Տեղեկատվություն

11.2. ԴՆԹ անալիզ - գել էլեկտրոֆորեզ - կենսաբանություն

11.2. ԴՆԹ անալիզ - գել էլեկտրոֆորեզ - կենսաբանություն


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ԴՆԹ -ի լուծույթն անգույն է և, բացի բարձր կոնցենտրացիաներում մածուցիկ լինելուց, տեսողականորեն չի տարբերվում ջրից: Հետևաբար, այնպիսի մեթոդներ, ինչպիսիք են գել էլեկտրոֆորեզ մշակվել են ԴՆԹ-ն հայտնաբերելու և վերլուծելու համար (Նկար (PageIndex{11})):

Այս վերլուծությունը սկսվում է, երբ ԴՆԹ-ի լուծույթը նստում է գելային սալիկի մի ծայրում: Այս գելը պատրաստված է պոլիմերներից, ինչպիսիք են ագարոզա, որը ջրիմուռներից մեկուսացված պոլիսաքարիդ է: ԴՆԹ -ն այնուհետև գելի միջով անցնում է էլեկտրական հոսանքով, իսկ ԴՆԹ -ի մոլեկուլները շարժվում են դեպի դրական էլեկտրոդ (Նկար ( PageIndex {12} )):

Միգրացիայի ընթացքում ԴՆԹ -ի յուրաքանչյուր կտոր անցնում է իր ծակոտիների միջով, որոնք ձևավորվում են գելի պոլիմերների միջև: Քանի որ ավելի կարճ կտորները կարող են ավելի արագ տեղաշարժվել այս ծակոտիներով, քան ավելի երկար կտորները, գել էլեկտրոֆորեզը առանձնացնում է մոլեկուլները դրանց չափի (երկարության) հիման վրա, իսկ փոքր ԴՆԹ -ի կտորները ավելի արագ են շարժվում, քան երկարները: Նմանատիպ չափի ԴՆԹ -ի մոլեկուլները միգրացիայի են ենթարկվում յուրաքանչյուր գելի նմանատիպ վայրում, որը կոչվում է a նվագախումբ. Այս հատկությունը հեշտացնում է ԴՆԹ-ն տեսնելը լյումինեսցենտային ներկով ներկելուց հետո, ինչպիսին է էթիդիում բրոմիդ (Նկար ( PageIndex {13} )): Հայտնի չափի ԴՆԹ մոլեկուլների խառնուրդն առանձնացնելով (չափի մարկերներ) նույն գելի հարակից ուղիներում կարելի է գնահատել չբնութագրված ԴՆԹ -ի բեկորի երկարությունը: ԴՆԹ-ի շերտերը պարունակող գելային հատվածները նույնպես կարող են կտրվել գելից, իսկ չափով ընտրված ԴՆԹ-ն արդյունահանվել և օգտագործվել այլ տեսակի ռեակցիաներում, ինչպիսիք են հաջորդականացումը և կլոնավորումը:


ChIA-PET գործիք `քրոմատինի փոխազդեցության համապարփակ վերլուծության համար` զուգավորված ծայրերի հաջորդականությամբ

Քրոմատինի փոխազդեցության վերլուծությունը զույգ պիտակների հաջորդականությամբ (ChIA-PET) նոր տեխնոլոգիա է `ուսումնասիրելու գենոմի լայնածավալ քրոմատինի փոխազդեցությունները` կապված սպիտակուցային գործոններով: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք ChIA-PET Tool-ը՝ ChIA-PET հաջորդականության տվյալների ավտոմատ մշակման ծրագրային փաթեթ, ներառյալ կապող ֆիլտրումը, հղումային գենոմներին հատկորոշիչների քարտեզագրումը, սպիտակուցների կապակցման վայրերը և քրոմատինի փոխազդեցությունները և արդյունքները գրաֆիկական գենոմի դիտարկիչում ցուցադրելը: ChIA-PET գործիքը արագ, ճշգրիտ, համապարփակ, օգտագործողի համար հարմար և բաց կոդով է (հասանելի է http://chiapet.gis.a-star.edu.sg կայքում):


Բարձր լուծման հալման անալիզի օգտագործումը Symbiodinium շտամների գենոտիպավորման համար. Զգայուն և արագ մոտեցում

Բարձր լուծման հալման (HRM) վերլուծությունը փակ խողովակով, արագ և զգայուն տեխնիկա է, որը կարող է հայտնաբերել ԴՆԹ-ի տատանումները: Այն ապավինում է ֆլուորեսցենցիայի հալման կորերին, որոնք ստացվում են ջերմաստիճանի բարձրացման արդյունքում երկշղթայական ԴՆԹ-ի (dsDNA) մեկ շղթայի ԴՆԹ-ի (ssDNA) անցումից: Այս ուսումնասիրության ընթացքում մենք գնահատեցինք HRM- ի արդյունավետությունը որպես գործիք ՝ արագ և ճշգրիտ գենոտիպի միապաղաղ Symbiodinium պոպուլյացիաների գենոտիպավորման համար ՝ օգտագործելով ներքին արտագրված spacer, տարածաշրջան 2, ռիբոսոմային ԴՆԹ (ITS2 rDNA): Դրա համար Symbiodinium denaturing գրադիենտ գել էլեկտրոֆորեզի (DGGE) պրոֆիլները, որտեղ գելային շերտերը ճեղքվել և հաջորդականացվել են, համեմատվել են HRM գենոտիպերի հետ: Արդյունքները ցույց տվեցին, որ քսան մշակույթ ճիշտ գենոտիպագրվել է 2 ժամվա ընթացքում `օգտագործելով HRM վերլուծություն` վստահության տոկոսով և gt90%տոկոսով: Հետազոտվել են նաև տեխնիկայի սահմանափակումները: Ի տարբերություն Symbiodinium- ի գենոտիպավորման համար օգտագործվող այլ տեխնիկայի, ինչպիսիք են DGGE- ն և մատնահետքերի այլ պրոֆիլները, HRM- ը մեծ առավելություն է դաշտային կորալային առագաստների բնապահպանների և ֆիզիոլոգների համար, քանի որ առաջադեմ մոլեկուլային մեթոդների փորձաքննություն չի պահանջվում:


Քրոմատինի կառուցվածքի վերլուծություն in vivo ֆորմալդեհիդի խաչաձև կապով

Վերջին ձեռքբերումները կասկած չեն թողնում, որ ավելի բարձր կարգի քրոմատինային կառուցվածքները հիմնարար դեր են խաղում գեների կարգավորման շատ կարևոր մեխանիզմներում: Հատկապես գենետիկական մոդելի այնպիսի համակարգերի վերլուծությունները, ինչպիսիք են խմորիչը և Դրոզոֆիլան, հայտնաբերեցին նոր սպիտակուցներ, որոնք ներգրավված են քրոմատինի կառուցվածքների կարգավորման մեջ: Այս սպիտակուցներից շատերը ուղղակիորեն չեն կապվում ԴՆԹ -ի հետ, այլ փոխազդում են մեծ մուլտիմերալ համալիրների մեջ: Այս բազմապրոտեինային կոմպլեքսներով կարգավորվող ԴՆԹ-ի տարրերը բացահայտելու համար պետք է մշակվեին ԴՆԹ-սպիտակուցային վերլուծության ստանդարտ մեթոդների այլընտրանքային մոտեցումներ: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք մի մեթոդ, որը պահպանում է բարձր կարգի քրոմատինային կառուցվածքների ճարտարապետությունը `in vivo բջիջները ֆորմալդեհիդով խաչաձեւ կապելով: Այնուհետև օգտագործվում է իմունային տեղումների ռազմավարությունը `հետաքրքրող քրոմոսոմային սպիտակուցների ԴՆԹ թիրախները բացահայտելու համար: Այս մեթոդը կարող է կիրառվել սպիտակուցների բաշխումը բարձր լուծաչափով քրոմոսոմային տարածքների վրա:


12.2 ԴՆԹ -ի, ՌՆԹ -ի և սպիտակուցի պատկերացում և բնութագրում

ԴՆԹ-ի մոլեկուլի հաջորդականությունը կարող է օգնել մեզ բացահայտել օրգանիզմը՝ համեմատելով տվյալների բազայում տեղակայված հայտնի հաջորդականությունների հետ: Հերթականությունը կարող է նաև մեզ ինչ -որ բան ասել ԴՆԹ -ի որոշակի մասի գործառույթի մասին, օրինակ `արդյոք այն կոդավորում է որոշակի սպիտակուց: Նմուշների միջև սպիտակուցային նշանների (սպիտակուցների հատուկ զանգվածների արտահայտման մակարդակների) համեմատությունը կարևոր մեթոդ է շրջակա միջավայրի բազմաթիվ գործոնների և սթրեսների նկատմամբ բջջային արձագանքների գնահատման համար: Սպիտակուցների ստորագրությունների վերլուծությունը կարող է բացահայտել օրգանիզմի ինքնությունը կամ ինչպես է բջիջը արձագանքում հիվանդության ժամանակ:

Հետաքրքրված ԴՆԹ -ն և սպիտակուցները մանրադիտակային են և սովորաբար խառնվում են բազմաթիվ այլ մոլեկուլների հետ, ներառյալ ԴՆԹ -ն կամ մեր շահերին անհամապատասխան սպիտակուցները: Շատ տեխնիկա են մշակվել հետաքրքրող մոլեկուլները մեկուսացնելու և բնութագրելու համար: Այս մեթոդներն ի սկզբանե մշակվել են հետազոտական ​​նպատակների համար, սակայն շատ դեպքերում դրանք պարզեցվել են այնքանով, որքանով հնարավոր է սովորական կլինիկական օգտագործումը: Օրինակ, շատ պաթոգեններ, ինչպիսիք են մանրէները Helicobacter pylori , որը ստամոքսի խոց է առաջացնում, կարելի է հայտնաբերել ՝ օգտագործելով սպիտակուցի վրա հիմնված թեստեր: Բացի այդ, ԴՆԹ-ի ուժեղացման վրա հիմնված բարձր ճշգրիտ և ճշգրիտ նույնականացման անալիզների աճող թիվը այժմ կարող է հայտնաբերել պաթոգեններ, ինչպիսիք են հակաբիոտիկակայուն ստամոքսային բակտերիաները, հերպեսի պարզեցված վիրուսը, varicella-zoster վիրուսը և շատ ուրիշներ:

ԴՆԹ-ի մոլեկուլային վերլուծություն

Այս ենթաբաժնում մենք կներկայացնենք որոշ հիմնական մեթոդներ, որոնք օգտագործվում են գիտնականին հետաքրքրող ԴՆԹ -ի հատուկ բեկորները առանձնացնելու և տեսանելի դարձնելու համար: Այս մեթոդներից ոմանք չեն պահանջում ԴՆԹ -ի մոլեկուլի ամբողջական հաջորդականության իմացություն: Մինչև ԴՆԹ -ի արագ հաջորդականացման սկիզբը, այս մեթոդները միակն էին, որոնք կարող էին աշխատել ԴՆԹ -ի հետ, բայց դրանք դեռևս կազմում են մոլեկուլային գենետիկների կողմից օգտագործվող գործիքների հիմնական զինանոցը `մանրէաբանական և այլ հիվանդություններին մարմնի արձագանքներն ուսումնասիրելու համար:

Նուկլեինաթթվի հետաքննություն

ԴՆԹ-ի մոլեկուլները փոքր են, և դրանց հաջորդականության մեջ պարունակվող տեղեկատվությունը անտեսանելի է: Ինչպե՞ս է հետազոտողը մեկուսացնում ԴՆԹ -ի որոշակի հատվածը կամ այն ​​մեկուսացնելով ՝ որոշում, թե որ օրգանիզմից է այն, որն է նրա հաջորդականությունը կամ որն է նրա գործառույթը: ԴՆԹ-ի որոշակի հաջորդականության առկայությունը պարզելու մեթոդներից մեկը օգտագործում է ԴՆԹ-ի արհեստականորեն կառուցված կտորներ, որոնք կոչվում են զոնդեր: Proոնդը կարող է օգտագործվել միջավայրում տարբեր բակտերիալ տեսակների հայտնաբերման համար, և այժմ առկա են ԴՆԹ -ի բազմաթիվ զոնդեր `պաթոգենները կլինիկականորեն հայտնաբերելու համար: Օրինակ, ԴՆԹ զոնդերը օգտագործվում են հեշտոցային պաթոգենների հայտնաբերման համար Candida albicans , Gardnerella vaginalis , և Trichomonas vaginalis .

Գենոմային գրադարանը որոշակի գենի կամ հետաքրքրության հաջորդականության համար հետազոտելու համար հետազոտողները պետք է ինչ-որ բան իմանան այդ գենի մասին: Եթե ​​հետազոտողները ունեն ԴՆԹ-ի հաջորդականության մի հատված, որը հետաքրքրում է գենին, նրանք կարող են նախագծել ԴՆԹ-ի զոնդ, մեկ շղթայի ԴՆԹ-ի բեկոր, որը լրացնում է հետաքրքրության գենի մի մասը և տարբերվում է նմուշի ԴՆԹ-ի հաջորդականություններից: ԴՆԹ-ի զոնդը կարող է քիմիական եղանակով սինթեզվել առևտրային լաբորատորիաների կողմից, կամ կարող է ստեղծվել կենդանի օրգանիզմի ԴՆԹ-ի բեկորների կլոնավորման, մեկուսացման և դենատուրացիայի միջոցով: Ամեն դեպքում, ԴՆԹ -ի զոնդը պետք է պիտակավորված լինի մոլեկուլային նշանով կամ փարոսով, օրինակ `ռադիոակտիվ ֆոսֆորի ատոմ (ինչպես օգտագործվում է ավտորադիոգրաֆիայի համար) կամ լյումինեսցենտ ներկ (ինչպես օգտագործվում է լյումինեսցենտում) տեղում հիբրիդացում կամ FISH), որպեսզի տեսանելի լինեն զոնդը և ԴՆԹ-ն, որի հետ կապվում է (Նկար 12.13): Հետազոտվող ԴՆԹ-ի նմուշը պետք է նաև դենատուրացիայի ենթարկվի, որպեսզի այն դառնա միաշղթա, որպեսզի միաշղթա ԴՆԹ-ի զոնդը կարողանա զտվել միաշղթա ԴՆԹ-ի նմուշին այն վայրերում, որտեղ դրանց հաջորդականությունները փոխլրացնող են: Չնայած այս տեխնիկան արժեքավոր է ախտորոշման համար, դրանց անմիջական օգտագործումը թուքի և այլ մարմնական նմուշների վրա կարող է խնդրահարույց լինել այդ նմուշների բարդ բնույթի պատճառով: Հաճախ ԴՆԹ -ն պետք է մեկուսացված լինի մարմնի նմուշներից քիմիական արդյունահանման մեթոդների միջոցով, նախքան ԴՆԹ -ի զոնդը կարող է օգտագործվել պաթոգեններ հայտնաբերելու համար:

Կլինիկական կենտրոնացում

Մաս 2

Մեղմ, գրիպի նման ախտանիշները, որոնք զգում է Կայլան, կարող են առաջանալ ցանկացած քանակությամբ վարակիչ գործակալների կողմից: Բացի այդ, մի քանի ոչ վարակիչ աուտոիմուն պայմաններ, ինչպիսիք են ՝ բազմակի սկլերոզը, համակարգային կարմիր գայլախտը (SLE) և ամիոտրոֆիկ կողային սկլերոզը (ALS), նույնպես ունեն ախտանիշներ, որոնք համահունչ են Կայլայի վաղ ախտանիշներին: Այնուամենայնիվ, մի քանի շաբաթվա ընթացքում Քայլայի ախտանիշները վատթարացան: Նա սկսեց զգալ ծնկների հոդացավեր, սրտի բաբախյուն և դեմքի մկանների տարօրինակ թուլություն։ Բացի այդ, նա տառապում էր պարանոցի կոշտությունից և ցավոտ գլխացավերից։ Դժկամությամբ նա որոշեց, որ ժամանակն է դիմել բժշկի։

  • Արդյո՞ք Քայլայի նոր ախտանիշները հուշում են, թե ինչպիսի վարակի կամ այլ բժշկական վիճակի կարող է նա ունենալ:
  • Ի՞նչ թեստեր կամ գործիքներ կարող է օգտագործել բուժաշխատողը Քայլայի ախտանիշներն առաջացնող պաթոգենը մատնանշելու համար:

Անցեք հաջորդ Կլինիկական կենտրոնացման վանդակին: Վերադարձեք նախորդ Կլինիկական ուշադրության տուփին:

Ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ

Կան մի շարք իրավիճակներ, երբ հետազոտողը կարող է ֆիզիկապես առանձնացնել տարբեր չափերի ԴՆԹ բեկորների հավաքածու: Հետազոտողը կարող է նաև մարսել ԴՆԹ-ի նմուշը սահմանափակող ֆերմենտով՝ բեկորներ ձևավորելու համար: Ստացված չափը և բեկորների բաշխման օրինակը հաճախ կարող են օգտակար տեղեկություններ հաղորդել ԴՆԹ-ի հիմքերի հաջորդականության մասին, որոնք կարող են օգտագործվել, ինչպես շտրիխ կոդի սկանավորումը, նույնականացնելու այն անհատին կամ տեսակին, որին պատկանում է ԴՆԹ-ն:

Գելային էլեկտրոֆորեզը սովորաբար օգտագործվում է կենսաբանական մոլեկուլները առանձնացնելու համար `չափի և կենսաքիմիական բնութագրերի հիման վրա, ինչպիսիք են լիցքը և բևեռականությունը: Ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզը լայնորեն օգտագործվում է տարբեր չափերի ԴՆԹ (կամ ՌՆԹ) առանձնացնելու համար, որոնք կարող են առաջանալ սահմանափակող ֆերմենտի մարսողության կամ այլ միջոցներով, ինչպիսին է ՊՇՌ-ն (Նկար 12.14):

Բացասական լիցքավորված ողնաշարի պատճառով ԴՆԹ -ն ուժեղ էլեկտրոդ է գրավում: Ագարոզե գելի էլեկտրոֆորեզում գելը հորիզոնական կողմնորոշված ​​է բուֆերային լուծույթի մեջ: Նմուշները բեռնվում են նմուշի հորերի մեջ՝ գելի կողմից բացասական էլեկտրոդին ամենամոտ կողմում, այնուհետև քաշվում են ագարոզայի մատրիցի մոլեկուլային մաղի միջով դեպի դրական էլեկտրոդ: Ագարոզային մատրիցան խոչընդոտում է ավելի մեծ մոլեկուլների շարժը գելի միջով, մինչդեռ փոքր մոլեկուլներն ավելի հեշտությամբ են անցնում: Այսպիսով, միգրացիայի հեռավորությունը հակադարձ փոխկապակցված է ԴՆԹ -ի բեկորի չափի հետ, իսկ ավելի փոքր բեկորները գելի միջով անցնում են ավելի մեծ տարածություն: Նմուշի ներսում ԴՆԹ-ի բեկորների չափերը կարելի է գնահատել՝ համեմատելով ԴՆԹ-ի սանդուղքի հայտնի չափերի բեկորների հետ, որոնք նույնպես աշխատում են նույն գելի վրա: ԴՆԹ-ի շատ մեծ բեկորներ առանձնացնելու համար, ինչպիսիք են քրոմոսոմները կամ վիրուսային գենոմները, ագարոզե գելի էլեկտրոֆորեզը կարող է փոփոխվել `պարբերաբար փոխելով էլեկտրական դաշտի կողմնորոշումը իմպուլսային դաշտի գելային էլեկտրոֆորեզի (PFGE) ընթացքում: PFGE- ում փոքր բեկորները կարող են վերակողմնորոշվել և մի փոքր ավելի արագ տեղաշարժվել, քան ավելի մեծ բեկորները: Այս տեխնիկան կարող է ծառայել առանձնացնել շատ մեծ բեկորներ, որոնք հակառակ դեպքում միասին կշարժվեին ագարոզե գելի ստանդարտ էլեկտրոֆորեզի ժամանակ: Այս էլեկտրոֆորեզի տեխնիկայից որևէ մեկում գելում ԴՆԹ -ի կամ ՌՆԹ -ի բեկորների տեղերը կարող են հայտնաբերվել տարբեր մեթոդներով: Տարածված մեթոդներից մեկը էթիդիումի բրոմիդի ավելացումն է՝ բիծ, որը ներթափանցում է նուկլեինաթթուների մեջ ոչ հատուկ վայրերում և կարող է տեսանելի լինել, երբ ենթարկվում է ուլտրամանուշակագույն լույսի: Այժմ առկա են այլ բծեր, որոնք ավելի անվտանգ են, քան պոտենցիալ քաղցկեղածին էթիդիում բրոմիդը:

Սահմանափակման հատվածի երկարության պոլիմորֆիզմի (RFLP) վերլուծություն

Սահմանափակող ֆերմենտների ճանաչման վայրերը կարճ են (մի քանի նուկլեոտիդների երկարություն), հաջորդականության հատուկ պալինդրոմներ և կարող են հայտնաբերվել ամբողջ գենոմում: Այսպիսով, անհատների գենոմներում ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների տարբերությունները կհանգեցնեն սահմանափակող-ֆերմենտային ճանաչման վայրերի բաշխման տարբերություններին, որոնք կարող են պատկերացվել որպես գելային տարբեր գրաֆիկական ձևեր ագարոզե գելի էլեկտրոֆորեզից հետո: Սահմանափակող հատվածի երկարության պոլիմորֆիզմը (RFLP) վերլուծությունը համեմատում է ԴՆԹ -ի տարբեր նմուշների ԴՆԹ -ի շերտերի ձևերը սահմանափակ մարսումից հետո (Նկար 12.15):

RFLP վերլուծությունը բազմաթիվ գործնական կիրառություններ ունի ինչպես բժշկության, այնպես էլ դատական ​​գիտության մեջ: Օրինակ, համաճարակաբաններն օգտագործում են RFLP վերլուծությունը ՝ հետևելու և բացահայտելու սննդամթերքի թունավորման կամ որոշ վարակիչ հիվանդությունների բռնկման մեջ ներգրավված հատուկ միկրոօրգանիզմների աղբյուրը: RFLP- ի վերլուծությունը կարող է օգտագործվել նաև մարդու ԴՆԹ -ի վրա `որոշելու համար տարբեր գեներով քրոմոսոմների ժառանգական ձևերը, ներառյալ ժառանգական հիվանդությունների հետ կապված կամ հայրությունը հաստատելու համար:

Դատաբժշկական գիտնականները RFLP վերլուծությունը օգտագործում են որպես ԴՆԹ մատնահետքի ձև, որն օգտակար է հանցագործության վայրերից, կասկածյալներից և զոհերից ստացված ԴՆԹ -ի վերլուծության համար: ԴՆԹ -ի նմուշները հավաքվում են, նմուշի ԴՆԹ -ի մոլեկուլների պատճենները ավելանում են PCR- ի միջոցով, այնուհետև ենթարկվում են սահմանափակող ֆերմենտների մարսման և ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզի ՝ որոշակի շերտերի ձևավորման համար: Համեմատելով հանցագործության վայրից հավաքված նմուշների ՝ կասկածյալներից կամ զոհերից հավաքվածների հետ համակցված օրինաչափությունները ՝ քննիչները կարող են վերջնականապես որոշել ՝ դեպքի վայրում հավաքված ԴՆԹ ապացույցները կասկածյալների կամ զոհերի հետևում են թողնված:

Հարավային բլոտներ և փոփոխություններ

Մի քանի մոլեկուլային տեխնիկա օգտվում են նմուշի նուկլեինաթթուների և ԴՆԹ զոնդերի միջև հաջորդականության լրացումից և հիբրիդացումից: Սովորաբար, գելի մեջ նուկլեինաթթվի նմուշների հետազոտումը անհաջող է, քանի որ քանի որ ԴՆԹ-ի զոնդը ներծծվում է գելի մեջ, գելի ներսում նուկլեինաթթուների նմուշը ցրվում է: Այսպիսով, բլոտավորման մեթոդները սովորաբար օգտագործվում են նուկլեինաթթուները նիտրոցելյուլոզից կամ նեյլոնից պատրաստված բարակ, դրական լիցքավորված թաղանթ տեղափոխելու համար: Սըր Էդվին Սաուերնի կողմից 1975 թվականին մշակված Southern blot տեխնիկայում նմուշի ներսում ԴՆԹ-ի բեկորները սկզբում առանձնացվում են ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով և այնուհետև տեղափոխվում թաղանթ մազանոթային գործողության միջոցով (Նկար 12.16): ԴՆԹ-ի բեկորները, որոնք կապվում են մեմբրանի մակերեսին, այնուհետև ենթարկվում են հատուկ միաշղթա ԴՆԹ հետազոտության, որը պիտակավորված է ռադիոակտիվ կամ լյումինեսցենտային մոլեկուլային փարոսով, որպեսզի օգնի հայտնաբերել: Southern blots-ը կարող է օգտագործվել տվյալ ԴՆԹ-ի նմուշում որոշակի ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների առկայությունը հայտնաբերելու համար: Հենց որ մեմբրանի ներսում թիրախ ԴՆԹ-ն տեսանելի լինի, հետազոտողները կարող են կտրել մեմբրանի այն հատվածը, որը պարունակում է հատվածը՝ վերականգնելու համար հետաքրքրող ԴՆԹ-ի հատվածը:

Հարավային բծի տատանումները՝ կետային բլոտը, սլոտային բծը և բծային բծը, չեն ներառում էլեկտրոֆորեզ, այլ փոխարենը նմուշից ԴՆԹ-ն կենտրոնացնում են թաղանթի վրա փոքր տեղ: ԴՆԹ-ի զոնդով հիբրիդացումից հետո հայտնաբերված ազդանշանի ինտենսիվությունը չափվում է, ինչը թույլ է տալիս հետազոտողին գնահատել նմուշի ներսում առկա թիրախ ԴՆԹ-ի քանակը:

Գաղութի բլոտը Հարավային բլոտի մեկ այլ տատանում է, որում գենոմային գրադարանում տարբեր կլոններ ներկայացնող գաղութները փոխանցվում են թաղանթ `թաղանթը սեղմելով մշակույթի ափսեի վրա: Մեմբրանի վրա բջիջները լիզվում են, և այնուհետև թաղանթը կարող է զննվել՝ որոշելու համար, թե գենոմային գրադարանի որ գաղութներում է գտնվում թիրախային գենը: Քանի որ ափսեի գաղութները դեռ աճում են, հետաքրքրության բջիջները կարող են մեկուսացվել ափսեից:

Հյուսիսային բլոտում Հարավային բծի մեկ այլ տարբերակ՝ ՌՆԹ-ն (ոչ ԴՆԹ) անշարժացվում է թաղանթի վրա և հետազոտվում: Հյուսիսային բլոտները սովորաբար օգտագործվում են հյուսվածքի կամ օրգանիզմի նմուշում գենային արտահայտման միջոցով արված mRNA- ի քանակությունը հայտնաբերելու համար:

Microarray վերլուծություն

Մեկ այլ տեխնիկա, որը կապիտալիզացնում է նուկլեինաթթվի լրացուցիչ հաջորդականությունների միջև հիբրիդացումը, կոչվում է միկրոզանգվածի վերլուծություն: Միկրոզանգվածի վերլուծությունը օգտակար է բջիջների տարբեր տեսակների միջև գենային արտահայտման ձևերի համեմատության համար, օրինակ ՝ վիրուսով վարակված բջիջներն ընդդեմ չպաշտպանված բջիջների, կամ քաղցկեղային բջիջներն ընդդեմ առողջ բջիջների (Նկար 12.17):

Սովորաբար, փորձնական նմուշի ԴՆԹ -ն կամ cDNA- ն տեղադրվում են ապակու սահնակին ՝ ԴՆԹ -ի հայտնի հաջորդականությունների կողքին: Յուրաքանչյուր սլայդ կարող է պահել ավելի քան 30,000 տարբեր ԴՆԹ -ի բեկորների տեսակներ: Առանձնացված ԴՆԹ -ի բեկորները (ներառելով օրգանիզմի ամբողջ գենոմային գրադարանը) կամ cDNA- ի բեկորները (որոնք համապատասխանում են օրգանիզմի արտահայտված գեների ամբողջական լրացմանը) կարող են առանձին դիտվել ապակու սահիկի վրա:

Սլայդի վրա պահվելուց հետո գենոմային ԴՆԹ-ն կամ mRNA-ն կարելի է առանձնացնել երկու նմուշներից՝ համեմատության համար: Եթե ​​mRNA-ն մեկուսացված է, այն հակադարձ տառադարձվում է cDNA-ի, օգտագործելով հակադարձ տրանսկրիպտազը: Այնուհետև գենոմային ԴՆԹ-ի կամ cDNA-ի երկու նմուշները պիտակավորված են տարբեր լյումինեսցենտային ներկերով (սովորաբար կարմիր և կանաչ): Այնուհետև պիտակավորված գենոմային ԴՆԹ-ի նմուշները համակցվում են հավասար քանակությամբ, ավելացվում են միկրոզանգվածի չիպին և թույլ են տալիս հիբրիդացվել միկրոզանգվածի լրացուցիչ բծերի հետ:

Նմուշի գենոմային ԴՆԹ-ի մոլեկուլների հիբրիդացումը կարող է վերահսկվել՝ չափելով ֆլյուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը միկրոզանգվածի որոշակի կետերում: Նմուշների միջև հիբրիդացման քանակի տարբերությունները կարելի է հեշտությամբ նկատել: Եթե ​​միայն մեկ նմուշի նուկլեինաթթուները հիբրիդացվում են միկրոզանգվածի որոշակի կետի վրա, ապա այդ տեղը կամ կանաչ կամ կարմիր տեսք կունենա: Այնուամենայնիվ, եթե երկու նմուշների նուկլեինաթթուները հիբրիդացվեն, ապա կարմիր և կանաչ ներկերի համադրության պատճառով բիծը դեղին կդառնա:

Չնայած միկրոզանգվածային տեխնոլոգիան թույլ է տալիս կարճ ժամանակում երկու նմուշների միջև համընդհանուր համեմատություն անցկացնել, այն պահանջում է հայտնաբերման բարդ (և թանկարժեք) սարքավորումներ և վերլուծական ծրագրեր: Ծախսերի պատճառով այս տեխնոլոգիան սովորաբար սահմանափակվում է հետազոտական ​​պարամետրերով: Հետազոտողները միկրոզանգի վերլուծության միջոցով ուսումնասիրել են, թե ինչպես է գենի արտահայտվածությունը ազդում այն ​​օրգանիզմների վրա, որոնք վարակված են բակտերիաներով կամ վիրուսներով կամ ենթարկվում են որոշակի քիմիական բուժման:

Հղում դեպի ուսուցում

Ուսումնասիրեք միկրոչիպերի տեխնոլոգիան այս ինտերակտիվ կայքում:

Ստուգեք ձեր հասկացողությունը

  • Ինչի՞ց է բաղկացած ԴՆԹ զոնդը:
  • Ինչու՞ է Հարավային բլոտը օգտագործվում ԴՆԹ -ի մարսողության գելային էլեկտրոֆորեզից հետո:

Սպիտակուցների մոլեկուլային վերլուծություն

Շատ դեպքերում գուցե ցանկալի կամ հնարավոր չէ ուղղակիորեն ուսումնասիրել ԴՆԹ -ն կամ ՌՆԹ -ն: Սպիտակուցները կարող են տրամադրել տեսակների համար հատուկ տեղեկատվություն նույնականացման համար, ինչպես նաև կարևոր տեղեկատվություն այն մասին, թե ինչպես և արդյոք բջիջը կամ հյուսվածքը արձագանքում են պաթոգեն միկրոօրգանիզմի առկայությանը: Տարբեր սպիտակուցներ պահանջում են մեկուսացման և բնութագրման տարբեր մեթոդներ:

Պոլիակրիլամիդային գել էլեկտրոֆորեզ

Գելային էլեկտրոֆորեզի մի տարբերակ, որը կոչվում է պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզ (PAGE), սովորաբար օգտագործվում է սպիտակուցների բաժանման համար: PAGE-ում գելային մատրիցը ավելի նուրբ է և ագարոզայի փոխարեն բաղկացած է պոլիակրիլամիդից: Բացի այդ, PAGE- ը սովորաբար կատարվում է ուղղահայաց գել ապարատի միջոցով (Նկար 12.18): Ամինաթթուների կողային շղթաների հետ կապված տարբեր լիցքերի պատճառով PAGE-ը կարող է օգտագործվել անձեռնմխելի սպիտակուցներն առանձնացնելու համար՝ հիմնվելով դրանց զուտ լիցքերի վրա: Որպես այլընտրանք, սպիտակուցները կարող են դենատուրացվել և ծածկվել բացասաբար լիցքավորված լվացող միջոցով, որը կոչվում է նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատ (SDS), որը քողարկում է բնածին լիցքերը և թույլ տալով տարանջատում միայն չափի հիման վրա: Էջը կարող է հետագայում փոխվել ՝ առանձին սպիտակուցներ հիմք ընդունելով երկու բնութագրի հիման վրա, ինչպիսիք են դրանց լիցքերը տարբեր pH- ներում, ինչպես նաև դրանց չափերը ՝ երկչափ Էջի օգտագործման միջոցով: Այս ցանկացած դեպքից հետո, էլեկտրոֆորեզից հետո, սպիտակուցները տեսանելի են դառնում ներկման միջոցով, սովորաբար կամ Coomassie blue- ով կամ արծաթով:

Ստուգեք ձեր հասկացողությունը

Կլինիկական կենտրոնացում

Մաս 3

Երբ Կեյլան նկարագրեց իր ախտանիշները, նրա բժիշկը սկզբում կասկածեց բակտերիալ մենինգիտի մասին, որը համահունչ է նրա գլխացավերին և պարանոցի կոշտությանը: Այնուամենայնիվ, նա շուտով դա բացառեց որպես հավանականություն, քանի որ մենինգիտը սովորաբար ավելի արագ է զարգանում, քան այն, ինչ զգում էր Կայլան: Նրա ախտանիշներից շատերը դեռևս նման էին ամիոտրոֆիկ կողային սկլերոզի (ALS) և համակարգային կարմիր գայլախտի (SLE) ախտանիշներին, և բժիշկը նաև Լայմի հիվանդությունը հավանական համարեց՝ հաշվի առնելով, թե որքան ժամանակ է Քայլան անցկացնում անտառում: Քայլան չէր հիշում տզերի վերջին խայթոցները (սովորական միջոց, որով փոխանցվում է Լայմի հիվանդությունը) և նա չուներ ցուլի աչքի տիպիկ ցան, որը կապված էր Լայմի հիվանդության հետ (Նկար 12.19): Այնուամենայնիվ, Լայմի հիվանդությամբ հիվանդների 20-30% -ը երբեք չեն առաջացնում այս ցանը, ուստի բժիշկը չցանկացավ դա բացառել:

Կեյլայի բժիշկը պատվիրեց ուղեղի ՄՌՏ, անեմիայի անալիզի համար արյան ամբողջական հաշվարկ, արյան թեստեր, որոնք գնահատում են լյարդի և երիկամների աշխատանքը և լրացուցիչ թեստեր `հաստատելու կամ բացառելու SLE կամ Lyme հիվանդությունը: Նրա թեստի արդյունքները անհամատեղելի էին ինչպես SLE- ի, այնպես էլ ALS- ի հետ, և Լայմի հիվանդության հակամարմիններ փնտրող թեստի արդյունքը «երկիմաստ» էր, ինչը նշանակում էր անորոշ: Բացառելով ALS և SLE- ն ՝ Կեյլայի բժիշկը որոշեց լրացուցիչ հետազոտություններ անցկացնել Լայմի հիվանդության համար:

  • Ինչու՞ Կայլայի բժիշկը դեռ կասկածում էր Լայմի հիվանդությանը, նույնիսկ եթե թեստի արդյունքները չեն հայտնաբերել արյան մեջ Լայմի հակամարմինները:
  • Ի՞նչ տեսակի մոլեկուլային թեստ կարող է օգտագործվել Լայմի հիվանդության դեմ արյան հակամարմինների հայտնաբերման համար:

Անցեք հաջորդ Կլինիկական կենտրոնացման վանդակին: Վերադարձեք նախորդ Կլինիկական ուշադրության տուփին:

Ամրապնդման վրա հիմնված ԴՆԹ-ի վերլուծության մեթոդներ

ԴՆԹ-ի հաջորդականություններ ստանալու համար կարող են օգտագործվել տարբեր մեթոդներ, որոնք օգտակար են հիվանդություն առաջացնող օրգանիզմների ուսումնասիրության համար: Արագ հաջորդականության տեխնոլոգիայի գալուստով պաթոգեն օրգանիզմների ողջ գենոմների մեր գիտելիքների բազան ֆենոմենալ աճեց: Մենք սկսում ենք պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի նկարագրությամբ, որը հաջորդականության մեթոդ չէ, բայց թույլ է տվել հետազոտողներին և բժիշկներին ստանալ մեծ քանակությամբ ԴՆԹ, որն անհրաժեշտ է հաջորդականության և այլ ուսումնասիրությունների համար: Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան վերացնում է այն կախվածությունը, որը մենք ժամանակին ունեինք բջիջներից ՝ ԴՆԹ -ի բազմակի պատճեններ պատրաստելու համար ՝ հասնելով նույն արդյունքի ՝ բջիջից դուրս համեմատաբար պարզ ռեակցիաների միջոցով:

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա (PCR)

ԴՆԹ -ի վերլուծության շատ մեթոդներ, ինչպիսիք են սահմանափակող ֆերմենտների մարսումը և ագարոզե գելի էլեկտրոֆորեզը կամ ԴՆԹ -ի հաջորդականացումը պահանջում են մեծ քանակությամբ հատուկ ԴՆԹ -ի բեկոր: Նախկինում մեծ քանակությամբ ԴՆԹ արտադրվում էր գենոմային գրադարանի ընդունող բջիջների աճեցմամբ: Այնուամենայնիվ, գրադարանները ժամանակ և ջանք են պահանջում պատրաստելու համար, և հետաքրքիր ԴՆԹ -ի նմուշները հաճախ գալիս են փոքր քանակությամբ: Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) թույլ է տալիս արագ ուժեղացնել հետագա ԴՆԹ -ի հաջորդականությունների կրկնօրինակների քանակը `հետագա անալիզի համար (Նկար 12.20): Մոլեկուլային կենսաբանության ամենահզոր տեխնիկաներից մեկը ՝ PCR- ն մշակվել է 1983 թվականին Քարի Մալլիսի կողմից ՝ Cetus Corporation- ում աշխատելու ընթացքում: PCR-ն ունի հատուկ կիրառություններ հետազոտական, դատաբժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում, այդ թվում՝

  • որոշելով ԴՆԹ -ի որոշակի շրջանում նուկլեոտիդների հաջորդականությունը
  • ԴՆԹ-ի թիրախային շրջանի ուժեղացում՝ պլազմիդ վեկտորի մեջ կլոնավորման համար
  • բացահայտել հանցագործության վայրում մնացած ԴՆԹ -ի նմուշի աղբյուրը
  • նմուշների վերլուծություն `հայրությունը որոշելու համար
  • համեմատելով հին ԴՆԹ-ի նմուշները ժամանակակից օրգանիզմների հետ
  • որոշելով դժվար մշակվող կամ անմշակ միկրոօրգանիզմների առկայությունը մարդկանց կամ բնապահպանական նմուշների մեջ

PCR-ն ան արհեստական ​​պայմաններում լաբորատոր տեխնիկա, որն օգտվում է ԴՆԹ -ի կրկնօրինակման բնական գործընթացից: PCR- ում օգտագործվող ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազային ֆերմենտները ստացվել են հիպերտերմոֆիլ պրոկարիոտներից: Taq ԴՆԹ պոլիմերազա , որը սովորաբար օգտագործվում է PCR- ում, ստացվում է Ջրային թերմուս Յելոուսթոուն ազգային պարկի տաք աղբյուրից մեկուսացված մանրէ: ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը պահանջում է պրայմերների օգտագործում՝ վերարտադրության մեկնարկի համար, որպեսզի ունենան ազատ 3'-հիդրօքսիլ խմբեր՝ ԴՆԹ պոլիմերազով նուկլեոտիդների ավելացման համար: Այնուամենայնիվ, մինչդեռ ՌՆԹ -ից կազմված պրիմերները սովորաբար օգտագործվում են բջիջներում, ԴՆԹ -ի այբբենարանները օգտագործվում են ՊՇՌ -ի համար: ԴՆԹ -ի պրիմերները նախընտրելի են իրենց կայունության շնորհիվ, և ԴՆԹ -ի որոշակի հատվածին հասցեագրված հայտնի հաջորդականությամբ ԴՆԹ -ի այբբենարանները կարող են քիմիապես սինթեզվել առևտրային առումով: Այս ԴՆԹ այբբենարանները ֆունկցիոնալորեն նման են նախկինում նկարագրված հիբրիդացման տարբեր տեխնիկայի համար օգտագործվող ԴՆԹ զոնդերին, որոնք կապվում են հատուկ թիրախների հետ `նպատակային ԴՆԹ հաջորդականության և պրիմերի միջև փոխլրացման շնորհիվ:

PCR- ն տեղի է ունենում մի քանի ցիկլերի ընթացքում, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում է երեք քայլ ՝ Denaturation, annealing, and extension. Մեքենաներ, որոնք կոչվում են ջերմային ցիկլեր, օգտագործվում են PCR-ի համար: Այս մեքենաները կարող են ծրագրավորվել ավտոմատ կերպով անցնելու յուրաքանչյուր քայլի համար պահանջվող ջերմաստիճանների միջով (Նկար 12.1): Նախ, թիրախային հաջորդականությունը պարունակող երկշղթայական կաղապարային ԴՆԹ-ն վերափոխվում է մոտավորապես 95 ° C ջերմաստիճանում: ԴՆԹ-ի շղթաները ֆիզիկապես (այլ ոչ թե ֆերմենտային) բաժանելու համար պահանջվող բարձր ջերմաստիճանը ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազի անհրաժեշտության պատճառն է: Հաջորդը, ջերմաստիճանը կնվազի մինչև մոտ 50 ° C: Սա թույլ է տալիս թիրախային հաջորդականության ծայրերին լրացնող ԴՆԹ -ի պրիմերները միաձուլել (կպչել) կաղապարի տողերին, իսկ յուրաքանչյուր շղթայի վրա `մեկ այբբենարան: Վերջապես, ջերմաստիճանը բարձրացվում է մինչև 72 °C՝ ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազի գործունեության օպտիմալ ջերմաստիճանը, որը թույլ է տալիս նուկլեոտիդներ ավելացնել այբբենարանին՝ օգտագործելով միաշղթա թիրախը որպես ձևանմուշ: Յուրաքանչյուր ցիկլ կրկնապատկում է երկշղթա թիրախային ԴՆԹ-ի պատճենների թիվը: Սովորաբար, PCR արձանագրությունները ներառում են 25-40 ցիկլեր, որոնք թույլ են տալիս ուժեղացնել մեկ թիրախային հաջորդականությունը տասնյակ միլիոններով մինչև ավելի քան մեկ տրիլիոն:

Բնական ԴՆԹ -ի կրկնօրինակը նախատեսված է ամբողջ գենոմը պատճենելու համար և սկսվում է մեկ կամ մի քանի ծագման վայրերում: Այբբենարանները կառուցվում են կրկնօրինակման ժամանակ, ոչ թե առաջ, և չեն բաղկացած մի քանի հատուկ հաջորդականությունից։ PCR-ը թիրախավորում է ԴՆԹ-ի նմուշի որոշակի շրջաններ՝ օգտագործելով հաջորդականության հատուկ պրայմերներ: Վերջին տարիներին մշակվել են մի շարք իզոթերմային PCR ուժեղացման մեթոդներ, որոնք շրջանցում են ջերմային հեծանվավազքի անհրաժեշտությունը ՝ օգտվելով լրացուցիչ սպիտակուցներից, որոնք օգնում են ԴՆԹ -ի վերարտադրման գործընթացին: Քանի որ այս մեթոդների զարգացումը շարունակվում է, և դրանց կիրառումը դառնում է ավելի լայնածավալ հետազոտական, դատաբժշկական և կլինիկական լաբորատորիաներում, ջերմային ցիկլերները կարող են հնանալ:

Ուսուցման հղում

Խորացրեք ձեր պատկերացումները պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի մասին՝ դիտելով այս անիմացիան և աշխատելով ինտերակտիվ վարժությունների միջոցով:

PCR տատանումներ

ՊՇՌ-ի մի քանի հետագա փոփոխությունները հետագայում մեծացնում են այս տեխնիկայի օգտակարությունը: Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) օգտագործվում է հատուկ mRNA մոլեկուլի ԴՆԹ պատճեններ ստանալու համար: RT-PCR-ն սկսվում է հակադարձ տրանսկրիպտազ ֆերմենտի օգտագործմամբ՝ mRNA մոլեկուլները cDNA-ի փոխակերպելու համար: Այդ cDNA-ն այնուհետև օգտագործվում է որպես ձևանմուշ ավանդական PCR ուժեղացման համար: RT-PCR- ն կարող է հայտնաբերել, թե արդյոք որոշակի գեն արտահայտված է եղել նմուշում: ՊՇՌ-ի մեկ այլ վերջին կիրառություն իրական ժամանակի ՊՇՌ-ն է, որը նաև հայտնի է որպես քանակական ՊՇՌ (qPCR): Ստանդարտ PCR և RT-PCR արձանագրությունները քանակական չեն, քանի որ ռեագենտներից որևէ մեկը կարող է սահմանափակվել մինչև արձանագրության բոլոր ցիկլերի ավարտը, իսկ նմուշները վերլուծվում են միայն վերջում: Քանի որ հնարավոր չէ որոշել, թե երբ է PCR կամ RT-PCR արձանագրությունում տվյալ ռեակտիվը սահմանափակող դարձել, հնարավոր չէ իմանալ, թե քանի ցիկլ է ավարտվել մինչ այս պահը, և, հետևաբար, հնարավոր չէ որոշել, թե քանի բնօրինակ Կաղապարի մոլեկուլները նմուշում առկա էին PCR-ի սկզբում: Այնուամենայնիվ, qPCR- ում ֆլուորեսցենցիայի օգտագործումը թույլ է տալիս վերահսկել երկշղթայական կաղապարի ավելացումը PCR ռեակցիայի ընթացքում, երբ դա տեղի է ունենում: Այս կինետիկ տվյալները այնուհետև կարող են օգտագործվել սկզբնական թիրախային հաջորդականության քանակը չափելու համար: qPCR-ի օգտագործումը վերջին տարիներին ավելի է ընդլայնել PCR-ի հնարավորությունները՝ թույլ տալով հետազոտողներին որոշել նմուշում առկա ԴՆԹ-ի պատճենների, իսկ երբեմն էլ օրգանիզմների քանակը: Կլինիկական պայմաններում qRT-PCR- ն օգտագործվում է ՄԻԱՎ-ով հիվանդների վիրուսային բեռը որոշելու համար `նրանց թերապիայի արդյունավետությունը գնահատելու համար:

ԴՆԹ-ի հաջորդականություն

Հաջորդականացման հիմնական տեխնիկան շղթայի դադարեցման մեթոդն է, որը հայտնի է նաև որպես դեոդոքսիայի մեթոդ կամ Sanger DNA հաջորդականության մեթոդ, որը մշակվել է Ֆրեդերիկ Սանգերի կողմից 1972 թվականին: լրացնող շղթայի, ԴՆԹ պոլիմերազի, չորս սովորական դեօքսինուկլեոտիդ (dNTP) մոնոմերների և մի փոքր մասնաբաժնի դեէօքսինուկլեոտիդների (ddNTP) սինթեզ սկսելու համար, որոնցից յուրաքանչյուրը պիտակավորված է մոլեկուլային փարոսով: DdNTP- ները մոնոմեր են, որոնցում բացակայում է հիդրոքսիլ խումբը (–OH) այն վայրում, որտեղ սովորաբար միանում է մեկ այլ նուկլեոտիդ ՝ շղթա ձևավորելու համար (Նկար 12.21): Ամեն անգամ, երբ ddNTP-ը պատահականորեն ներառվում է աճող լրացուցիչ շղթայի մեջ, այն դադարեցնում է ԴՆԹ-ի վերարտադրման գործընթացը տվյալ շղթայի համար: Սա հանգեցնում է կրկնօրինակված ԴՆԹ -ի բազմաթիվ կարճ տողերի, որոնք յուրաքանչյուրը ավարտվում է մեկ այլ կետում վերարտադրության ընթացքում: Երբ ռեակցիայի խառնուրդը ենթարկվում է գելային էլեկտրոֆորեզի, նոր վերարտադրված ԴՆԹ-ի բազմաթիվ շղթաները կազմում են տարբեր չափերի սանդուղք: Քանի որ ddNTP-ները պիտակավորված են, գելի վրա յուրաքանչյուր գոտի արտացոլում է ԴՆԹ-ի շղթայի չափը, երբ ddNTP-ն դադարեցրեց ռեակցիան:

Սանգերի օրոք ԴՆԹ -ի յուրաքանչյուր մոլեկուլի համար սահմանվում էր չորս ռեակցիա, որոնցից յուրաքանչյուրը պարունակում էր չորս հնարավոր ddNTP- ներից միայն մեկը: Յուրաքանչյուր ddNTP պիտակավորված էր ռադիոակտիվ ֆոսֆորի մոլեկուլով: Չորս ռեակցիաների արտադրանքն այնուհետև անցկացվեցին առանձին գոտիներով ՝ կողք կողքի, երկար ու նեղ PAGE գելերի վրա, իսկ տարբեր երկարությունների ժապավենները հայտնաբերվեցին ավտոռադիոգրաֆիայի միջոցով: Այսօր այս գործընթացը պարզեցվել է ddNTP- ների օգտագործմամբ, որոնցից յուրաքանչյուրը պիտակավորված է տարբեր գույնի լյումինեսցենտային ներկով կամ ֆտորոքրոմով (Նկար 12.22), մեկ հաջորդականացման ռեակցիայի մեջ, որը պարունակում է հաջորդ չորս հաջորդականությամբ հաջորդող չորս հնարավոր ddNTP- ներ (Նկար 12.23): Այս ֆտորոքրոմները հայտնաբերվում են լյումինեսցենտային սպեկտրոսկոպիայի միջոցով: Դետեկտորի կողքով անցնելիս յուրաքանչյուր գոտու ֆլուորեսցենտային գույնը որոշելը առաջացնում է կաղապարի շղթայի նուկլեոտիդային հաջորդականություն:

2005 թվականից լաբորատորիաների կողմից կիրառվող հաջորդականացման տեխնիկան ընկնում է հաջորդ սերնդի հաջորդականության հաջորդականության տակ, որը ԴՆԹ -ի արագ հաջորդականացման համար օգտագործվող ավտոմատացված տեխնիկայի խումբ է: Այս մեթոդները հեղափոխություն են կատարել մոլեկուլային գենետիկայի ոլորտում, քանի որ ցածր գնով դասավորվածները կարող են առաջացնել հարյուր հազարավոր կամ միլիոնավոր կարճ բեկորների հաջորդականություններ (25-ից 600 բազային զույգ) ընդամենը մեկ օրվա ընթացքում: Թեև հաջորդ սերնդի հաջորդականացման տեխնոլոգիաների մի քանի տարբերակներ արտադրվում են տարբեր ընկերությունների կողմից (օրինակ՝ 454 Life Sciences-ի pyrosequencing և Illumina-ի Solexa տեխնոլոգիաները), դրանք բոլորը թույլ են տալիս արագորեն հաջորդականացնել միլիոնավոր հիմքեր՝ դարձնելով ամբողջ գենոմների հաջորդականությունը համեմատաբար հեշտ, էժան, և սովորական: 454 հաջորդականությամբ (պիրոսեքվենինգ), օրինակ, ԴՆԹ-ի նմուշը մասնատված է 400-600-bp մեկ շղթայի բեկորների, փոփոխված ՝ յուրաքանչյուր հատվածի երկու ծայրերին ԴՆԹ-ի ադապտերների հավելումով: ԴՆԹ-ի յուրաքանչյուր բեկորն այնուհետև անշարժացվում է բշտիկի վրա և ուժեղացվում է PCR-ի միջոցով՝ օգտագործելով պրայմերներ, որոնք նախատեսված են ադապտերներին կցելու համար՝ ստեղծելով այդ ԴՆԹ-ի հատվածի բազմաթիվ պատճեններ պարունակող բշտիկ: Յուրաքանչյուր հատիկ այնուհետև դրվում է առանձին հորի մեջ, որը պարունակում է հաջորդականության ֆերմենտներ: To the well, each of the four nucleotides is added one after the other when each one is incorporated, pyrophosphate is released as a byproduct of polymerization, emitting a small flash of light that is recorded by a detector. This provides the order of nucleotides incorporated as a new strand of DNA is made and is an example of synthesis sequencing. Next generation sequencers use sophisticated software to get through the cumbersome process of putting all the fragments in order. Overall, these technologies continue to advance rapidly, decreasing the cost of sequencing and increasing the availability of sequence data from a wide variety of organisms quickly.

The National Center for Biotechnology Information houses a widely used genetic sequence database called GenBank where researchers deposit genetic information for public use. Upon publication of sequence data, researchers upload it to GenBank, giving other researchers access to the information. The collaboration allows researchers to compare newly discovered or unknown sample sequence information with the vast array of sequence data that already exists.

Link to Learning

View an animation about 454 sequencing to deepen your understanding of this method.

Case in Point

Using a NAAT to Diagnose a C. difficile Վարակ

Javier, an 80-year-old patient with a history of heart disease, recently returned home from the hospital after undergoing an angioplasty procedure to insert a stent into a cardiac artery. To minimize the possibility of infection, Javier was administered intravenous broad-spectrum antibiotics during and shortly after his procedure. He was released four days after the procedure, but a week later, he began to experience mild abdominal cramping and watery diarrhea several times a day. He lost his appetite, became severely dehydrated, and developed a fever. He also noticed blood in his stool. Javier’s wife called the physician, who instructed her to take him to the emergency room immediately.

The hospital staff ran several tests and found that Javier’s kidney creatinine levels were elevated compared with the levels in his blood, indicating that his kidneys were not functioning well. Javier’s symptoms suggested a possible infection with Clostridium difficile , a bacterium that is resistant to many antibiotics. The hospital collected and cultured a stool sample to look for the production of toxins A and B by C. difficile, but the results came back negative. However, the negative results were not enough to rule out a C. difficile infection because culturing of C. difficile and detection of its characteristic toxins can be difficult, particularly in some types of samples. To be safe, they proceeded with a diagnostic nucleic acid amplification test (NAAT). Currently NAATs are the clinical diagnostician’s gold standard for detecting the genetic material of a pathogen. In Javier’s case, qPCR was used to look for the gene encoding C. difficile toxin B (tcdB) When the qPCR analysis came back positive, the attending physician concluded that Javier was indeed suffering from a C. difficile infection and immediately prescribed the antibiotic vancomycin , to be administered intravenously. The antibiotic cleared the infection and Javier made a full recovery.

Because infections with C. difficile were becoming widespread in Javier’s community, his sample was further analyzed to see whether the specific strain of C. difficile could be identified. Javier’s stool sample was subjected to ribotyping and repetitive sequence-based PCR (rep-PCR) analysis. In ribotyping, a short sequence of DNA between the 16S rRNA and 23S rRNA genes is amplified and subjected to restriction digestion (Figure 12.24). This sequence varies between strains of C. difficile, so restriction enzymes will cut in different places. In rep-PCR, DNA primers designed to bind to short sequences commonly found repeated within the C. difficile genome were used for PCR. Following restriction digestion, agarose gel electrophoresis was performed in both types of analysis to examine the banding patterns that resulted from each procedure (Figure 12.25). Rep-PCR can be used to further subtype various ribotypes, increasing resolution for detecting differences between strains. The ribotype of the strain infecting Javier was found to be ribotype 27, a strain known for its increased virulence, resistance to antibiotics, and increased prevalence in the United States, Canada, Japan, and Europe. 4


Resources on Gel Electrophoresis

In addition, this video illustrates the basics of DNA extraction and gel electrophoresis in tomato:

The Plant and Soil Sciences eLibrary at the University of Nebraska-Lincoln has an informative lesson on gel electrophoresis, including an animation of the process:


Photo credit: Plant and Soil Sciences eLibrary

Another animation on gel electrophoresis can be found at the Dolan DNA Learning Center, part of The Cold Spring Harbor Laboratory:


Photo credit: The Dolan DNA Learning Center

The Genetics Science Learning Center at the University of Utah also has an animation on gel electrophoresis:


Photo credit: The Genetics Science Learning Center


03 Genetics SL

This page lists the understandings and skills expected for topic three. Օգտակար է վերանայման համար:
Detailed revison notes, activities and questions can be found on each of the sub-topic pages.

  • 3.1 Genes
  • 3.2 քրոմոսոմներ
  • 3.3 Meiosis
  • 3.4 Inառանգություն
  • 3.5 Genetic modification and biotechnology

3.1 Genes

  • Definition of a gene is, "a heritable factor that consists of a length of DNA and influences a specific characteristic."
  • A gene locus is, "the specific position of a gene on a chromosome."
  • Alleles are, "The various specific forms of a gene which differ from each other by one or only a few bases".
  • New alleles are formed by mutation.
  • A genome is, "the whole of the genetic information of an organism."
  • The entire base sequence of human genes was sequenced in the Human Genome Project.
  • The Genbank® database can be used to search for DNA base sequences.

Skills ( can you . )

  • Explain the causes of sickle cell anemia, including a base substitution mutation, subsequent change to the mRNA transcribed from it and a change to the sequence of amino acids in a polypeptide of hemoglobin.
  • Recall of one specific base substitution that causes glutamic acid to be substituted by valine as the sixth amino acid in the hemoglobin polypeptide is required. (Deletions, insertions and frame shift mutations are ոչ needed.)
  • Compare the number of genes in humans with other species.
    At least one plant and one bacterium should be included in the comparison and at least one species with more genes and one with fewer genes than a human.
    (note: "genome size" is total amount of DNA, not the number of genes in a species)
  • Use of a database to determine differences in the base sequence of a gene in two species. Look up "GENBANK"

3.2 քրոմոսոմներ

  • Prokaryotes have one single circular DNA molecules as a chromosome.
  • Some prokaryotes also have plasmids but eukaryotes don't.
  • Eukaryote chromosomes are linear DNA molecules associated with histone proteins.
  • In a eukaryote species there are a characteristic number of different chromosomes each carrying different genes.
  • Pairs of chromosomes with the same sequence of genes (not necessarily the same alleles) are "Homologous chromosomes"
  • Diploid nuclei have pairs of homologous chromosomes.
  • Haploid nuclei have one chromosome of each pair.
  • Sister chromatids are the two DNA molecules formed by DNA replication before cell division
  • two separate chromosomes are formed at the splitting of the centromere at the start of anaphase.
  • A karyogram (a chart) shows the chromosomes of an organism in homologous pairs of decreasing length. (Karyotype is the number and type of chromosomes present in the nucleus)
  • Sex chromosomes determine the gender of an individual and autosomes are chromosomes that do not determine sex.

Skills (can you . )

  • Understand Cairns&rsquo technique for measuring the length of DNA molecules by autoradiography.
  • Compare genome size in T2 phage, Escherichia coli, Drosophila melanogaster, Homo sapiens և Paris japonica. (selected for points of interest.Genome size comparative activity
  • Use karyograms to compare diploid chromosome numbers of Homo sapiens, Pan troglodytes, Canis familiaris, Oryza sativa, Parascaris equorum.
  • Use karyograms to deduce sex and diagnose Down syndrome in humans.
  • Use of databases to identify the locus of a human gene and its polypeptide product

3.3 Meiosis

  • Meiosis produces four haploid nuclei from one diploid nucleus.
  • Haploid nuclei allow a life cycle with fusion of gametes.
  • DNA is replicated before meiosis so that all chromosomes at start of meiosis are 'double stranded' with two sister chromatids.
  • The early stages of meiosis involve pairing of homologous chromosomes and crossing over followed by condensation.
  • Random orientation of pairs of homologous chromosomes.
  • Separation of pairs of homologous chromosomes in the first division of meiosis halves the chromosome number.
  • Genetic variation is the result of crossing over and random orientation.
  • Different parents providing gametes promotes genetic variation.

Skills ( can you . )

  • Describe how non-disjunction can cause Downs syndrome and other chromosome abnormalities.
  • Remember studies showing age of parents influences chances of non-disjunction.
  • Describe methods used to obtain cells for karyotype analysis e.g. քորիոն վիլուսի նմուշառում և ամնիոցենտեզ և դրա հետ կապված ռիսկերը:
  • Draw diagrams to show the stages of meiosis (possibly using prepared slides), and resulting in the formation of four haploid cells. (Chiasmata not required)

3.4 Inառանգություն

  • Mendel experiments with pea plants showing his rules of inheritance.
  • Gametes are haploid so contain only one allele of each gene.
  • The two alleles of each gene separate independently during meiosis.
  • Fusion of gametes results in diploid zygotes with two alleles of each gene.
  • Dominant alleles mask the effects of recessive alleles but co-dominant alleles have joint effects.
  • Many genetic diseases in humans are due to recessive, dominant or co-dominant alleles of autosomal genes.
  • Some genetic diseases are sex-linked, shown as superscript letters eg. X h . The pattern of inheritance is different due to their location on sex chromosomes.
  • Many genetic diseases have been identified in humans & most are very rare.
  • Radiation and mutagenic chemicals increase the mutation rate and can cause genetic diseases and cancer.

Skills (can you . )

  • Explain the inheritance of ABO blood groups.using I A , I B or i allele notation.
  • Explain inheritance of red-green colour blindness and hemophilia as examples of sex-linked inheritance.
  • Explain the autosomal inheritance of cystic fibrosis and Huntington&rsquos disease.
  • Construct Punnett grids for monohybrid genetic crosses.
  • Compare predicted and actual outcomes of genetic crosses using real data.
  • Analyse pedigree charts and to deduce the pattern of inheritance of genetic diseases.

3.5 Genetic Modification

  • Gel electrophoresis is used for the separation of fragments of DNA (or proteins).
  • PCR (polymerase chain reaction) can be used to make many copies of small amounts of DNA. (called amplification)
  • DNA profiling uses PCR and gel electrophoresis to compare samples of DNA (eg. in paternity disputes)
  • Genetic modification is the transfer of genes from one species to another.
  • Clones are groups of genetically identical organisms, derived from a single original parent cell.
  • Many plant species and some animal species have natural methods of cloning.
  • Animals can be cloned at the embryo stage by breaking up the embryo into more than one group of cells. or by using differentiated cells in adults.
  • The cloned sheep, Dolly can be used as an example of the cloning method of somatic-cell nuclear transfer.

Skills (can you . )

  • Use images of DNA profiling to solve paternity disputes and other forensic examples.
  • Explain that Gene transfer using plasmids in bacteria makes use of the enzymes restriction endonucleases and DNA ligase.
  • Assess the potential risks and benefits of GMO crops, including data on risks to monarch butterflies of Bt crops.
  • Design of an experiment to assess one factor affecting the rooting of stem-cuttings of a plant which easily produces roots in soil.

Chromosomes 3.2

Chromosomes are circular in prokaryotes and linear in eukaryotes. The number of chromosomes is a characteristic of eukaryote species. The structure and shape of the chromosomes in an organism can also give information about the genetic diseases and gender.

Genes 3.1

Genes provide the instructions to build proteins and more besides. The human genome has been decoded by the human genome project and now biologists can search databases to find the location of specific genes.

Genetic Modification 3.5

The ability to find the sequence of the DNA code has provided new tools for biologists to investigate and manipulate DNA. These tools include PCR, gel electrophoresis, DNA profiling, genetic modification. This topic covers these techniques.

Inheritance 3.4

Theoretical genetics started with Gregor Mendel who established some simple rules of inheritance based on the idea that characteristics or "traits" are inherited independently. The gametes carry a single copy of any gene which becomes a pair of alleles.

Meiosis 3.3

Meiosis is the process which allows sexual reproduction to be possible. It produces four haploid cells which make gametes. In this topic you cover how the chromosomes move during meiosis, crossing over of chromatids and non-disjunction.


11.2: DNA Analysis - Gel Electrophoresis - Biology

The development of gel electrophoresis began with the pioneering work of Arne Tiselius , a Swedish biochemist who had published his first paper on electrophoresis in the paper "A New Apparatus for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures" in 1937 and awarded the Noble prize on his work in 1948. This work was known as Tiselius’ landmark moving boundary electrophoresis (MBE) which used a U-shaped tank with an electrode at either end and had effectively separate the molecules in free solution. Arne Tiselius' moving boundary electrophoresis method was in general use after its invention and soon replaced by zone electrophoresis (ZE) in the 1950s, which separate the molecules in a variety of solid supporting media such as filter paper, cellulose and starch grains.

The term “electrophoresis” was generated from the Greek word “phoresis”, which carry the meaning of ‘being carried’, and primarily referred to the migration of charged particles in an electrical field. Since the 1980s, these related techniques have evolved rapidly to become indispensable bioanalytical tools, and became the fundamental for a variety of biochemical methods, includes DNA fingerprinting, Western blot, Southern blot and others today.

Besides, it is an important preparative technique to fractionally purify the desired biomolecules (DNA) before further characterization and identification by other advanced molecular technique and technology such as DNA sequencing or polymerase chain reaction (PCR) .


Developing RFLP probes

  • Total DNA is digested with a methylation-sensitive enzyme (for example, PstI), thereby enriching the library for single- or low-copy expressed sequences (PstI clones are based on the suggestion that expressed genes are not methylated).
  • The digested DNA is size-fractionated on a preparative agarose gel, and fragments ranging from 500 to 2000 bp are excised, eluted and cloned into a plasmid vector (for example, pUC18).
  • Digests of the plasmids are screened to check for inserts.
  • Southern blots of the inserts can be probed with total sheared DNA to select clones that hybridize to single- and low-copy sequences.
  • The probes are screened for RFLPs using genomic DNA of different genotypes digested with restriction endonucleases. Typically, in species with moderate to high polymorphism rates, two to four restriction endonucleases are used such as EcoRI

  • Գրառման հեղինակ ՝ ադմինիստրատոր
  • Post published: May 8, 2020
  • Post category: Science
  • Post comments: 0 Comments

Gel electrophoresis refers to the process by which macromolecules are separated and analyzed. These macromolecules are DNA, RNA, and proteins. The analysis process is usually dependent on the macromolecules’ size and charge. Gel electrophoresis mainly finds application in clinical chemistry. However, with the advancement in technology, gel electrophoresis is now being applied in other fields, as this article discusses.

Uses of Gel Electrophoresis

The following are 10 main uses of gel electrophoresis

1. Forensics

In forensics, gel electrophoresis is usually performed so as to acquire a DNA fragment of the suspect. It helps to determine if the DNA fingerprint piece found at the location of the crime, and the one belonging to the suspect are a match. Simply put, gel electrophoresis helps to catch criminals.

2. Molecular Biology

Gel electrophoresis is a commonly performed procedure in molecular biology. It is used for the separation and organization of DNA, RNA, and proteins, based on their size. The separation makes it easy to study macromolecules at the molecular level.

3. Genetics

In genetics, gel electrophoresis is used to display a clear picture of DNA. The procedure is also used for preparing DNA for cloning processes, or for genetic engineering.

4. Microbiology

Microbiology is all about the study of plants and animals, at their tiniest levels. Gel electrophoresis procedure helps to pull out information about organisms, at their smallest levels. It is, therefore, an important procedure in microbiology. Microbiologists also use gel electrophoresis in the diagnosis of the different varieties of virus strains.

5. Biochemistry

Biochemistry is mostly associated with the study of proteins and nucleic acids. Mapping out of the proteins and nucleic acids can be done using gel electrophoresis.

6. DNA Analysis

Gel electrophoresis is used to identify DNA and its fragments. The gel used in this process is usually agarose gel, or alternatively, acrylamide gel. These gels ‘freeze’ the DNA fragments, such that they are studied well under a high resolution.

7. Behaviors of Proteins and Antibodies

Certain proteins and antibodies behave and interact in unique ways. Their behavior can be analyzed through gel electrophoresis. The specific type of electrophoresis used to examine these behaviors is immuno-electrophoresis.

8. Testing Antibiotics

Gel electrophoresis can be used in the testing of antibiotics. It is used to test how pure the antibiotics are, as well as their concentration. The concentration of antibiotics is essential as it influences how dosages are applied.

9. Testing Vaccines


Creating and producing vaccines involves the gel electrophoresis process. Vaccines work by boosting the immune system to produce antibodies that fight pathogens. Gel electrophoresis is used to detect these antibodies.

10. Checking DNA contamination

Genomic DNA contamination can be identified by carrying out a gel electrophoresis procedure. The gel electrophoresis is done on RNA samples. It can also be used for checking RNA degradation.

Եզրակացություն

Today, when you watch the news and see the news about a criminal brought before the judges, remember that were it not for gel electrophoresis, justice would not have been granted. And, this is just but one of the major benefits that gel electrophoresis has. There are many other benefits of gel electrophoresis, which has helped make our world more peaceful and transparent.


Դիտեք տեսանյութը: 5 մեդալ. ներկայացվել են կիրառական կենսաբանության միջազգային օլիմպիադայի արդյունքները (Հունվարի 2023).