտման և հայտնաբերման համար, այդ թվում` լուցիֆերազա, գլիկոզիդազներ, քլորամֆենիկոլ ացետիլտրանսֆերազա (CAT), կանաչ լյումինեսցենտային սպիտակուց (GFP), β- լակտամազա և β-gal, ինչպես նաև Lumio ™ և TC-FlAsH™ տեխնոլոգիա:


Մեթոդներ

Բակտերիալ շտամներ

Սույն հետազոտության առանցքը բակտերիալ շտամն էր Pseudomonas aeruginosa CCBH4851. Մեկուսարանը հասանելի է Հոսպիտալից ձեռք բերված բակտերիաների մշակութային հավաքածուում (CCBH), որը գտնվում է Fundação Oswaldo Cruz-ում (WDCM947 CGEN022/2010): Գենոմի համեմատական ​​վերլուծություն կատարելու համար օգտագործվող այլ շտամներ թվարկված են Աղյուսակ 4 -ում:

Գենոմի հաջորդականացում, վերամոնտաժում և վերագրանցում

CCBH4851- ի ամբողջական գենոմի հաջորդականությունը նախկինում կատարվել է Illumina MiSeq հարթակ 6-ի միջոցով: Գենոմի հավաքման արդյունքում ստեղծվեց գենոմի նախագիծ, որը ներառում էր 150 կոնտիգներ, որոնք նշվեցին նախորդ աշխատանքում նկարագրված ձեւով: Հետագայում PacBio պլատֆորմի միջոցով կատարվեց լրացուցիչ գենոմի լրացուցիչ հաջորդականացում: Այստեղ, de novo հավաքումն իրականացվել է MaSuRCA հավաքողի միջոցով, ինչը թույլ էր տալիս Illumina- ի կարճ ընթերցումների համակցումը PacBio երկար ընթերցումների հետ, ինչը հանգեցրեց սկզբնական հավաքածուի բարելավմանը 35: Ստացվեց մեկ կոնտիգ և նշվեց անհատականացված խողովակաշարի միջոցով: Համառոտ, ծանոթագրություն սերտորեն կապված շտամից P. aeruginosa PAO1- ը փոխանցվել է CCBH4851 գենոմին ՝ օգտագործելով Rapid Annotation Transfer Tool ծրագրակազմը 36: Այնուհետեւ, CDS- ները կանխատեսվեցին GeneMarkS 37 -ի կողմից: RRNA- ների և tRNA- ների կանխատեսումը կատարվել է RNAmmer և tRNAscan-SE ծրագրային ապահովման միջոցով, համապատասխանաբար 38, 39: Կանխատեսվող CDS- ները ֆունկցիոնալ կերպով նշվեցին հանրային տվյալների շտեմարանների վերաբերյալ հոմոլոգիական որոնումների հիման վրա, ինչպիսիք են RefSeq 40, COG 41, KEGG 42, UniProt 43 և InterPro 44: Ի վերջո, նախորդ քայլերի ծանոթագրությունները համեմատվեցին, համակցվեցին և ձեռքով կարգավորվեցին: Բացի այդ, PRIAM ծրագրակազմն օգտագործվել է CDS 45 -ին ֆերմենտային միջնորդավճար նշանակելու համար: Ամբողջ գենոմի արտացոլումը կատարվել է Artemis ծրագրաշարի միջոցով 46: CCBH4851 գենոմի շրջանաձև գծապատկերը արտադրվել է Circos ծրագրաշարի կողմից 47:

Գենոմի համեմատական ​​վերլուծություն

Ամբողջ գենոմի համեմատությունը կատարվել է `պարզելու համար CCBH4851- ի և աղյուսակ 4-ում նշված շտամների միջև եղած նմանություններն ու տարբերությունները: Գենոմները վերլուծվել են երկկողմանի լավագույն հարվածի (BBH) խմբավորման մեթոդի հիման վրա` հոմոլոգիական որոնումների հիման վրա `օգտագործելով BLAST ալգորիթմը` զույգ զույգերին հայտնաբերելու համար: համապատասխան գեները, որոնք միմյանց լավագույնս հարվածում են, երբ համեմատվում են տարբեր գենոմներ 48: BLAST- ի բոլոր դասավորվածությունները կատարվել են հետևյալ պարամետրերի միջոցով. ( Ge ) 90% ծածկույթ, ( ge ) 90% նմանություն և E արժեքի անջատում 1e-10: BLAST-ի արդյունքների վրա կիրառվել է Python ալգորիթմ՝ BBH-ները բացահայտելու համար 49: Հիմնական, լրացուցիչ և եզակի գենոմները վերլուծվել են MySQL տվյալների բազայի միջոցով, որը ստեղծվել է նախորդ քայլերում գեներացված տվյալներով: CDS- ները դասակարգվեցին «Օրթոլոգիական խմբերի կլաստերների» (COG) գործառական կատեգորիաների ՝ օգտագործելով eggNOG-Mapper վեբ հավելվածը 50: Գենոմատիկ կղզիների նույնականացումն իրականացվել է IslandViewer 51-ի կողմից: Տեղադրման հաջորդականությունները նույնականացվել են՝ օգտագործելով ISSaga վեբ հավելվածը 52: CRISPR-Cas համակարգի առկայությունը գնահատվել է CRISPRCasFinder վեբ հավելվածի կողմից 53: Հակամանրէային դիմադրության մեխանիզմների հետ կապված գեները հայտնաբերելու համար CCBH4851 գենոմի սպիտակուցային հաջորդականություններն օգտագործվել են CARD- ի դեմ BLAST որոնումներ կատարելու համար `օգտագործելով Resistance Gene Identifier վեբ հավելվածը 54: Նաև, սպիտակուցային հաջորդականությունները որոնվել են պաթոգեն բակտերիաների վիրուսային գործոնների տվյալների բազայի 55-ի նկատմամբ՝ օգտագործելով BLASTP՝ (ge) 75% ծածկույթով, (ge) 50% նույնականությամբ և E արժեքի կտրվածքով 1e-10: Կարգավորող սպիտակուցները կանխատեսվել են «Կանխատեսվող պրոկարիոտիկ կարգավորիչ սպիտակուցներ» վեբ հավելվածի միջոցով 56: SNP-ների հայտնաբերումը կատարվել է Snippy ծրագրաշարի միջոցով՝ հիմնված չհավաքված ընթերցումների հավասարեցման վրա P. aeruginosa PAO1 գենոմի հաջորդականությունը `օգտագործելով կանխադրված պարամետրեր 9: Ոչ հոմանիշ տարբերակների հիպոթետիկ ազդեցությունը վերլուծվել է HOPE վեբ հավելվածի միջոցով 57:

Ֆիլոգենոմիկ վերլուծություն

Աղյուսակ 4-ում թվարկված CCBH4851- ի և շտամների գենոմի հաջորդականություններն օգտագործվել են ամբողջական գենոմի ֆիլոգենեզի վերլուծություն կատարելու համար: Վերլուծությունն իրականացվել է CSI Phylogeny վեբ հավելվածի կողմից՝ օգտագործելով լռելյայն պարամետրեր 58: Գլխավոր գենոմի ֆիլոգենիայի ծառը եզրակացվեց և խմբագրվեց FigTree- ով (հասանելի է http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/):

Հակամանրէային զգայունության փորձարկում

Հակամանրէային զգայունության փորձարկումն իրականացվել է EUCAST ուղեցույցների համաձայն՝ օգտագործելով արգանակի միկրոնոսրացման մեթոդը 11: Չորս հիմնական հակամանրէային դասեր են գնահատվել `ամինոգլիկոզիդներ (գենտամիցին), քինոլոններ (ցիպրոֆլոքսացին), բետա-լակտամներ (իմիպենեմ) և լիպոեպտիդներ (պոլիմիքսին E կամ կոլիստին): MIC- ը որոշվել է որպես հակամանրէային գործակալի ամենացածր կոնցենտրացիան, որը կանխել է միկրոօրգանիզմի տեսանելի աճը: Որպես ենթակա, միջանկյալ կամ դիմացկուն դասակարգումը հիմնված էր EUCAST չափանիշների վրա 59: Համառոտ, ցիպրոֆլոքսասինի, իմիպենեմի և կոլիստինի դիմադրության բեկման կետերը համապատասխանաբար կազմում են >0,5 (mu) գ/մլ, >4 (mu) գ/մլ և >2 (mu) գ/մլ: Գենտամիցինն ունի «IE» կարգավիճակ, ինչը նշանակում է, որ չկա բավարար ապացույց, որ օրգանիզմը լավ թիրախ է գործակալի հետ բուժման համար, MIC-ը կարող է հաղորդվել, բայց առանց S, I կամ R նշանակման: Արգանակի միկրովարացման մեթոդի համար ընդհանուր առմամբ կատարվել է վեց կենսաբանական կրկնօրինակ `յուրաքանչյուրը երկու տեխնիկական կրկնությամբ` բաժանված երեք անկախ փորձերի: Բացառությամբ կոլիստինի զգայունության փորձարկման, որը ցույց տվեց աճ բաց թողած հորատանցքերում, առանց օրինակի, նույն տեսողական ընթերցումը նկատվեց բոլոր փորձերում:

Շարժունակության անալիզներ

Շարժունակության անալիզները կատարվեցին, ինչպես նկարագրված էր նախկինում ՝ փոքր փոփոխություններով 60: Որպես աճի միջավայր օգտագործվել է Luria–Bertani (LB) ագարը: Լողի ափսեները (0.3% ագար) պատվաստվել են ստերիլ ատամի խոզանակով և 16 ժամ շարունակ ինկուբացվել 37 (^< circ> ) ջերմաստիճանում: Գողացող ափսեները (0.6% ագար) պատվաստվել են ստերիլ ատամի խոզանակով և թիթեղները ինկուբացվել են 24 ժամ 37 (^< circ> ) C. itchնցման համար բջիջները պատվաստվել են ատամի խոզանակով LB շերտի միջոցով (1% ագար) մինչև Պետրիի ափսեի հատակը: Թիթեղները ինկուբացվել են 24 ժամ 37 (^) C ջերմաստիճանում: Ինկուբացիայից հետո ագարը դեն նետվեց, թիթեղները լվացվեցին՝ չկապված բջիջները հեռացնելու համար և ներկվեցին բյուրեղյա մանուշակագույնով (1% [wt/vol]) լուծույթով: ): Բոլոր շարժունակությունները չափվել են որպես շրջանառության գոտի, որը ձևավորվել է պատվաստման կետից հեռու բակտերիաների միգրացիայով: Բացի այդ, ցնցող թիթեղների բիծը լուծվել է էթանոլի մեջ (95% [vol/vol] լուծույթ) և ներծծումը չափվել է 570 նմ -ում `օգտագործելով դատարկ էթանոլի լուծույթ: Բացառությամբ կծկվող թիթեղներում բծերի քանակական որոշման, երեք անկախ փորձերի ընթացքում իրականացվել են առնվազն երեք կենսաբանական կրկնօրինակումներ՝ յուրաքանչյուրը երեք տեխնիկական կրկնությամբ: Stainնցման թիթեղներում բիծը քանակականացնելու համար ընդհանուր առմամբ կատարվել է հինգ կենսաբանական կրկնօրինակ `յուրաքանչյուրը երկու տեխնիկական կրկնությամբ` բաժանված երկու անկախ փորձերի:

Կենսաթաղանթի ձևավորման վերլուծություն

-ի կարողությունը P. aeruginosa կենսաֆիլմերի ձևավորումը գնահատվեց, ինչպես նկարագրված էր նախկինում 61: Հակիրճ, բջիջները պատվաստվել են LB կամ Mueller-Hinton միջավայր պարունակող 96 հորատանցքի ափսեներում: Թիթեղները ինկուբացիայի ենթարկվեցին 20–24 ժամ 37 (^< շրջան> ) C. Ինկուբացիայից հետո միջավայրը թափվեց, ափսեները լվացվեցին ջրով ՝ չկապված բջիջները հեռացնելու համար և ներկվեցին բյուրեղյա մանուշակով (1% [քաշ/ vol] լուծում): Այնուհետև բյուրեղյա մանուշակը լուծարվեց էթանոլի մեջ (95% [vol/vol] լուծույթ), և ներծծումը չափվեց 570 նմ -ով ՝ օգտագործելով դատարկ էթանոլի լուծույթ: P. aeruginosa PA01-ն օգտագործվել է որպես դրական հսկողություն: Ընդհանուր առմամբ կատարվել է յոթ կենսաբանական կրկնօրինակ `յուրաքանչյուրը առնվազն երեք տեխնիկական կրկնությամբ` բաժանված երկու անկախ փորձերի:

Վիճակագրական վերլուծություն

Վիճակագրությունը կատարվել է GraphPad Prism ծրագրաշարում: Ուսանողի t թեստը օգտագործվել է `ստուգելու համար, թե արդյոք ֆենոտիպիկ փորձերի արդյունքները զգալիորեն տարբեր են (Պ արժեքը & lt 0.05): Տվյալները արտահայտվել են որպես միջին ± ստանդարտ սխալ: Նկարներում (*) հավասար է Պ արժեքը & lt 0.05, (** ) հավասար է Պ արժեքը & lt 0.01, (*** ) հավասար է Պ արժեքը < 0,001 և (****) հավասար է Պ արժեքը & lt 0.0001:


Հատկանշված թղթակից գենային վերլուծության արտադրանք

Պիրս Լյուսիֆերազայի անալիզներ

NovaBright քիմիլյումինեսցենտային անալիզներ

Dual-Light Luciferase & β-Galactosidase Assays

Գենի երկու ֆունկցիոնալ մասերը ներառում են կոդավորման շրջանը և խթանող շրջանը: Կոդավորման շրջանը ԴՆԹ-ի այն հաջորդականությունն է, որը պարունակում է տեղեկատվություն սպիտակուցի մասին, որը կարտադրվի տրանսկրիպցիոն և թարգմանչական մեխանիզմների միջոցով: Պրոմոտոր շրջանը ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունն է, որը կարգավորում է գենի տրանսկրիպցիան և կարող է ակտիվացնել կամ ճնշել գենի արտահայտությունը:

Լրագրողի գենի անալիզները սովորաբար օգտագործվում են անհայտ ԴՆԹ-հաջորդականության կարգավորիչ կարողությունը չափելու համար: Դա արվում է անհայտ խթանող հաջորդականությունը կապելով հեշտությամբ հայտնաբերվող լրագրողի գենի հետ, որի արտադրանքը կարելի է հեշտությամբ հայտնաբերել և քանակապես չափել:

Ընդհանուր ռեպորտաժային գեները ներառում են բետա-գալակտոզիդազ, լյուցիֆերազ, բետա-լակտամազ, ալկալային ֆոսֆատազ և GFP (կանաչ ֆլուորեսցենտային սպիտակուց): Լյումինեսցենցիայի, ներծծման և ֆլուորեսցենցիայի հայտնաբերման մեթոդները սովորաբար օգտագործվում են արտահայտված հաղորդիչ գենային սպիտակուցը չափելու համար:

Մենք առաջարկում ենք հակամարմիններ, ռեագենտներ, վեկտորներ և փաթեթներ՝ արտահայտելու և հայտնաբերելու տարբեր ռեպորտաժային գեներ, ներառյալ լյուցիֆերազը, գլիկոզիդազները, քլորամֆենիկոլ ացետիլտրանսֆերազը (CAT), կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուցը (GFP), β-լակտամազը և β-gal, ինչպես նաև Lumio: ™ և TC-FlAsH ™ տեխնոլոգիա:


Հեղինակային տվյալներ

Այս հեղինակները հավասարապես ներդրում են ունեցել՝ Յունջյաո Հեն և Ցզինպին Լեյը:

Աֆիլիացիաներ

Հոնկոնգի Պոլիտեխնիկական համալսարանի Շենժենի գիտահետազոտական ​​ինստիտուտ, Շենժեն, Չինաստան

Յունջիաո Հե, Սուեհուա Պան և Յանսիանգ Չժաո

Կիրառական կենսաբանության և քիմիական տեխնոլոգիաների բաժին, Քիմիական կենսաբանության և դեղերի հայտնաբերման պետական ​​առանցքային լաբորատորիա, Հոնկոնգի պոլիտեխնիկական համալսարան, Հունգ Հոմ, Կոուլուն, Հոնկոնգ, Պ. Ռ.

Յունջիաո Հե, Սուեհուա Պան և Յանսիանգ Չժաո

Քիմիայի բաժին, Համակարգային կենսաբանության և մարդու առողջության կենտրոն, Հոնկոնգի գիտության և տեխնոլոգիայի համալսարան, Clear Water Bay, Kowloon, Հոնկոնգ, P. R. Չինաստան

Դեղագործական գիտությունների դպրոց, Սուն Յաթ-Սեն համալսարան, Գուանչժոու, Պ. Ռ.


Մաս ՝ BBa_J23119



Հիմնադիր քարոզիչ ընտանիք
J23100- ից J23119- ի մասերը կառուցողական խթանող մասերի ընտանիք են, որոնք մեկուսացված են փոքր կոմբինատոր գրադարանից: J23119-ը «կոնսենսուս» խթանող հաջորդականությունն է և ընտանիքի ամենաուժեղ անդամը: Բոլոր մասերը, բացի J23119-ից, առկա են J61002 պլազմիդում: J23119 մասը առկա է pSB1A2- ում: Սա տեղադրում է RFP-ն խթանողից ներքև: Խթանողների հաղորդվող գործունեությունը տրված է որպես այդ պլազմիդների հարաբերական ֆլուորեսցիան TG1 լարումում, որը աճել է LB միջավայրում մինչև հագեցվածություն: Տե՛ս BBa_J61002 մասը ՝ դրանց օգտագործման մանրամասների համար:

Այս խթանող մասերը կարող են օգտագործվել կարգավորելու ձևով արտահայտված մասերի արտահայտման մակարդակը: Այս խթանող մասերում առկա NheI և AvrII սահմանափակման տեղամասերը դրանք դարձնում են փայտանյութ հետագա փոփոխությունների համար: JCAraw

Օգտագործում և կենսաբանություն

iGEM16-CLSB-UK:Կոնսենսուսի խթանողը Մաս ՝ BBa_J23119 հավաքվել է AmilCP կապույտ-մանուշակագույն քրոմպրոտեինով Մաս:BBa_K592025: Կոնստրուկցիան Մաս. BBa_K2078002 իրականացվել է pSB1C3 պլազմիդի վրա ՝ E-Coli- ում արտահայտվելու և ուժեղացնելու համար:

Ամստերդամ 2020: Հարաբերական խթանողի ուժը Synechocystis PCC6803 և UTEX 2973 Վասեդուվանն ու գործընկերները (2019) նպատակ ունեին ուսումնասիրել խթանողների ուժի տարբերությունը Synechocystis PCC6803 (Սինեխոցիստիս) և UTEX 2973. Նախկինում սահմանված 20 հաջորդական խթանողներ (ներառյալ ՝ դրանից բխող խթանողները) Մաս ՝ BBa_J23119, Պtrc10, Պtic10 և Պtac10 Մարքլի և այլք: 2015 Huang, et al. 2010 Alberts, et al. 2015) և L-arabinose inducible promotor, որը ծագում է Էշերիխիա ԿոլիՎԱՏ Աբեն և այլն: 2014) համեմատվել են: Բացի այդ, նրանք կառուցեցին 8 մուտանտի խթանող Մաս:BBa_J23119 խթանողը և Պtrc10 խթանողի դիզայն (տես նկար 1 Ա): Փրոմոութերները հավաքվել են pPMQAK1-T-ում՝ eYFP արտահայտությունը խթանելու համար: Խթանողի հաջորդականություններին լաք օպերոն (lacO) և ապագա փորձերի համար ավելացվել է ռիբոսոմային կապման վայրը (Huang, et al. 2010): eYFP ֆլյուորեսցենտը, որը չափվել է ավելի քան 10,000 բջիջ, օգտագործվել է առանձին խթանիչների ուժը համեմատելու համար Սինեխոցիստիս և UTEX 2973 (տես Նկար 1 Բ): Բացի այդ, ուսումնասիրվել է սինթետիկ խթանիչների արտահայտման հարաբերակցությունը երկու շտամներում (տես Նկար 1C): Չնայած արտահայտման մակարդակը 8 անգամ ավելի բարձր է նրանց համար UTEX 2973 քան համար Սինեկոսիստիս, խթանողների ուժը նմանատիպ նախշեր ունի երկու շտամներում (R 2 = 0.84, տես նկար 1C): Այս տեղեկատվությունը կարող է օգտագործվել տարբեր նպատակների համար կոնստրուկցիաներ պատրաստելիս:

Նկար 1. Հետերոլոգ և սինթետիկ խթանիչների արտահայտման մակարդակները Synechocystis-ում և UTEX 2973-ում: Ա. BioBricks-ից ստացված ութ նոր սինթետիկ խթանիչների կառուցվածք և դասավորվածություն Մաս ՝ BBa_J23119 գրադարանը և Պtrc10 խթանողի դիզայն (Huang et al., 2010): Բ. eYFP-ի արտահայտման մակարդակները պայմանավորված են խթանողների կողմից Սինեխոցիստիս և UTEX 2973 հաշվարկվում է 10,000 առանձին բջիջներից ստացված չափումներից: Գ. Փորձարկված սինթետիկ խթանիչների արտահայտման մակարդակների հարաբերակցության վերլուծություն Սինեխոցիստիս և UTEX 2973. Որոշման գործակիցը (R 2) ցուցադրվում է J23119 գրադարանի համար (կարմիր), նոր սինթետիկ խթանողների (վարդագույն) և trc տարբերակներ (մուգ կարմիր): Արժեքները միջոցներն են +- 6 SE առնվազն չորս կենսաբանական կրկնօրինակներից 48 ժամ աճից հետո (միջին OD 750 արժեքները Սինեխոցիստիս և UTEX 2973 մշակույթները համապատասխանաբար 3.5 6 0.2 և 3.6 6 0.2 էին): (Վերնագիրը մեջբերված է Vaseduvan, et al. 2019)


GreatBay_China 2018:
GreatBay_China 2018 թիմը բնութագրեց J23119, Մաս ՝ BBa_J23105 և Մաս ՝ BBa_J23101 ՝ դրանք հավաքելով Մասով ՝ BBa_B0034 և sfGFPPart: BBa_I746916 երեք վեկտորների վրա. pSC101 (պատճենի համարը մոտ 2/բջիջ): Այնուհետև մենք չափեցինք ֆլյուորեսցենտությունը Flow Cytometry-ի միջոցով՝ որպես TALE կայունացված խթանող գրադարանի հղում:

Արդյունքը ցույց է տալիս, որ J23119- ի, J23105- ի և J23101- ի ուժը մոտավորապես նույնն է, ինչ նկարագրված է iGEM2006_Berkeley թիմի կողմից, և ֆլուորեսցենցիան մեծանում է, երբ վեկտորի պատճենի թիվն ավելանում է:

GreatBay_China- ն երկուսն է պատրաստել բարելավված մասեր հիմնված J23119- ի վրա:
UP119 փոփոխվում է հավելյալ տարրի հավելումով: (Մաս ՝ BBa_K2753055)
TALE2 sp6 J23119-ի TALE կայունացված տարբերակն է: (Մաս ՝ BBa_K2753023)


Շնորհակալագրեր

Մենք շնորհակալություն ենք հայտնում Ֆրեմանտլ ծովային կենտրոնի ակվակուլտուրայի զարգացման բաժնի անձնակազմին՝ թրթուր ձուկ տրամադրելու համար, դոցենտ Գրեհեմ Մայրհոֆերին, Մոլեկուլային և կենսաբժշկական գիտությունների դպրոց, Ադելաիդայի համալսարան՝ հետազոտության մի մասի ընթացքում լաբորատոր սարքավորումների օգտագործման համար, դոկտոր Մարի Նայթին և Դոկտոր Մարգո Ֆերգյուսոնը ՝ մոլեկուլային տեխնիկային աջակցելու համար, և դոկտոր Մարգերի Բարրանը և դոկտոր Josephոզեֆ Լիմը ՝ Corbett Life Science Rotor-Gene 3000 qPCR դետեկտորի օգտագործման հարցում նրանց օգնության համար: Այս ուսումնասիրությունն իրականացվել է Առողջապահության և բժշկական հետազոտությունների ազգային խորհրդի (Ավստրալիա) աջակցությամբ, ծրագրային դրամաշնորհ No. 993219, ՀԳՄ հետազոտական ​​դրամաշնորհ և ծրագրի դրամաշնորհներ Կենսատեխնոլոգիայի և կենսաբանական գիտությունների հետազոտական ​​խորհրդի և Լևերհուլմեի հիմնադրամի կողմից: