Տեղեկատվություն

Ինչպե՞ս կարող եմ կարդալ ՌՆԹ-ի արտահայտման օրինակը:

Ինչպե՞ս կարող եմ կարդալ ՌՆԹ-ի արտահայտման օրինակը:


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Հիվանդությունների մասին կարդալիս կարելի է գտնել կապեր սպիտակուցների և դրանց հետ կապված գեների հետ, որոնց օրինակն այստեղ է։

Ինձ հետաքրքրում է, թե ինչպես կարելի է վերծանել/կարդալ հետևյալ գրաֆիկը ՝ որպես այս ոլորտում ոչ մասնագետ:

Ի՞նչ է նշանակում այդ ամենը:


Այս պատկերը ցույց է տալիս գենի (ձեր դեպքում Lamin A/C) արտահայտությունը տարբեր հյուսվածքներում: Մկնիկի համար ավելի բարձր արդյունքով նկարն այսպիսին է թվում (այստեղից).

Դուք կարող եք տեսնել միջին արտահայտությունը (հաշվարկված բոլոր նմուշներից) և կարող եք նաև տեսնել, թե որ հյուսվածքներում է այս գենը բարձր արտահայտված, և որոնցում կա ավելի քիչ կամ բացակայում է արտահայտությունը:

Սա կարևոր է, եթե ցանկանում եք վերլուծել գենի գործառույթը: Հյուսվածքների հատուկ արտահայտման օրինակը կարող է խիստ տարբեր լինել տարբեր հյուսվածքների միջև (ինչպես տեսնում եք նկարում), ինչը կարող է տեղեկատվություն տալ գենի գործառույթի մասին: Նույնը ճիշտ է, եթե նայեք գենի արտահայտման ժամանակի բաշխմանը, կարող եք բացահայտել գեները, որոնք կարևոր են տարբերակման տարբեր քայլերի համար:


Ինչպե՞ս կարող եմ կարդալ ՌՆԹ-ի արտահայտման օրինակը: - Կենսաբանություն

Որպեսզի բջիջը նորմալ գործի, անհրաժեշտ սպիտակուցները պետք է սինթեզվեն ճիշտ ժամանակին: Բոլոր բջիջները վերահսկում կամ կարգավորում են սպիտակուցների սինթեզը իրենց ԴՆԹ -ում կոդավորված տեղեկատվությունից: ՌՆԹ և սպիտակուց արտադրելու համար գենը միացնելու գործընթացը կոչվում է գենի արտահայտում. Անկախ նրանից՝ պարզ միաբջիջ օրգանիզմում, թե բարդ բազմաբջիջ օրգանիզմում, յուրաքանչյուր բջիջ վերահսկում է, թե երբ և ինչպես են արտահայտվում իր գեները: Որպեսզի դա տեղի ունենա, պետք է լինի մեխանիզմ ՝ վերահսկելու, թե երբ է գենը արտահայտվում ՌՆԹ և սպիտակուց ստեղծելու համար, սպիտակուցի ինչ քանակի է պատրաստվում, և երբ ժամանակն է դադարեցնել այդ սպիտակուցի արտադրությունը, քանի որ այն այլևս անհրաժեշտ չէ:

Գենի արտահայտման կարգավորումը խնայում է էներգիան և տարածությունը: Այն կպահանջի զգալի քանակությամբ էներգիա, որպեսզի օրգանիզմն արտահայտի յուրաքանչյուր գեն բոլոր ժամանակներում, ուստի էներգաարդյունավետ է գեները միացնել միայն այն ժամանակ, երբ դրանք պահանջվում են: Բացի այդ, յուրաքանչյուր բջիջում գեների ենթախմբի միայն արտահայտումը խնայում է տարածությունը, քանի որ ԴՆԹ -ն պետք է հանվի իր սերտորեն ոլորված կառուցվածքից `ԴՆԹ -ն տառադարձելու և թարգմանելու համար: Բջիջները պետք է հսկայական լինեին, եթե յուրաքանչյուր սպիտակուց անընդհատ արտահայտվեր յուրաքանչյուր բջիջում:

Գենի արտահայտման վերահսկումը չափազանց բարդ է: Այս գործընթացի անսարքությունները վնասակար են բջջի համար և կարող են հանգեցնել բազմաթիվ հիվանդությունների, այդ թվում՝ քաղցկեղի զարգացմանը:


«Կենտրոնական դոգմա»

Միասին ՝ ՌՆԹ, կարճ ՝ ռիբոնուկլեինաթթու և ԴՆԹԴեզօքսիռիբոնուկլեինաթթու կրճատ բառը կազմում են նուկլեինաթթուները՝ հիմնական «մակրոմոլեկուլների» երեք կամ չորս դասերից մեկը, որը համարվում է կյանքի համար կարևոր: (Մյուսներն են սպիտակուցներ և լիպիդներ: Շատ գիտնականներ նույնպես տեղադրում են ածխաջրեր այս խմբում:) Մակրոմոլեկուլները շատ մեծ մոլեկուլներ են, որոնք հաճախ բաղկացած են կրկնվող ենթամիավորներից: ՌՆԹ-ն և ԴՆԹ-ն կազմված են ենթամիավորներից, որոնք կոչվում են նուկլեոտիդներ:

Երկու նուկլեինաթթուները միավորվում են ՝ ստեղծելով սպիտակուցներ: Նուկլեինաթթուներում գենետիկական տեղեկատվության միջոցով սպիտակուցներ ստեղծելու գործընթացը այնքան կարևոր է կյանքի համար, որ կենսաբաններն այն անվանում են մոլեկուլային կենսաբանության «կենտրոնական դոգմա»: Դոգման, որը նկարագրում է գենետիկական տեղեկատվության հոսքը օրգանիզմում, ըստ Օրեգոնի պետական ​​համալսարան, ասում է, որ ԴՆԹ -ի տեղեկատվությունը դուրս է գրվում կամ «տառադարձվում», ինչպես ՌՆԹ -ի տեղեկատվությունը, և ՌՆԹ -ի տեղեկատվությունը դուրս է գրվում կամ «թարգմանվում» սպիտակուցի:

«Հիմնական ձևով ՌՆԹ -ն կենսամոլեկուլն է, որը կապում է ԴՆԹ -ն և սպիտակուցները», - Live Science- ին ասաց Չիկագոյի համալսարանի կենսաբան, ՌՆԹ փոփոխությունները ուսումնասիրող Չուան Հեն:


Բովանդակություն

Գրադարանի պատրաստում Խմբագրել

Հերթականացման համար լրացուցիչ ԴՆԹ (cDNA) գրադարան պատրաստելու ընդհանուր քայլերը նկարագրված են ստորև, բայց հաճախ տարբեր հարթակներում: [8] [3] [9]

  1. ՌՆԹ-ի մեկուսացում.ՌՆԹ-ն մեկուսացված է հյուսվածքից և խառնվում է դեզօքսիռիբոնուկլեազի (DNase) հետ։ ԴՆազը նվազեցնում է գենոմային ԴՆԹ-ի քանակը: ՌՆԹ-ի քայքայման քանակը ստուգվում է գելային և մազանոթային էլեկտրոֆորեզով և օգտագործվում է նմուշին ՌՆԹ ամբողջականության համար նշանակելու համար: Այս ՌՆԹ -ի որակը և սկսնակ ՌՆԹ -ի ընդհանուր քանակը հաշվի են առնվում հետագա գրադարանային նախապատրաստման, հաջորդականության և վերլուծության քայլերի ընթացքում:
  1. ՌՆԹ -ի ընտրություն/սպառում. Հետաքրքրող ազդանշանները վերլուծելու համար մեկուսացված ՌՆԹ -ն կարող է կամ պահպանվել այնպես, ինչպես կա, զտված ՌՆԹ -ի համար `3 'պոլիադենիլացված (պոլի (Ա)) պոչերով, որը ներառում է միայն mRNA, ռիբոսոմային ՌՆԹ -ից սպառված (rRNA) և/կամ զտել ՌՆԹ -ի համար, որը կապում է որոշակի հաջորդականություններ (ՌՆԹ-ի ընտրության և սպառման մեթոդներ աղյուսակ, ստորև): 3' պոլի(A) պոչերով ՌՆԹ-ն հիմնականում կազմված է հասուն, մշակված, կոդավորող հաջորդականություններից: Պոլի (Ա) ընտրությունը կատարվում է ՌՆԹ -ի խառնուրդով պոլի (Տ) օլիգոմերների հետ, որոնք կովալենտորեն կցված են ենթաշերտին, սովորաբար մագնիսական ուլունքներին: [10][11] Poly(A) ընտրությունը կարևոր սահմանափակումներ ունի ՌՆԹ-ի բիոտիպերի հայտնաբերման գործում: ՌՆԹ-ի շատ բիոտիպեր պոլիադենիլացված չեն, ներառյալ շատ չկոդավորող ՌՆԹ և հիստոն-միջուկ սպիտակուցի տառադարձումներ, կամ կարգավորվում են իրենց պոլի(A) պոչի երկարությամբ (օրինակ՝ ցիտոկիններ) և, հետևաբար, կարող են չհայտնաբերվել պոլի(A) ընտրությունից հետո: [12] Ավելին, poly(A) ընտրությունը կարող է մեծացնել 3' կողմնակալությունը, հատկապես ցածր որակի ՌՆԹ-ի դեպքում: [13] [14] Այս սահմանափակումներից կարելի է խուսափել ռիբոսոմային սպառումով ՝ հեռացնելով rRNA- ն, որը սովորաբար բջջում ներկայացնում է ՌՆԹ -ի ավելի քան 90% -ը: Պոլի (Ա) հարստացման և ռիբոսոմային սպառման քայլերը աշխատատար են և կարող են կողմնակալություն մտցնել, ուստի ավելի պարզ մոտեցումներ են մշակվել `այդ քայլերը բաց թողնելու համար: [15] Փոքր ՌՆԹ թիրախները, ինչպիսիք են miRNA-ն, կարող են հետագայում մեկուսացվել չափի ընտրության միջոցով՝ բացառող գելերով, մագնիսական ուլունքներով կամ առևտրային փաթեթներով։
  1. cDNA սինթեզ. ՌՆԹ -ն հակադարձվում է cDNA- ին, քանի որ ԴՆԹ -ն ավելի կայուն է և թույլ է տալիս ուժեղացնել (որն օգտագործում է ԴՆԹ -ի պոլիմերազները) և օգտագործել ավելի հասուն ԴՆԹ -ի հաջորդականացման տեխնոլոգիան: Հակադարձ տրանսկրիպցիայի հաջորդող ուժեղացումն առաջացնում է խճճվածության կորուստ, որից կարելի է խուսափել քիմիական մակնշմամբ կամ մեկ մոլեկուլի հաջորդականությամբ: Ֆրագմենտացիան և չափի ընտրությունը կատարվում են հաջորդականությունները մաքրելու համար, որոնք հաջորդականության մեքենայի համար համապատասխան երկարություն են: ՌՆԹ-ն, cDNA-ն կամ երկուսն էլ մասնատված են ֆերմենտներով, ձայնագրմամբ կամ նեբուլիզատորներով: ՌՆԹ-ի մասնատումը նվազեցնում է պատահականորեն պրիմիդ-հակադարձ տրանսկրիպցիայի 5' կողմնակալությունը և այբբենարանների կապակցման վայրերի ազդեցությունը, [11] մինուսով, որ 5' և 3' ծայրերը ավելի քիչ արդյունավետ են փոխակերպվում ԴՆԹ-ի: Մասնատմանը հաջորդում է չափի ընտրությունը, որտեղ կա՛մ փոքր հաջորդականությունները հանվում են, կա՛մ ընտրվում են հաջորդականության երկարությունների սահմանափակ շրջանակ: Քանի որ miRNA- ների նման փոքր ՌՆԹ -ները կորչում են, դրանք վերլուծվում են անկախ: Յուրաքանչյուր փորձի cDNA-ն կարող է ինդեքսավորվել վեցամերային կամ օկտամերային շտրիխ կոդով, այնպես որ այդ փորձերը կարող են միավորվել մեկ գոտու մեջ՝ մուլտիպլեքսային հաջորդականության համար:

Լրացուցիչ ԴՆԹ հաջորդականացում (cDNA-Seq) Խմբագրել

ՌՆԹ կենսատիպերից ստացված cDNA գրադարանը հաջորդաբար հաջորդականացվում է համակարգչով ընթերցվող ձևաչափի: Կան բազմաթիվ բարձր թողունակության հաջորդականացման տեխնոլոգիաներ cDNA հաջորդականացման համար, ներառյալ Illumina, Thermo Fisher, BGI/MGI, PacBio և Oxford Nanopore Technologies- ի կողմից մշակված հարթակները: [16] Illumina-ի կարճ ընթերցման հաջորդականության համար, cDNA-ի հաջորդականացման ընդհանուր տեխնոլոգիա, ադապտերները միացվում են cDNA-ին, ԴՆԹ-ն կցվում է հոսքի բջիջին, կլաստերները ստեղծվում են կամրջի ուժեղացման և դենատուրացիայի ցիկլերի միջոցով, և հաջորդականությամբ սինթեզը կատարվում է: կատարվում է շրջելի տերմինատորներով հիմքերի կոմպլեմենտար շղթայի սինթեզի և լազերային գրգռման ցիկլերում: Հարթակման հարթակի ընտրությունը և պարամետրերը առաջնորդվում են փորձնական դիզայնով և արժեքով: Փորձնական նախագծման ընդհանուր նկատառումները ներառում են հաջորդականության երկարության, հաջորդականության խորության, մեկից զույգ հաջորդականությունների հաջորդականության օգտագործման, կրկնությունների քանակի, մուլտիպլեքսավորման, պատահականացման և ներարկումների որոշում: [17]

Փոքր RNA/ոչ կոդավորող RNA հաջորդականացում Խմբագրել

ՌՆԹ -ից բացի mRNA- ից հաջորդականացման ժամանակ գրադարանի պատրաստումը փոփոխվում է: Բջջային ՌՆԹ -ն ընտրվում է ըստ ցանկալի չափի տիրույթի: ՌՆԹ -ի փոքր թիրախների դեպքում, ինչպիսին է miRNA- ն, ՌՆԹ -ն մեկուսացված է չափի ընտրության միջոցով: Սա կարող է իրականացվել չափը բացառող գելի միջոցով, չափի ընտրության մագնիսական ուլունքների միջոցով կամ կոմերցիոն մշակված հավաքածուի միջոցով: Մեկուսացնելուց հետո կապողներն ավելացվում են 3' և 5' ծայրերին, այնուհետև մաքրվում են: Վերջնական քայլը cDNA- ի ստեղծումն է հակադարձ արտագրման միջոցով:

Ուղղակի RNA հաջորդականացում Խմբագրել

Քանի որ ՌՆԹ-ի փոխակերպումը cDNA-ի, կապակցումը, ուժեղացումը և նմուշների այլ մանիպուլյացիաները ցույց են տվել, որ ներդնում են կողմնակալություններ և արտեֆակտներ, որոնք կարող են խանգարել տառադարձումների ճիշտ բնութագրմանը և քանակականացմանը, [18] մեկ մոլեկուլի ուղիղ ՌՆԹ հաջորդականությունը ուսումնասիրվել է ընկերությունների կողմից, այդ թվում՝ Helicos-ը: (սնանկ), Oxford Nanopore Technologies [19] եւ այլն։ Այս տեխնոլոգիան հաջորդականացնում է ՌՆԹ-ի մոլեկուլները ուղղակիորեն զանգվածաբար զուգահեռ ձևով:

Իրական ժամանակի միայնակ մոլեկուլային RNA հաջորդականացում Խմբագրել

Parallelանգվածային զուգահեռ մեկ մոլեկուլ ուղղակի RNA-Seq- ն ուսումնասիրվել է որպես ավանդական RNA-Seq- ի այլընտրանք, որի դեպքում RNA-cDNA- ի փոխակերպումը, կապումը, ուժեղացումը և այլ նմուշի շահարկման քայլերը կարող են ներկայացնել կողմնակալություններ և արտեֆակտներ: [20] Տեխնոլոգիական հարթակները, որոնք իրականացնում են մեկ մոլեկուլ իրական ժամանակում RNA-Seq, ներառում են Oxford Nanopore Technologies (ONT) Nanopore sequencing, [19] PacBio IsoSeq և Helicos (սնանկացած): ՌՆԹ-ի հաջորդականացումը իր բնիկ ձևով պահպանում է այնպիսի փոփոխություններ, ինչպիսին է մեթիլացումը, ինչը թույլ է տալիս դրանք ուղղակիորեն և միաժամանակ ուսումնասիրել: [19] Մեկ մոլեկուլային RNA-Seq- ի մեկ այլ առավելությունն այն է, որ սղագրությունները կարող են ընդգրկվել ամբողջ երկարությամբ, ինչը թույլ է տալիս ավելի բարձր վստահության իզոֆորմ հայտնաբերում և քանակականացում `համեմատած կարճ ընթերցման հաջորդականության հետ: Ավանդաբար, մեկ մոլեկուլային RNA-Seq մեթոդներն ունեն ավելի մեծ սխալի արագություն՝ համեմատած կարճ ընթերցման հաջորդականության հետ, բայց ավելի նոր մեթոդները, ինչպիսիք են ONT ուղղակի RNA-Seq-ը, սահմանափակում են սխալները՝ խուսափելով մասնատումից և cDNA-ի փոխակերպումից: Մարդկային բջիջների պոպուլյացիաներում դիֆերենցիալ արտահայտման համար ONT ուղղակի RNA-Seq- ի վերջին օգտագործումները ցույց տվեցին, որ այս տեխնոլոգիան կարող է հաղթահարել կարճ և երկար cDNA հաջորդականության հաջորդականության բազմաթիվ սահմանափակումներ: [21]

Մեկ բջջային ՌՆԹ հաջորդականացում (scRNA-Seq) Խմբագրել

Ստանդարտ մեթոդները, ինչպիսիք են միկրոզանգվածը և ստանդարտ զանգվածային RNA-Seq վերլուծությունը, վերլուծում են բջիջների մեծ պոպուլյացիայից RNA- ների արտահայտությունը: Խառը բջիջների պոպուլյացիաներում այս չափումները կարող են քողարկել այս պոպուլյացիաների առանձին բջիջների միջև կրիտիկական տարբերությունները: [22] [23]

Միաբջիջ ՌՆԹ-ի հաջորդականությունը (scRNA-Seq) ապահովում է առանձին բջիջների արտահայտման պրոֆիլները: Թեև անհնար է ամբողջական տեղեկատվություն ստանալ յուրաքանչյուր բջիջի կողմից արտահայտված յուրաքանչյուր ՌՆԹ -ի վերաբերյալ, սակայն մատչելի նյութի փոքր քանակի պատճառով գենային արտահայտման ձևերը կարող են նույնականացվել գենային խմբավորման վերլուծությունների միջոցով: Սա կարող է բացահայտել հազվագյուտ բջիջների տիպերի գոյությունը բջիջների պոպուլյացիայի մեջ, որոնք նախկինում երբեք չեն տեսել: Օրինակ ՝ թոքերի հազվագյուտ մասնագիտացված բջիջները, որոնք կոչվում են թոքային իոնոցիտներ, որոնք արտահայտում են ցիստիկական ֆիբրոզի անդրծաղկային հաղորդունակության կարգավորիչը, հայտնաբերվել են 2018 թվականին երկու խմբի կողմից, որոնք կատարում են scRNA-Seq թոքերի շնչուղիների էպիթելիա: [24] [25]

Փորձնական ընթացակարգեր Խմբագրել

Ներկայիս scRNA-Seq արձանագրությունները ներառում են հետևյալ քայլերը. Մեկ բջջի և RNA- ի մեկուսացում, հակադարձ արտագրում (RT), ուժեղացում, գրադարանների ստեղծում և հաջորդականացում: Միայնակ բջիջները կամ մեխանիկորեն բաժանվում են միկրոէլեկտրակայանների (օրինակ ՝ BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform կամ CellMicrosystems CellRaft) կամ պատված են կաթիլներով (օր. ՝ 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio Nado, Dolomite Bio [26] Միայնակ բջիջները պիտակավորված են՝ ավելացնելով ուլունքներ շտրիխ կոդավորված օլիգոնուկլեոտիդներով, և՛ բջիջները, և՛ ուլունքները մատակարարվում են սահմանափակ քանակությամբ, այնպես որ մի քանի բջիջների և ուլունքների համակցումը շատ հազվադեպ դեպք է: Հակադարձ տառադարձումն ավարտվելուց հետո բազմաթիվ բջիջների cDNA- ները կարող են իրար խառնվել `որոշակի բջիջից սղագրությունների հաջորդականացման համար, որոնք նույնականացվում են յուրաքանչյուր բջիջի յուրահատուկ շտրիխով: [27] [28] Եզակի մոլեկուլային նույնացուցիչ (UMI) կարող են կցվել mRNA/cDNA թիրախային հաջորդականություններին, որոնք կօգնեն հայտնաբերել արտեֆակտերը գրադարանի պատրաստման ընթացքում: [29]

scRNA-Seq-ի մարտահրավերները ներառում են բջիջում mRNA-ի սկզբնական հարաբերական առատության պահպանումը և հազվագյուտ տառադարձումների նույնականացումը: [30] Հակադարձ արտագրման քայլը կարևոր է, քանի որ RT ռեակցիայի արդյունավետությունը որոշում է, թե բջջի ՌՆԹ-ի պոպուլյացիայի որքան մասն ի վերջո կվերլուծվի հաջորդականացնողի կողմից: Հակադարձ տրանսկրիպտազների պրոցեսիվությունը և օգտագործվող պրիմինգային ռազմավարությունները կարող են ազդել ամբողջ երկարությամբ cDNA-ի արտադրության և գրադարանների առաջացման վրա, որոնք կողմնակալ են գեների 3' կամ 5' ծայրերին:

Ամպլիֆիկացման փուլում ներկայումս օգտագործվում է կամ PCR կամ in vitro տրանսկրիպցիան (IVT) cDNA-ի ուժեղացման համար: PCR- ի վրա հիմնված մեթոդների առավելություններից է ամբողջական երկարությամբ cDNA ստեղծելու ունակությունը: Այնուամենայնիվ, PCR-ի տարբեր արդյունավետությունը որոշակի հաջորդականությունների վրա (օրինակ, GC պարունակությունը և snapback կառուցվածքը) կարող են նաև էքսպոնենցիալ ուժեղացվել՝ ստեղծելով անհավասար ծածկույթով գրադարաններ: Մյուս կողմից, թեև IVT-ով ստեղծված գրադարանները կարող են խուսափել PCR-ի հետևանքով առաջացած հաջորդականության կողմնակալությունից, հատուկ հաջորդականությունները կարող են անարդյունավետ տառադարձվել՝ այդպիսով առաջացնելով հաջորդականության հեռացում կամ առաջացնելով թերի հաջորդականություններ: [31] [22] Հրապարակվել են scRNA-Seq մի քանի արձանագրություններ՝ Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz -seq [37] և C1-CAGE: [38] Այս արձանագրությունները տարբերվում են հակադարձ արտագրման, cDNA սինթեզի և ուժեղացման ռազմավարությունների և հաջորդականությամբ հատուկ շտրիխ կոդերի (այսինքն ՝ UMI- ների) կամ խմբավորված նմուշների մշակման հնարավորության առումով: [39]

2017-ին ներդրվեց երկու մոտեցում ՝ միաբջիջ mRNA և սպիտակուցի արտահայտությունը միաժամանակ չափելու օլիգոնուկլեոտիդներով պիտակավորված հակամարմինների միջոցով, որոնք հայտնի են որպես REAP-seq, [40] և CITE-seq: [41]

Applicրագրեր Խմբագրել

scRNA-Seq- ը լայնորեն կիրառվում է կենսաբանական բնագավառներում, ներառյալ ՝ Developmentարգացում, նյարդաբանություն, [42] ուռուցքաբանություն, [43] [44] [45] աուտոիմուն հիվանդություն, [46] և վարակիչ հիվանդություն: [47]

scRNA-Seq-ը զգալի պատկերացում է տվել սաղմերի և օրգանիզմների, այդ թվում՝ ճիճու զարգացման վերաբերյալ Caenorhabditis elegans, [48] եւ վերականգնող պլանարիան Schmidtea mediterranea. [49] [50] Առաջին ողնաշարավոր կենդանիները, որոնք քարտեզագրվել են այս կերպ, Zebrafish [51] [52] և. Xenopus laevis. [53] Յուրաքանչյուր դեպքում ուսումնասիրվել է սաղմի մի քանի փուլ, ինչը թույլ է տվել զարգացման ամբողջ գործընթացը քարտեզագրել բջիջ առ բջիջ: [8] Գիտությունը ճանաչեց այս առաջընթացը որպես 2018 թվականի տարվա առաջընթաց։ [54]

Փորձարարական նկատառումներ Խմբագրել

RNA-Seq փորձերը նախագծելիս և անցկացնելիս հաշվի են առնվում մի շարք պարամետրեր.

  • Հյուսվածքների առանձնահատկություն. Գենի արտահայտումը տատանվում է հյուսվածքների ներսում և դրանց միջև, և RNA-Seq- ը չափում է բջիջների տեսակների այս խառնուրդը: Սա կարող է դժվարացնել հետաքրքրության կենսաբանական մեխանիզմի մեկուսացումը: Մեկ բջիջի հաջորդականությունը կարող է օգտագործվել յուրաքանչյուր բջիջ առանձին ուսումնասիրելու համար ՝ մեղմելով այս հարցը:
  • Timeամանակի կախվածություն. Գենի արտահայտությունը ժամանակի ընթացքում փոխվում է, և RNA-Seq- ը միայն լուսանկարում է: Timeամանակային դասընթացների փորձեր կարող են կատարվել ՝ տառադարձության փոփոխությունները դիտելու համար:
  • Ծածկույթ (նաև հայտնի է որպես խորություն). ՌՆԹ-ն պարունակում է ԴՆԹ-ում նկատված նույն մուտացիաները, և հայտնաբերումը պահանջում է ավելի խորը ծածկույթ: Բավականաչափ բարձր ծածկույթի դեպքում RNA-Seq-ը կարող է օգտագործվել յուրաքանչյուր ալելի արտահայտությունը գնահատելու համար: Սա կարող է պատկերացում կազմել այնպիսի երևույթների վերաբերյալ, ինչպիսիք են տպագրությունը կամ ԱՊՀ կարգավորող ազդեցությունները: Հատուկ կիրառությունների համար պահանջվող հաջորդականության խորությունը կարող է էքստրապոլացվել փորձնական փորձից: [55]
  • Տվյալների ստեղծման արտեֆակտ (հայտնի է նաև որպես տեխնիկական շեղում). Ռեակտիվները (օրինակ ՝ գրադարանի պատրաստման հավաքածու), ներգրավված անձնակազմը և հաջորդականացնողի տեսակը (օրինակ ՝ Illumina, Pacific Biosciences) կարող են հանգեցնել տեխնիկական արտեֆակտների, որոնք կարող են սխալ մեկնաբանվել որպես իմաստալից արդյունքներ: Ինչպես ցանկացած գիտափորձի դեպքում, խելամիտ է RNA-Seq- ն անցկացնել լավ վերահսկվող պայմաններում: Եթե ​​դա հնարավոր չէ կամ ուսումնասիրությունը մետավերլուծություն է, ապա մեկ այլ լուծում է տեխնիկական արտեֆակտների հայտնաբերումը թաքնված փոփոխականների (սովորաբար հիմնական բաղադրիչի վերլուծություն կամ գործոնային վերլուծություն) եզրակացության միջոցով և հետագայում ուղղելով այդ փոփոխականները: [56]
  • Տվյալների կառավարում. Մարդկանց վրա RNA-Seq- ի մեկ փորձը սովորաբար 1-5 Գբ է (սեղմված) կամ ավելի, երբ միջանկյալ ֆայլերը ներառված են: [57] Տվյալների այս մեծ ծավալը կարող է խնդիրներ առաջացնել պահեստավորման մեջ: Լուծումներից մեկը տվյալների սեղմումն է ՝ օգտագործելով բազմաֆունկցիոնալ հաշվարկային սխեմաներ (օրինակ ՝ gzip) կամ գենոմիկային հատուկ սխեմաներ: Վերջինս կարող է հիմնված լինել հղումների հաջորդականության կամ de novo- ի վրա: Մեկ այլ լուծում է միկրոզանգվածի փորձարկումները, որոնք կարող են բավարար լինել վարկածների վրա հիմնված աշխատանքի կամ վերարտադրության ուսումնասիրությունների համար (ի տարբերություն հետազոտական ​​հետազոտությունների):

Transcriptome ժողովը Խմբագրել

Գենոմիական հատկանիշներին չմշակված հաջորդականության ընթերցումներ նշանակելու համար օգտագործվում է երկու մեթոդ (այսինքն՝ տրանսկրիպտոմը հավաքելու համար).

  • De novo: Այս մոտեցումը չի պահանջում հղումային գենոմ `տրանսկրիպոտոմը վերակառուցելու համար և սովորաբար օգտագործվում է, եթե գենոմը անհայտ է, թերի կամ էապես փոփոխված է հղման համեմատ: [58] Դե novo հավաքման համար կարճ ընթերցումներ օգտագործելու մարտահրավերները ներառում են 1) որոշելը, թե որ ընթերցումները պետք է միացված լինեն իրար հաջորդող հաջորդականությունների (կոնտիգների), 2) սխալների և այլ արտեֆակտների հաջորդականությունների ամրության և 3) հաշվողական արդյունավետության: De novo հավաքման համար օգտագործվող առաջնային ալգորիթմը անցում կատարեց համընկնման գրաֆիկներից, որոնք բացահայտում են բոլոր զույգ-իմաստուն համընկնումները ընթերցումների միջև, դեպի de Bruijn գրաֆիկները, որոնք ընթերցումները բաժանում են k երկարության հաջորդականությունների և բոլոր k-մերները փլուզում են հեշ աղյուսակի մեջ: [59] Համընկնման գծապատկերները օգտագործվել են Sanger-ի հաջորդականությամբ, սակայն դրանք լավ չեն չափվում RNA-Seq-ով գեներացված միլիոնավոր ընթերցումների վրա։ Դը Բրույնի գրաֆիկները օգտագործող հավաքողների օրինակներն են՝ Trinity, [58] Oases [60] (վերցված է գենոմի հավաքող Velvet[61] ), Bridger [62] և rnaSPAdes։ [63] Նույն նմուշի զույգ և երկար ընթերցված հաջորդականությունը կարող է մեղմել կարճ ընթերցման հաջորդականության դեֆիցիտը ՝ ծառայելով որպես ձևանմուշ կամ կմախք: De novo հավաքման որակը գնահատելու չափանիշները ներառում են միջին օղակի երկարությունը, կոնտիգների քանակը և N50: [64]
  • Գենոմը առաջնորդվում է. Այս մոտեցումը հիմնված է նույն մեթոդների վրա, որոնք օգտագործվում են ԴՆԹ-ի հավասարեցման համար՝ ընթերցումների հավասարեցման լրացուցիչ բարդությամբ, որոնք ընդգրկում են հղումային գենոմի ոչ շարունակական հատվածները: [65] Այս ոչ շարունակական ընթերցումները արդյունք են զուգակցված տեքստերի հաջորդականության (տես նկարը): Սովորաբար, հավասարեցման ալգորիթմներն ունեն երկու քայլ՝ 1) հավասարեցնել ընթերցվածի կարճ հատվածները (այսինքն՝ սերմացնել գենոմը), և 2) օգտագործել դինամիկ ծրագրավորում՝ գտնելու օպտիմալ հավասարեցում, երբեմն՝ հայտնի անոտացիաների հետ համատեղ: Softwareրագրային գործիքները, որոնք օգտագործում են գենոմի ուղղորդում, ներառում են Bowtie, [66] TopHat (որը հիմնված է BowTie- ի արդյունքների վրա ՝ զուգավորման հանգույցները հավասարեցնելու համար), [67] [68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] և GMAP: . [71] Գենոմի ուղղորդման հավասարեցման (քարտեզագրման) գործիքների արդյունքը կարող է հետագայում օգտագործվել այնպիսի գործիքների միջոցով, ինչպիսիք են ճարմանդները [68] կամ StringTie [72] ՝ հարակից տեքստերի հաջորդականությունները վերակառուցելու համար (այսինքն., FASTA ֆայլ): Գենոմի առաջնորդվող հավաքի որակը կարելի է չափել ինչպես 1) de novo հավաքման չափիչներով (օրինակ ՝ N50), այնպես էլ 2) հայտնի տառադարձման, միացման հանգույցի, գենոմի և սպիտակուցային հաջորդականությունների համեմատությամբ ՝ ճշգրտության, հետկանչի, կամ դրանց համակցությունը (օրինակ՝ F1 միավոր): [64] Բացի այդ, սիլիցիումի մեջ գնահատումը կարող է իրականացվել մոդելավորված ընթերցումների միջոցով: [73] [74]

Նշում հավաքման որակի վերաբերյալ. Ներկայիս կոնսենսուսն այն է, որ 1) հավաքման որակը կարող է տարբեր լինել `կախված նրանից, թե որ մետրիկն է օգտագործվում, 2) մի տեսակից լավ գնահատված գործիքները պարտադիր չէ, որ լավ աշխատեն մյուս տեսակների մեջ, և 3) տարբեր մոտեցումների համատեղումը կարող է լինել ամենահուսալին: [75] [76] [77]

Գենի արտահայտման քանակականացում Խմբագրել

Արտահայտությունը քանակականացված է `ուսումնասիրելու բջջային փոփոխությունները` ի պատասխան արտաքին գրգռիչների, առողջ և հիվանդ վիճակների միջև տարբերությունների և հետազոտական ​​այլ հարցերի: Ստորագրությունների մակարդակները հաճախ օգտագործվում են որպես սպիտակուցի առատության վստահված անձ, սակայն դրանք հաճախ համարժեք չեն հետծրագրային իրադարձությունների պատճառով, ինչպիսիք են ՌՆԹ-ի միջամտությունը և անհեթեթությամբ միջնորդված քայքայումը: [78]

Արտահայտությունը քանակականացվում է՝ հաշվելով տրանսկրիպտոմների հավաքման քայլում յուրաքանչյուր տեղանքի հետ կապված ընթերցումների քանակը: Արտահայտումը կարող է քանակականացվել էկզոնների կամ գեների համար՝ օգտագործելով կոնտիգեր կամ հղումային տառադարձման ծանոթագրություններ: [8] Դիտարկված RNA-Seq-ի ընթերցումների քանակները հաստատապես հաստատվել են ավելի հին տեխնոլոգիաների, ներառյալ արտահայտման միկրոզանգվածների և qPCR-ի համեմատ: [55] [79] Հաշվարկները քանակականացնող գործիքներն են՝ HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] եւ Cuffquant։ Այս գործիքները որոշում են RNA-Seq- ի համապատասխանեցված տվյալների ընթերցման հաշվարկը, սակայն առանց հավասարեցման հաշվարկներ կարելի է ստանալ նաև Sailfish [85] և Kallisto- ի դեպքում: [86] Ընթերցված թվերն այնուհետև վերածվում են համապատասխան չափումների՝ հիպոթեզների փորձարկման, ռեգրեսիաների և այլ վերլուծությունների համար: Այս փոխակերպման պարամետրերն են.

  • Հերթականության խորություն/ծածկույթ. Թեև RNA-Seq մի քանի փորձեր կատարելիս խորությունը նախապես սահմանված է, այնուամենայնիվ, փորձերի միջև այն շատ տարբեր կլինի: [87] Հետևաբար, մեկ փորձի ընթացքում առաջացած ընթերցումների ընդհանուր թիվը սովորաբար նորմալացվում է ՝ հաշվարկը վերածելով բեկորների, կարդում կամ հաշվարկվում են մեկ միլիոն քարտեզագրված ընթերցման (FPM, RPM կամ CPM): RPM- ի և FPM- ի միջև եղած տարբերությունը պատմականորեն առաջացել է էվոլյուցիայի ընթացքում `բեկորների մեկ ավարտից մինչև զույգ ավարտված հաջորդականություն: Մեկ եզակի հաջորդականությամբ մեկ հատվածի համար կա միայն մեկ ընթերցում (այսինքն., RPM = FPM): Զույգ վերջավոր հաջորդականության դեպքում յուրաքանչյուր հատվածում կա երկու ընթերցում (այսինքն., RPM = 2 x FPM): Հերթականացման խորությունը երբեմն կոչվում է գրադարանի չափ, փորձի մեջ միջանկյալ cDNA մոլեկուլների քանակ:
  • Գենի երկարություն. Ավելի երկար գեները կունենան ավելի շատ բեկորներ/ընթերցումներ/հաշվիչներ, քան ավելի կարճ գեները, եթե տառադարձման արտահայտությունը նույնն է: Սա ճշգրտվում է՝ FPM-ը բաժանելով հատկանիշի երկարության վրա (որը կարող է լինել գեն, տառադարձում կամ էկզոն), որի արդյունքում ստացվում են մետրային բեկորներ հատկանիշի մեկ կիլոբազայի համար մեկ միլիոն քարտեզագրված ընթերցումների համար (FPKM): [88] Նմուշների մեջ հատկանիշների խմբերը դիտարկելիս FPKM-ը վերածվում է տառադարձումների մեկ միլիոնի (TPM)՝ բաժանելով յուրաքանչյուր FPKM նմուշի FPKM-ների գումարի վրա: [89] [90] [91]
  • Ընդհանուր նմուշ RNA արտադրանքը: Քանի որ յուրաքանչյուր նմուշից արդյունահանվում է նույն քանակությամբ ՌՆԹ, ավելի շատ ընդհանուր ՌՆԹ-ով նմուշները մեկ գենի համար ավելի քիչ ՌՆԹ կունենան: Այս գեները, ըստ երևույթին, արտահայտվածության նվազում ունեն, ինչը հանգեցնում է կեղծ պոզիտիվների ՝ ներքևի հոսքի վերլուծություններում: [87] Նորմալացման ռազմավարությունները, ներառյալ քվանտիլը, DESeq2, TMM և Median Ratio- ն, փորձում են հաշվի առնել այս տարբերությունը `համեմատելով նմուշների միջև ոչ տարբեր արտահայտված գեների մի շարք և համապատասխանաբար մասշտաբավորելով: [92]
  • Տարբերություն յուրաքանչյուր գենի արտահայտման համար. մոդելավորված է `հաշվի առնելու ընտրանքի սխալը (կարևոր է ցածր ընթերցման համար ունեցող գեների համար), բարձրացնելու ուժը և նվազեցնելու կեղծ պոզիտիվները: Վարիանսը կարող է գնահատվել որպես նորմալ, Պուասոնի կամ բացասական երկանդամ բաշխում [93][94][95] և հաճախ քայքայվում է տեխնիկական և կենսաբանական շեղումների:

Spike-ins՝ գենոմի ողջ էֆեկտների բացարձակ քանակականացման և հայտնաբերման համար Խմբագրել

ՌՆԹ-ի հասկ-ները ՌՆԹ-ի նմուշներ են հայտնի կոնցենտրացիաներում, որոնք կարող են օգտագործվել որպես ոսկու ստանդարտներ փորձարարական նախագծման և ներքևի անալիզների ժամանակ՝ բացարձակ քանակականացման և գենոմի ամբողջ ազդեցությունը հայտնաբերելու համար:

  • Բացարձակ քանակականացում. Գենի էքսպրեսիայի բացարձակ քանակական գնահատումը հնարավոր չէ RNA-Seq փորձերի մեծ մասում, որոնք քանակականացնում են արտահայտությունը բոլոր տառադարձումների համեմատ: Դա հնարավոր է `կատարելով RNA-Seq spike-ins- ով, RNA- ի նմուշներ` հայտնի կոնցենտրացիաներում: Հաջորդականացումից հետո, ուղղահայաց հաջորդականությունների ընթերցված հաշվարկներն օգտագործվում են յուրաքանչյուր գենի ընթերցման համարների և կենսաբանական բեկորների բացարձակ քանակությունների միջև կապը որոշելու համար [11] [96] Մեկ օրինակում այս տեխնիկան օգտագործվել է Xenopus tropicalis սաղմերը `տրանսկրիպցիայի կինետիկան որոշելու համար: [97]
  • Գենոմի ամբողջ ազդեցությունների հայտնաբերում. Համաշխարհային կարգավորիչների փոփոխությունները, ներառյալ քրոմատինի վերափոխիչները, տրանսկրիպցիոն գործոնները (օրինակ՝ MYC), ացետիլտրանսֆերազային կոմպլեքսները և նուկլեոսոմների դիրքավորումը համահունչ չեն նորմալացման ենթադրություններին, և սրընթաց հսկողությունը կարող է ճշգրիտ մեկնաբանություն տալ: [98] [99]

Դիֆերենցիալ արտահայտություն Խմբագրել

RNA-Seq- ի ամենապարզ, բայց հաճախ ամենահզոր օգտագործումը գենի արտահայտման տարբերություններ գտնելն է երկու կամ ավելի պայմանների միջև (օրինակ, բուժված vs չբուժված) այս գործընթացը կոչվում է դիֆերենցիալ արտահայտություն: Արդյունքները հաճախ կոչվում են տարբեր կերպ արտահայտված գեներ (DEGs) և այդ գեները կարող են կամ վեր կամ վար կարգավորվել (այսինքն., ավելի բարձր կամ ցածր `հետաքրքրության պայմաններում): Կան բազմաթիվ գործիքներ, որոնք կատարում են դիֆերենցիալ արտահայտություն: Շատերն աշխատում են R, Python կամ Unix հրամանի տողում: Սովորաբար օգտագործվող գործիքները ներառում են DESeq, [94] edgeR, [95] և voom+limma, [93] [100] բոլորը հասանելի են R/Bioconductor- ի միջոցով: [101] [102] Դրանք դիֆերենցիալ արտահայտություն կատարելիս ընդհանուր նկատառումներն են.

  • Մուտքագրումներ: Արտահայտման դիֆերենցիալ մուտքերը ներառում են (1) RNA-Seq արտահայտման մատրիցա (M գեներ x N նմուշներ) և (2) նախագծային մատրիցա, որը պարունակում է փորձարարական պայմաններ N նմուշների համար: Դիզայնի ամենապարզ մատրիցը պարունակում է մեկ սյունակ, որը համապատասխանում է փորձարկվող վիճակի պիտակներին: Այլ համատարրությունները (որոնք նաև կոչվում են գործոններ, առանձնահատկություններ, պիտակներ կամ պարամետրեր) կարող են ներառել խմբաքանակի էֆեկտներ, հայտնի արտեֆակտներ և ցանկացած մետատվյալներ, որոնք կարող են շփոթել կամ միջնորդել գենի արտահայտումը: Հայտնի կովարիացիաներից բացի, անհայտ համատարրությունները կարող են գնահատվել նաև մեքենայի ուսուցման չվերահսկվող մոտեցումների միջոցով, ներառյալ հիմնական բաղադրիչը, փոխնակ փոփոխականը, [103] և PEER [56] վերլուծությունները: Թաքնված փոփոխականների վերլուծությունները հաճախ օգտագործվում են մարդկային հյուսվածքների RNA-Seq տվյալների համար, որոնք, որպես կանոն, ունեն լրացուցիչ արտեֆակտներ, որոնք չեն գրանցված մետատվյալներում (օրինակ, իշեմիկ ժամանակ, բազմաթիվ հաստատություններից ստացված աղբյուրներ, հիմքում ընկած կլինիկական գծեր, երկար տարիների տվյալների հավաքագրում բազմաթիվ անձնակազմի հետ):
  • Մեթոդներ: Գործիքների մեծ մասն օգտագործում է հետընթաց կամ ոչ պարամետրիկ վիճակագրություն ՝ տարբեր կերպ արտահայտված գեները բացահայտելու համար, կամ հիմնված են ընթերցված հաշվարկների վրա, որոնք քարտեզագրված են հղումային գենոմի վրա (DESeq2, limma, edgeR), կամ ընթերցման հաշվարկների հիման վրա, որոնք ստացվել են հավասարեցում չունեցող քանակականացումից (sleuth, [104] ] Բռունցք, [105] Ballgown [106] ): [107] Հետընթացից հետո գործիքների մեծ մասն օգտագործում է կամ ընտանեկան սխալների տոկոսադրույքը (FWER) կամ կեղծ հայտնագործության (FDR) p- արժեքի ճշգրտումները `բազմաթիվ վարկածներ հաշվի առնելու համար (մարդկային հետազոտություններում,

20.000 սպիտակուցը ծածկագրող գեն կամ

Տարբեր արտահայտված գեների ցանկի ներքևի վերլուծությունները կատարվում են երկու համով ՝ վավերացնելով դիտարկումները և կատարելով կենսաբանական եզրակացություններ: Դիֆերենցիալ արտահայտման և RNA-Seq- ի որոգայթների պատճառով կարևոր դիտարկումները կրկնվում են (1) օրթոգոնալ մեթոդով նույն նմուշներում (օրինակ ՝ իրական ժամանակի PCR) կամ (2) մեկ այլ, երբեմն նախապես գրանցված, նոր փորձի մեջ . Վերջինս օգնում է ապահովել ընդհանրացում և, որպես կանոն, կարող է հետևվել բոլոր համատեղ խմբերի մետաանալիզի միջոցով: Արդյունքների ավելի բարձր մակարդակի կենսաբանական պատկերացում ստանալու ամենատարածված մեթոդը գեների հավաքածուի հարստացման վերլուծությունն է, թեև երբեմն կիրառվում են թեկնածու գենային մոտեցումներ: Գենային հավաքածուի հարստացումը որոշում է, թե արդյոք երկու գենային հավաքածուների համընկնումը վիճակագրական առումով նշանակալի է, այս դեպքում `տարբեր ուղիներից/տվյալների շտեմարաններից տարբեր կերպ արտահայտված գեների և գենային հավաքածուների միջև համընկնումը (օրինակ, Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) կամ նույն տվյալների լրացուցիչ վերլուծություններից (ինչպես համաարտահայտման ցանցերը): Գենային հավաքածուի հարստացման ընդհանուր գործիքները ներառում են վեբ ինտերֆեյսեր (օրինակ, ENRICHR, g: profiler, WEBGESTALT) [114] և ծրագրային փաթեթներ: Հարստացման արդյունքները գնահատելիս մեկ էվրիստիկա է նախ փնտրել հայտնի կենսաբանության հարստացումը որպես ողջամտության ստուգում, ապա ընդլայնել շրջանակը՝ նոր կենսաբանություն փնտրելու համար:

Այլընտրանքային զուգավորում Խմբագրել

ՌՆԹ -ի համակցումը էուկարիոտների անբաժանելի մասն է և զգալիորեն նպաստում է սպիտակուցների կարգավորմանը և բազմազանությանը, որը հանդիպում է մարդու գեների 90% -ում: [115] Գոյություն ունեն միացման մի քանի այլընտրանքային եղանակներ՝ էկզոնների բացթողում (մարդկանց և բարձր էուկարիոտների մոտ զուգավորման ամենատարածված եղանակը), փոխադարձաբար բացառող էկզոններ, այլընտրանքային դոնոր կամ ընդունող տեղամասեր, ինտրոնի պահպանում (բույսերի, սնկերի և նախակենդանիների մոտ զուգավորման ամենատարածված եղանակը)։ տրանսկրիպցիայի մեկնարկի այլընտրանքային տեղամաս (խթանող) և այլընտրանքային պոլիադենիլացում: [115] RNA-Seq-ի նպատակներից մեկն է բացահայտել այլընտրանքային միացման իրադարձությունները և ստուգել, ​​թե արդյոք դրանք տարբերվում են պայմանների միջև: Երկար ընթերցված հաջորդականությունը գրավում է ամբողջական տառադարձումը և, հետևաբար, նվազագույնի է հասցնում իզոֆորմների առատությունը գնահատելու բազմաթիվ խնդիրներ, ինչպես օրինակ՝ երկիմաստ ընթերցման քարտեզագրումը: Կարճ ընթերցված RNA-Seq- ի համար կան այլընտրանքային միացում հայտնաբերելու բազմաթիվ մեթոդներ, որոնք կարելի է դասակարգել երեք հիմնական խմբերի. [116] [89] [117]

  • Հաշվի վրա հիմնված (նաև իրադարձությունների վրա հիմնված, դիֆերենցիալ միացում). գնահատել էկզոնի պահպանումը Օրինակներ են ՝ DEXSeq, [118] MATS, [119] և SeqGSEA: [120]
  • Isoform- ի վրա հիմնված (նաև բազմակողմանի մոդուլներ, դիֆերենցիալ isoform արտահայտություն)Սկզբում գնահատեք իզոֆորմների առատությունը, այնուհետև պայմանների միջև հարաբերական առատությունը: Օրինակներ են Cufflinks 2 [121] և DiffSplice: [122]
  • Ինտրոնի հեռացման հիման վրա. հաշվարկել այլընտրանքային միացում՝ օգտագործելով բաժանված ընթերցումներ: Օրինակներ են MAJIQ [123] և Leafcutter: [117]

Դիֆերենցիալ գենի արտահայտման գործիքները կարող են օգտագործվել նաև դիֆերենցիալ իզոֆորմ արտահայտման համար, եթե իզոֆորմները ժամանակից շուտ քանակականացված են այլ գործիքների հետ, ինչպիսիք են RSEM- ը: [124]

Համաարտահայտման ցանցեր Խմբագրել

Համաարտահայտման ցանցերը տվյալների գեներացնող պատկերներ են, որոնք նույն կերպ են վարվում հյուսվածքներում և փորձարարական պայմաններում: [125] Նրանց հիմնական նպատակը վարկածների առաջացման և մեղքի համակցման մոտեցումներն են `նախկինում անհայտ գեների գործառույթները եզրակացնելու համար: [125] RNA-Seq- ի տվյալները օգտագործվել են Pearson- ի հարաբերակցության վրա հիմնված հատուկ ուղիներում ներգրավված գեների եզրակացության համար, ինչպես բույսերի [126], այնպես էլ կաթնասունների մոտ: [127] Այս տեսակի վերլուծության մեջ RNA-Seq տվյալների հիմնական առավելությունը միկրոզանգվածային հարթակների նկատմամբ ամբողջ տրանսկրիպոտոմը ծածկելու ունակությունն է, հետևաբար հնարավորություն է տալիս բացահայտելու գեն կարգավորող ցանցերի ավելի ամբողջական ներկայացումները: Նույն գենի միաձուլման իզոֆորմների դիֆերենցիալ կարգավորումը կարող է հայտնաբերվել և օգտագործվել դրանց կենսաբանական գործառույթները կանխատեսելու համար: [128] [129] Կշռված գենի համաարտահայտման ցանցի վերլուծությունը հաջողությամբ կիրառվել է ՌՆԹ-ի հաջորդական տվյալների հիման վրա համաարտահայտման մոդուլների և ներհոդային հանգույցի գեների բացահայտման համար: Համաարտահայտման մոդուլները կարող են համապատասխանել բջիջների տեսակներին կամ ուղիներին: Բարձր կապված միջմոդուլային հանգույցները կարող են մեկնաբանվել որպես իրենց համապատասխան մոդուլի ներկայացուցիչներ: Էյգենգենը մոդուլում բոլոր գեների արտահայտման կշռված գումար է: Eigengenes- ը ախտորոշման և կանխատեսման համար օգտակար բիոմարկերներ են: [130] Առաջարկվել են փոխկապակցվածության կայունացնող փոխակերպման մոտեցումներ՝ ՌՆԹ-ի հաջորդական տվյալների վրա հիմնված հարաբերակցության գործակիցների գնահատման համար։ [126]

Տարբերակի բացահայտում Խմբագրել

RNA-Seq- ը գրավում է ԴՆԹ-ի տատանումները, ներառյալ միայնակ նուկլեոտիդային տարբերակները, փոքր ներդիրները/ջնջումները: և կառուցվածքային տատանումներ: Տարբերակի կանչը RNA-Seq-ում նման է ԴՆԹ-ի տարբերակի կանչին և հաճախ օգտագործում է նույն գործիքները (ներառյալ SAMtools mpileup [131] և GATK HaplotypeCaller [132] )՝ միաձուլումը հաշվի առնելու ճշգրտումներով: RNA- ի տարբերակների համար մեկ եզակի հարթություն է հանդիսանում ալելային հատուկ արտահայտությունը (ASE). Միայն մեկ հապլոտիպի տարբերակները կարող են գերադասելիորեն արտահայտվել կարգավորիչ ազդեցությունների պատճառով, ներառյալ `քանակական հատկանիշների տպագրումն ու արտահայտումը և հազվագյուտ տարբերակների ծածկագրումը: [133] [134] ՌՆԹ -ի տարբերակի նույնականացման սահմանափակումները ներառում են այն, որ այն արտացոլում է միայն արտահայտված շրջանները (մարդկանց մոտ և գենոմի 5% -ը), կարող է ենթարկվել տվյալների մշակման արդյունքում առաջացած կողմնակալությունների (օրինակ ՝ de novo transcriptome հավաքածուները թերագնահատում են հետերոզիգոզությունը [135] ), և ունի ավելի ցածր որակ, համեմատած ԴՆԹ -ի ուղղակի հաջորդականության հետ:

ՌՆԹ խմբագրում (հետծրագրային փոփոխություններ) Խմբագրում

Անհատի համապատասխան գենոմային և տրանսկրիպտոմային հաջորդականությունների առկայությունը կարող է օգնել հայտնաբերել հետտրանսկրիպցիոն խմբագրումները (ՌՆԹ-ի խմբագրում): [3] Հետծրագրային փոփոխությունների փոփոխման դեպքը որոշվում է, եթե գենի տեքստում առկա է գենոմային տվյալների մեջ չնկատված ալել/տարբերակ:

Միաձուլման գենի հայտնաբերում Խմբագրել

Գենոմի տարբեր կառուցվածքային փոփոխությունների հետևանքով, միաձուլման գեները ուշադրություն են գրավում քաղցկեղի հետ փոխհարաբերությունների պատճառով: [136] Նմուշի ամբողջ տրանսկրիպտոմը անկողմնակալ կերպով վերլուծելու RNA-Seq-ի կարողությունը դարձնում է այն գրավիչ գործիք քաղցկեղի նման ընդհանուր իրադարձությունները գտնելու համար: [4]

Գաղափարը բխում է կարճ սղագրության ընթերցումները հղումային գենոմին համապատասխանեցնելու գործընթացից: Կարճ ընթերցումների մեծ մասը կընկնի մեկ ամբողջական էկզոնի սահմաններում, և ակնկալվում է, որ ավելի փոքր, բայց դեռ մեծ հավաքածուն քարտեզագրված կլինի հայտնի էկզոն-էզոնային հանգույցների վրա: Մնացած չարտեզագրված կարճ ընթերցումները հետագայում կվերլուծվեն `որոշելու համար, թե արդյոք դրանք համընկնում են էքսոն-էկզոն հանգույցի հետ, որտեղ էկզոնները գալիս են տարբեր գեներից: Սա վկայում է հնարավոր միաձուլման իրադարձության մասին, սակայն ընթերցումների երկարության պատճառով սա կարող է շատ աղմկոտ լինել: Այլընտրանքային մոտեցում է օգտագործել զույգ ավարտի ընթերցումները, երբ պոտենցիալ մեծ թվով զույգ ընթերցումներ յուրաքանչյուր ծայրը պատկերում են տարբեր էքսոնի ՝ ավելի լավ լուսաբանելով այս իրադարձությունները (տես նկարը): Այնուամենայնիվ, վերջնական արդյունքը բաղկացած է գեների բազմակի և պոտենցիալ նոր համակցություններից, որոնք իդեալական ելակետ են հանդիսանում հետագա վավերացման համար:

RNA-Seq-ն առաջին անգամ ստեղծվել է 2000-ականների կեսերին հաջորդ սերնդի հաջորդականության տեխնոլոգիայի հայտնվելով: [139] Առաջին ձեռագրերը, որոնք օգտագործել են RNA-Seq նույնիսկ առանց տերմինի օգտագործման, ներառում են շագանակագեղձի քաղցկեղի բջիջների շարքերը [140] (թվագրված 2006 թ.), Medicago truncatula [141] (2006), եգիպտացորեն [142] (2007), և Arabidopsis thaliana [143] (2007), մինչդեռ «RNA-Seq» տերմինն առաջին անգամ նշվել է 2008 թվականին [144] Վերնագրում կամ վերացականում RNA-Seq- ին վերաբերող ձեռագրերի թիվը (նկար, կապույտ տող) շարունակաբար աճում է ՝ 6754 ձեռագրով: Հրատարակված է 2018 թվականին ՌՆԹ-Seq-ի և բժշկության խաչմերուկը (Նկար, ոսկե գիծ) ունի նմանատիպ ցելերություն։ [145]

Դիմումներ բժշկության մեջ Խմբագրել

RNA-Seq-ն ունի ներուժ բացահայտելու հիվանդության նոր կենսաբանությունը, կլինիկական ցուցումների պրոֆիլային բիոմարկերները, դեղորայքի ընդունման ուղիները և գենետիկ ախտորոշումները կատարելու: Այս արդյունքները կարող են լրացուցիչ անհատականացվել ենթախմբերի կամ նույնիսկ առանձին հիվանդների համար ՝ պոտենցիալ կերպով ընդգծելով ավելի արդյունավետ կանխարգելումը, ախտորոշումը և թերապիան: Այս մոտեցման իրագործելիությունը մասամբ թելադրված է փողի և ժամանակի ծախսերով: Համապատասխան սահմանափակում է պահանջվում մասնագետների թիմից (կենսաինֆորմատիկներ, բժիշկներ/բժիշկներ, հիմնական հետազոտողներ, տեխնիկներ) `այս վերլուծության արդյունքում ստացված հսկայական տվյալների լիարժեք մեկնաբանման համար: [146]

Մեծամասշտաբ հաջորդականացման ջանքեր Խմբագրել

RNA-Seq- ի տվյալների վրա մեծ շեշտ է դրվել այն բանից հետո, երբ ԴՆԹ-ի տարրերի հանրագիտարանը (ENCODE) և The Cancer Genome Atlas (TCGA) նախագծերը այս մոտեցումն օգտագործել են տասնյակ բջջային տողեր [147] և ուռուցքների առաջնային հազարավոր նմուշներ բնութագրելու համար, [148] համապատասխանաբար։ ENCODE-ը, որի նպատակն է բացահայտել գենոմի կարգավորիչ շրջանները տարբեր խմբերի բջջային գծերում, և տրանսկրիպտոմիական տվյալները առաջնային են այդ էպիգենետիկ և գենետիկ կարգավորող շերտերի ներքևի ազդեցությունը հասկանալու համար: Փոխարենը, TCGA-ն նպատակ ուներ հավաքել և վերլուծել հիվանդների հազարավոր նմուշներ 30 տարբեր տեսակի ուռուցքներից՝ հասկանալու չարորակ փոխակերպման և առաջընթացի հիմքում ընկած մեխանիզմները: Այս համատեքստում RNA-Seq- ի տվյալները տրամադրում են հիվանդության տրանսկրիպոտիկ վիճակի յուրահատուկ պատկեր և դիտում են տեքստերի անաչառ պոպուլյացիան, որը թույլ է տալիս նույնականացնել նոր տեքստերի, միաձուլված տեքստերի և ոչ կոդավորող ՌՆԹ-ների մասին, որոնք կարող են չբացահայտվել տարբեր տեխնոլոգիաներով:

Այս հոդվածը ներկայացվել է Գիտության ամսագիր Վիքի 2019 թվականին արտաքին ակադեմիական գործընկերների համար (վերանայման հաշվետվություններ): Թարմացված բովանդակությունը վերաինտեգրվել է Վիքիպեդիայի էջում CC-BY-SA-3.0 լիցենզիայի ներքո (2021 թ.): Ձայնագրության տարբերակը `վերանայված է. Ֆելիքս Ռիխտեր և այլք: (17 մայիսի 2021 թ.): «Լայն ներածություն RNA-Seq»-ի համար: WikiJournal of Science. 4 (2) ՝ 4. doi ՝ 10.15347/WJS/2021.004: ISSN 2470-6345: Wikidata Q100146647.


Հատոր I

Carsten Carlberg, վիտամին D-ում (երրորդ հրատարակություն), 2011 թ

VDR թիրախային գեների հարաբերական արտահայտությունը

Որոշ VDR թիրախային գեների մՌՆԹ-ի կայուն վիճակի արտահայտման մակարդակները, ինչպիսին է CYP24A1 գենը, լիգանդի բացակայության դեպքում շատ ցածր են, բայց առաջանում են մինչև 1000 անգամ՝ 1,25(OH) խթանմամբ:2Դ3 [36]: Այլ հայտնի առաջնային 1,25 (OH)2Դ3 թիրախային գեներ, ինչպիսիք են CCNC եւ CDKN1A, հաճախ ցույց են տալիս կրկնակի կամ պակաս ինդուկտիվություն 1,25(OH) կարճատև բուժումից հետո:2Դ3 [132,133]: Այս վերջին գեները, այնուամենայնիվ, ցուցադրում են 10 000–100 000 անգամ ավելի բարձր բազալային արտահայտման մակարդակներ ՝ համեմատած CYP24A1 գեն. Այսպիսով, երբ հաշվի են առնվում հարաբերական մակարդակները, երկուսից 20 անգամ ավելի CCNC եւ CDKN1A քան CYP24A1 mRNA մոլեկուլները արտադրվում են 1α, 25 (OH) ինդուկցիայից հետո2Դ3.


Եզրակացություններ

RNA-Seq-ի օգտագործումը բացահայտեց mRNA-ի քայքայման բարդ օրինաչափություն շատ օպերոնների համար B. cereusցույց տալով, որ ՌՆԹ -ի մշակումը իսկապես հանդիսանում է mRNA արտահայտման մակարդակները կարգավորող կարևոր կարգավորիչ մեխանիզմ: Այս ուսումնասիրությունը տալիս է սկզբունքի ապացույց, որ RNA-Seq- ը կարող է օգտագործվել mRNA քայքայման գենոմի լայնածավալ ուսումնասիրությունների համար: Մենք ակնկալում ենք, որ մոտ ապագայում այս մեթոդը հետագայում կկիրառվի քայքայման ուսումնասիրությունների մեջ, հնարավոր է `5 'և 3' վերջի պիտակավորման կամ քրոմատինի իմունային տեղումների հաջորդականացման (ChIP-Seq) փորձերի հետ համատեղ, որոնք կնպաստեն RNase- ի մշակման տեղամասերի հայտնաբերմանը կամ դրանց համակցմանը: մի շարք միկրոօրգանիզմներում տարբեր RNases- ի մանրամասն ֆունկցիոնալ ասպեկտները ուսումնասիրելու համար:


RNAi ուղու պարզեցված մոդել

RNAi ուղու պարզեցված մոդելը հիմնված է երկու քայլի վրա, որոնցից յուրաքանչյուրը ներառում է ribonuclease ֆերմենտը: Առաջին քայլում տրիգեր ՌՆԹ-ն (կամ dsRNA կամ miRNA առաջնային տառադարձում) վերամշակվում է կարճ, միջամտող ՌՆԹ-ի (siRNA) RNase II ֆերմենտների Dicer և Drosha-ի միջոցով: Երկրորդ քայլում, siRNA- ները բեռնվում են էֆեկտորային համալիրի ՝ ՌՆԹ-ով առաջացած լռեցման համալիրի մեջ (RISC): SiRNA- ն չեղյալ է հայտարարվում RISC հավաքման ժամանակ, և միաշղթա RNA- ն հիբրիդացվում է mRNA թիրախով: Գեների լռեցումը թիրախավորված mRNA- ի նուկլեոլիտիկ դեգրադացիայի արդյունք է RNase H ֆերմենտի Argonaute (Slicer) կողմից: Եթե ​​siRNA/mRNA դուպլեքսը պարունակում է անհամապատասխանություններ, mRNA-ն չի կտրվում: Ավելի շուտ, գենի լռեցումը թարգմանական արգելակման արդյունք է:


Մուտքի ընտրանքներ

Ստացեք ամսագրի ամբողջական մուտք 1 տարվա համար

Բոլոր գները NET գներ են:
ԱԱՀ -ն ավելի ուշ կավելանա դրամարկղում:
Հարկերի հաշվարկը վերջնականապես կավարտվի դուրսգրման ժամանակ:

Ստացեք ժամանակով սահմանափակ կամ հոդվածների ամբողջական մուտք ReadCube- ում:

Բոլոր գները NET գներ են:


Մոլեկուլային կենսաբանության քննական հարցեր | Կենսաբանություն

Պատասխան ՝ Այս վարկածը բացատրում է կոդոնի երրորդ հիմքում դեգեներացիայի դիտարկված օրինաչափությունը: Այս վարկածի համաձայն երրորդ հիմքը կարող է ենթարկվել հակակոդոնի համապատասխան առաջին բազայի հետ: Գենետիկական ծածկագրի տատանումների և այլասերման կարևորությունն այն է, որ բջիջը չպետք է սինթեզի տարբեր tRNA 61 զգայարան կոդոններից յուրաքանչյուրի համար: Պարզ օրինակն այն է, որ չորս տարբեր գլիցինի կոդոններ ճանաչելու համար անհրաժեշտ է ընդամենը երկու տարբեր tRNA հակակոդոն:

Հ.2. Ի՞նչ է Shine-Dalgarno հաջորդականությունը: Միկրոօրգանիզմների ո՞ր խմբերում է այն հանդիպում:

Պատասխան ՝ Շայն-Դալգարնո հաջորդականությունը գտնվում է mRNA-ի սկզբնական հաջորդականությունից առաջ: Այս նուկլեոտիդային հաջորդականությունը թույլ է տալիս mRNA-ին համապատասխանեցնել բակտերիալ բջջի 30S ռիբոսոմային ենթամիավորին: Այն մոտ 7 հիմք է հոսանքին հակառակ սկզբին) դեպի mRNA- ի AUG սկավառակի 5 ‘-P վերջը և հանդիսանում է AGGAGG պոլիպուրինյան կոնսենսուսային հաջորդականություն և կոչվում է Փայլ-Դալգարնո հաջորդականություն (նկ. 33.7): Այն հայտնաբերվում է բակտերիալ եւ հնագիտական ​​բջիջներում:

Հ.3. Ի՞նչ են նշանակում UGA, UAA և UAG կոդոնները նորմալ թարգմանության մեջ:

Պատասխան ՝ Սովորական թարգմանության մեջ դրանք նշանակում են “Stop ” կոդոնների համար:

Հ .4. Ինչու՞ է գենետիկական ծածկագիրն այլասերվում:

Պատասխան ՝ Դա պայմանավորված է նրանով, որ մեկից ավելի կոդոններ կարող են ծածկագրել նույն ամինաթթուն:

Q.5. Քանի՞ վերջնակետ կամ անհեթեթ կոդոն կա:

Պատասխան ՝ Կան նաև միայն երեք վերջնակետային կոդոններ, որոնք կոչվում են “անիմաստ կոդոններ”, քանի որ դրանք չեն կոդավորում որևէ ամինաթթվի համար:

Հ.6. Սովորաբար AGG ծածկագիրը ծածկագրում է արգինը, բայց փոփոխված թարգմանության դեպքում այն ​​ծածկագրում է կանգառը: Որտեղ է դա տեղի ունենում:

Պատասխան ՝ Այն հանդիպում է մարդու միտոքոնդրիայում:

Հ.7. Ի՞նչ տարօրինակ է միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ում (երկշղթայական շրջանաձև ԴՆԹ-ի գենոմ) կատարված ուսումնասիրություններում, երբ մեկը ցածրից բարձր էուկարիոտներից ելնում է:

Պատասխան ՝ Մինչդեռ մեկը ցածրից բարձր էուկարիոտներից է անցնում, միտոքոնդրիալ գենոմում տարօրինակն այն է, որ այն փոքրանում է, օրինակ ՝ խմորիչի միտոքոնդրիալ ԴՆԹ -ն հինգ անգամ ավելի մեծ է, քան մարդկային միտոքոնդրիան:

Հ.8. Ի՞նչն է հնարավորություն տվել տվյալ tRNA- ին, որ երբեմն այն հատուկ ճանաչում է մի քանի կոդոններ:

Պատասխան ՝ Անտիկոդոնի 5 և#8242 ծայրերում գտնվող բազային զույգի տատանումները հնարավորություն են տալիս տվյալ tRNA- ին ճանաչել մի քանի կոդոններ:

Ք.9. Բոլոր նոր սինթեզված բակտերիալ սպիտակուցները սկսում են (սկսում) ֆորմիլմետիոնինով (կարող է կրճատվել որպես fmet): Ինչպե՞ս է բակտերիաներում ֆորմիլային խումբը հանվում fmet պոլիպեպտիդից:

Պատասխան ՝ Ֆորմիլ խումբը հաճախ հեռացվում է ֆորմիլ-մետիոնինից դեֆորմիլազի ֆերմենտի միջոցով ՝ թողնելով մեթիոնինը ՝ որպես պոլիպեպտիդային շղթայի առաջին ամինաթթու:

Ք .10. Ի՞նչ են գեները: Սահմանել.

Պատասխան ՝ Գենը կարող է սահմանվել որպես նուկլեոտիդների հաջորդականություն, որը սահմանում է որոշակի պոլիպեպտիդ շղթա կամ ՌՆԹ հաջորդականություն կամ որը կարգավորում է այլ գեների արտահայտումը: Այն գեները, որոնք ծածկագրում են սպիտակուցները, կոչվում են կառուցվածքային գեներ կամ ցիստրոններ, մինչդեռ կարգավորող գործառույթ կրող մյուս գեները կոչվում են կարգավորող գեներ: Կարգավորող գեները աշխատում են վերահսկել կառուցվածքային գեների արտահայտումը: Կառուցվածքային և կարգավորող գեները միասին կազմում են ֆենոտիպը որոշող գենոտիպը, այսինքն ՝ դիտարկելի կառուցվածքային և ֆունկցիոնալ բնութագրերը:

Պատասխան ՝ ԴՆԹ հաջորդականություն, որը ծածկագրում է համապատասխան գործառույթի մեկ կամ մի քանի կառուցվածքային գեների (պոլիպեպտիդներ) և արտահայտությունը կարգավորող ԴՆԹ հաջորդականությունը:

Հ.12. Ի՞նչն է վերահսկում ինդուկցիան և ռեպրեսիան:

Պատասխան ՝ Կարգավորող գեները, որոնք արտադրում են կարգավորիչ սպիտակուց, վերահսկում են ինդուկցիան (այսինքն՝ առաջացնելով ֆերմենտի սինթեզի արագության բարձրացում) և ռեպրեսիա (այսինքն՝ գեների արտահայտման արգելափակում):

Հ.13. Ի՞նչ է լաք օպերոնը:

Պատասխան ՝ Լաք օպերոնը նշանակում է լակտոզային օպերոն, օպերոն, որը պարունակում է գեներ, որոնք սահմանում են սպիտակուցներ (3 -գալակտոզիդներ, օրինակ ՝ լակտոզա): ունի կառուցվածք.

Ք .14. Ի՞նչ է կատաբոլիտային ճնշումը:

Պատասխան ՝ Կատաբոլիտային ճնշումը դա որոշակի ինդուկտիվ ֆերմենտային համակարգերի կոդավորող գեների տառադարձման ճնշումն է գլյուկոզայի կամ ածխածնի այլ պատրաստակամ օգտագործման համար:

Հ .15. Որո՞նք են դրական կարգավորիչները (ակտիվացնողները) և բացասական կարգավորիչները (ճնշողները): Նկարագրեք:

Պատասխան ՝ Բակտերիաներն ունեն բազմաթիվ ֆերմենտներ, որոնց սինթեզի արագությունը կախված է սննդի արտաքին մոլեկուլների առկայությունից: Այս արտաքին մոլեկուլները, որոնք կոչվում են ինդուկտորներ և համընկնողներ, սովորաբար որոշում են ֆերմենտների սինթեզի արագությունը ՝ վերահսկելով նրանց mRNA կաղապարների սինթեզը: Ինդուկտորները և համընկնողները գործում են ՝ կապվելով կարգավորիչ սպիտակուցների հետ, որոնք կոչվում են ակտիվացնող և ճնշող:

Ակտիվատորները դրական կարգավորիչներ են, քանի որ դրանց առկայությունը պահանջվում է կարգավորվող ֆերմենտի պատրաստման համար, մինչդեռ ռեպրեսորները գործում են որպես բացասական կարգավորիչներ, քանի որ նրանց կարգավորիչ գործունեությունը կանխարգելում է սպիտակուցների սինթեզը: Այսպիսով, երբ լակտոզան բացակայում է, լակ օպերոնը (լակտոզային օպերոն) ռեպրեսորը կանխում է լակտոզայի նյութափոխանակության ֆերմենտների սինթեզը: Այնուամենայնիվ, ինդուկտորը (լակտոզայի հետ կապված մոլեկուլը) կապելիս ճնշողը կորցնում է այս ունակությունը և թույլ է տալիս արտադրել ֆերմենտներ: Արաբինոզային օպերոն C սպիտակուցը, որն ակտիվացնող է, առաջացնում է արաբինոզային ֆերմենտների ստեղծում ինդուկտոր արաբինոզին միանալու դեպքում:

Հ.16. Ի՞նչ է ԴՆԹ-ի պալինդրոմային հաջորդականությունը:

Պատասխան ՝ Բառացիորեն ասած palindrome- ը մի բառ է, որը կարդում է նույնը հետընթաց և առաջ: Պալինդրոմիկ հաջորդականությունը նուկլեինաթթվի շրջան է, որը պարունակում է զույգ շրջված կրկնվող հաջորդականություններ: ԴՆԹ-ի երկշղթայական մոլեկուլում նման շրջանը ցույց է տալիս երկակի պտտվող (դիադ) համաչափություն կամ հիպեմացված դիադայի համաչափություն, եթե երկու IR հաջորդականությունները բաժանված են մեկ այլ հաջորդականությամբ: Երկշղթայական պալինդրոմիկ հաջորդականությունը կարող է ընդունել երկու հնարավոր կազմավորումներից որևէ մեկը.

1. Գծային կառուցվածք՝ միջշղթայական ջրածնային կապով, օրինակ.

2. Խաչաձեւ կառուցվածք, որի մեջ երկու թելերից յուրաքանչյուրը մազակալներ է ստեղծում ներհոսքային ջրածնի կապով:

Հ.17. Ո՞վ հայտնաբերեց, որ ռենտգենյան ճառագայթները առաջացնում են մուտացիաներ:

Պատասխան ՝ Հերման Մյուլլերը և Լ.

Պատասխան ՝ Istիստրոնը գեն է, ինչպես սահմանված է ԱՊՀ-ՏՐԱՆՍ ԹԵՍՏ-ի տեսանկյունից, այսինքն ՝ դիպլոիդ բջիջում կամ մերոզիգոտում գենետիկ նուկլեինաթթվի երկու համասեռ հաջորդականություններից որևէ մեկում, երբ տրանսում երկու մուտացիաներ չեն կարողանում ամբողջական լրացում ցուցաբերել: Cիստրոնը կարող է սահմանվել նաև որպես գենետիկ ժառանգականության ֆունկցիոնալ միավոր գենետիկական նուկլեինաթթվի մի հատված, որը ծածկագրում է պոլիպեպտիդների որոշակի շղթա: Istիստրոն տերմինը օգտագործվել է նաև որպես գենի հոմանիշ:

Պատասխան ՝ Recon տերմինը ստեղծվել է Ս. Բենզերի կողմից։ Նրա խոսքով, դա գենետիկական ստորաբաժանման միավոր է, որից այն կողմ ռեկոմբինացիան չի առաջանում:

Ք .20. Սահմանեք մուտատոր կամ մուտատոր գեն:

Պատասխան ՝ Մուտատոր գենը կամ մուտատորը նշանակվում է որպես պարտադիր, որի շրջանակներում որոշ մուտացիաներ առաջացնում են այլ գեների ինքնաբուխ մուտացիայի արագության բարձրացում, օրինակ ՝ Escherichia coli մուտացիաները գենի մեջ, որը ծածկագրում է ԴՆԹ -ի պոլիմերազ III- ի (dna Q և mut D ալելներ) էլեկտրոնային ստորաբաժանումը: հանգեցնում է ինքնաբուխ մուտացիաների չափազանց բարձր մակարդակի: Մուտանտի ալելները կարող են տարբերվել վայրի տեսակից, օրինակ՝ ε ենթամիավորում միայն մեկ կամ երկու ամինաթթուների փոփոխություններով: Մուտացիան կարող է հանգեցնել պոլիմերացման (նուկլեոտիդների ընտրություն) գործունեության կամ ֆերմենտի ապացույցի ընթերցման գործունեության ճշգրտության նվազմանը: E.Coli-ի որոշ այլ մուտատոր գեներ ներառում են անհամապատասխանության վերականգնման համակարգ:

Հ.21. Որոնք են պառակտված գեները: Նկարագրեք.

Պատասխան ՝ Պառակտված գեները կարող են սահմանվել որպես այն գեները, որոնց համար ծածկագրված է ԴՆԹ -ի ոչ հարակից հատվածները, այնպես որ այդ գենի սպիտակուցային արտադրանքի համար mRNA- ն և ԴՆԹ -ն իրար գույն չեն: Սրանք միջուկային հաջորդականությամբ գեներ են, որոնք ներգրավված չեն գենային արտադրանքի կոդավորման մեջ:

Պառակտված գեները համարվում են նաև ընդհատված գեներ: Սպիտակուցը, rRNA- ն կամ tRNA- ն կոդավորող կառուցվածքային գենը, որը պարունակում է չափազանց շատ միջամտող հաջորդականություններ (ինտրոններ), որոնք չնայած ներկայացված են գենի առաջնային RNA տառատեսակում, բացակայում են հասուն ՌՆԹ մոլեկուլից (mRNA, tRNA), հետևաբար, չեն նպաստում գենային արտադրանքի կառուցվածքը:

Այսպիսով, պառակտված գենի ՌՆԹ-ի տրանսկրիպտի մուտացիան պետք է ներառի միացման գործընթաց՝ ինտրոնը ջնջելու և մնացած հաջորդականությունները՝ էկզոնները միացնելու համար: mRNA-ի դեպքում էկզոնների հաջորդականությունը ներառում է գենի կոդավորող հաջորդականությունը, ինչպես նաև չկոդավորող առաջնորդ և/կամ հետքի հաջորդականությունը: Ինտրոններն իրենք սովորաբար ոչ կոդավորում են: Բարձր էուկարիոտների միջուկային կառուցվածքային գեների մեծ մասը պառակտված գեներ են:

Հ.22. Որո՞նք են համընկնող գեները:

Պատասխան ՝ Համընկնող գեները երկու կամ ավելի գեներ են, որոնցում մաս կամ ամբողջական գենը համակցված է մյուսի մի մասի հետ: Գենները կարող են թարգմանվել տարբեր ընթերցման շրջանակներում կամ նույն ընթերցման շրջանակում՝ տարբեր սկզբնական և/կամ կանգառ կետերով կամ միացման տարբեր ձևերով: Գեների համընկնումների երևույթը առավելագույնի է հասցնում գենոմի կոդավորման կարողությունը և կարող է նաև միջոց լինել գեների արտահայտման կարգավորման համար:

Հ.23. ԴՆԹ աշխարհի պատմությունը գրված է գենային հաջորդականությամբ: Հիմնավորեք այս հայտարարությունը:

Պատասխան ՝ Ընդհանուր նախահայրից օրգանիզմների էվոլյուցիան ներկայացված է ճյուղավորված ճանապարհով, որը հայտնի է որպես երկրաբանական ծառ (նաև հայտնի է որպես ֆիլոգենետիկ կամ էվոլյուցիոն ծառ): Treeառի ճյուղավորված օրինաչափությունը հաշվարկվում է խնայողության սկզբունքի հիման վրա (տնտեսության վրա հիմնված) `որոշելու գենետիկական փոփոխությունների նվազագույն քանակը, որոնք անհրաժեշտ են յուրաքանչյուր օրգանիզմում գենի հաջորդականությունը ընդհանուր նախնուց ստանալու համար: Երբեմն ողջամիտ է ենթադրել, որ գլոբինի և ցիտոխորմ c- ի նման բարձր պահպանված սպիտակուցը կարող է օգտագործվել որպես մոլեկուլային ժամացույց `տեսակները միմյանցից հեռանալու տևողությունը չափելու համար:


ՌՆԹ-ի մշակում. Նախնական mRNA &rarr mRNA

Միջուկում արտադրված բոլոր առաջնային տառադարձումները պետք է վերամշակման փուլեր անցնեն՝ ցիտոզոլ արտահանելու համար ֆունկցիոնալ ՌՆԹ մոլեկուլներ արտադրելու համար: Մենք կսահմանափակվենք այն քայլերով, որոնք տեղի են ունենում նախնական mRNA-ի mRNA-ի մշակման ժամանակ:

Էուկարիոտիկ գեների մեծ մասը բաժանված է հատվածների։ Հայտնի սպիտակուցի համար գենի բաց ընթերցման շրջանակը վերծանելիս սովորաբար հանդիպում են ԴՆԹ-ի պարբերական հատվածներ, որոնք պահանջում են ամինաթթուներ, որոնք չեն լինում այդ գենի իրական սպիտակուցային արտադրանքում: ԴՆԹ-ի այնպիսի հատվածները, որոնք տառադարձվում են ՌՆԹ-ի, բայց չեն վերածվում սպիտակուցի, կոչվում են ինտրոններ. ԴՆԹ -ի այն հատվածները, որոնք ծածկագրում են սպիտակուցի ամինաթթուները, կոչվում են էկզոններ. Օրինակներ.

  • Հավի մեջ հայտնաբերված կոլագենի մեկ տեսակի գենը բաժանված է 52 առանձին էկզոնների:
  • Գենը դիստրոֆին, որը մուտացիայի ենթարկված է մկանային դիստրոֆիա ունեցող տղաների մոտ, ունի 79 էկզոն:
  • Նույնիսկ rRNA և tRNA գեները բաժանվում են ինտրոններով:
  • Ենթադրվում է, որ մարդու գենոմը պարունակում է մոտ 180000 էկզոն։ 21000 գեների ներկայիս գնահատմամբ՝ մեր գեների էկզոնի միջին պարունակությունը կազմում է մոտ 9:
  • -Ի սինթեզը գլխարկ. Սա փոփոխված գուանին է (G), որը կցված է նախնական mRNA- ի 5-րդ և առաջնային ծայրին, երբ դուրս է գալիս RNA պոլիմերազ II- ից (Pol II): Գլխարկը
  • պաշտպանում է ՌՆԹ -ն քայքայվելուց այն ֆերմենտներով, որոնք քայքայում են ՌՆԹ -ն 5 -րդ և սկզբնական ծայրից
  • ծառայում է որպես հավաքման կետ այն սպիտակուցների համար, որոնք անհրաժեշտ են ռիբոսոմի փոքր ստորաբաժանումը հավաքագրելու համար ՝ թարգմանությունը սկսելու համար:
  • Քայլ առ քայլ հեռացում ինտրոններ առկա է նախնական mRNA- ում և մնացածի միացում էկզոններ. Այս քայլը տեղի է ունենում, քանի որ pre-mRNA- ն շարունակում է դուրս գալ Pol II- ից:
  • -Ի սինթեզը պոլի (A) պոչ. Սա ադենին (A) նուկլեոտիդների մի հատված է: Երբ Պոլ II-ից դուրս է գալիս պոլի(A) կցման հատուկ տեղամաս նախա-մՌՆԹ-ում, տառադարձումը կտրվում է այնտեղ, և պոլի(A) պոչը կցվում է բացված 3&prime ծայրին: Սա ավարտում է mRNA մոլեկուլը, որն այժմ պատրաստ է ցիտոսոլ արտահանման համար: (Տրանսկրիպտի մնացորդը քայքայվում է, և ՌՆԹ պոլիմերազը հեռանում է ԴՆԹ-ից):

Վերոնշյալ պատկերը mRNA- ԴՆԹ հիբրիդային մոլեկուլի էլեկտրոնային միկրոգրաֆ է, որը ձևավորվել է հակամարմիններ արտազատող բջիջների կլոնից միևնույն տիպի բջիջներից ստացված ԴՆԹ-ի խառնուրդով: Ձողը ներկայացնում է 1000 հիմքի երկարություն: Ստորին դիագրամը միկրոգրաֆիայի մեկնություն է: Հաստ գիծը ներկայացնում է ԴՆԹ-ն, իսկ կետագիծը՝ mRNA: Օղակները (ես Ա, Ի Բև այլն) ներկայացնում են ինտրոնները, որոնք առանձնացնում են հակամարմինների ծանր շղթայի տիրույթները կոդավորող էկզոնները.

  • V = փոփոխական տարածաշրջան
  • Է1 = առաջին հաստատուն շրջան (ԳՀ1) տիրույթ
  • ԷՀ = կրունկի շրջան
  • Է2 և Է3 = նուկլեոտիդները, որոնք կոդավորում են երկու C-տերմինալ տիրույթները (CՀ2 և ԳՀ3)

MRNA- ի ոչ հիբրիդացված հատվածը նրա պոլի (A) պոչն է:

Այլընտրանքային միացում

Շատ սպիտակուցների համար նախնական mRNA-ի մշակումն ընթանում է տարբեր ուղիներով տարբեր բջիջներում կամ տարբեր պայմաններում: Օրինակ, B բջիջի (հակամարմին սինթեզող լիմֆոցիտ) տարբերակման սկզբում բջիջը նախ օգտագործում է էքսոն, որը կոդավորում է անդրմեմբրանային տիրույթը, որի պատճառով մոլեկուլը պահվում է բջջի մակերևույթում: Հետագայում B բջիջը անցնում է այլ էկզոնի օգտագործմանը, որի տիրույթը հնարավորություն է տալիս սպիտակուցը բջիջից արտազատվել որպես շրջանառվող հակամարմնի մոլեկուլ:

Այլընտրանքային միացումն ապահովում է փոքր քանակությամբ գեներից սպիտակուցների լայն տեսականի արտադրելու մեխանիզմ: Թեև մենք՝ մարդիկ, կարող է ունենալ ընդամենը 20 հազար գեն, մենք, հավանաբար, 10 անգամ ավելի շատ տարբեր սպիտակուցներ ենք արտադրում: Այժմ գնահատվում է, որ մեր գեների 92 & ndash94% -ը արտադրում են այլընտրանքային զուգված նախածնային mRNA- ներ: Կան ապացույցներ, որ այլընտրանքային միացման օրինակը տարբեր հյուսվածքներում հետևողականորեն տարբերվում է, ուստի պետք է կարգավորվի: Բայց արդյո՞ք բոլոր ապրանքները ֆունկցիոնալ են, թե շատերը պարզապես սխալների ենթակա գործընթացի արդյունք են, դեռ պարզ չէ:

Այլընտրանքային զուգավորումը ոչ միայն ապահովում է տարբեր սպիտակուցներ մեկ գենից, այլ նաև տարբեր 3' UTR-ներ և 5' UTR-ներ: Չնայած դրանք չեն թարգմանվում սպիտակուցի, սրանք unտթարգմանված ռէգիոնս պարունակում են ազդանշաններ, որոնք, օրինակ, թելադրում են, թե բջջի որտեղ է կուտակվելու այդ սպիտակուցը: Երկու օրինակ.

  • The 3 'UTR of the բիկոիդ Drosophila- ի գենը mRNA- ն ուղղում է դեպի սաղմի առաջը
  • նույն տարածաշրջանում VegT Xenopus- ի գենը ուղղում է իր mRNA- ն դեպի սաղմի բուսական բևեռ

Այլընտրանքային միացման ամենադրամատիկ օրինակներից է Dscam մեջ գենը Դրոսոֆիլա. Այս մեկ գենը պարունակում է մոտ 116 էկզոն, որոնցից 17-ը պահպանվում են վերջնական mRNA-ում: Որոշ էկզոններ միշտ ներառված են, մյուսները ընտրված են զանգվածից: Տեսականորեն այս համակարգը ի վիճակի է արտադրել 38.016 տարբեր սպիտակուցներ: Եվ, փաստորեն, Drosophila hemolymph- ում հայտնաբերվել է ավելի քան 18,000 տարբեր:

Այս Dscam սպիտակուցներն օգտագործվում են յուրաքանչյուր նեյրոնի համար յուրահատուկ ինքնություն հաստատելու համար: Այն աշխատում է այսպես. Յուրաքանչյուր զարգացող նեյրոն հազարավոր հնարավորություններից սինթեզում է մեկ տասնյակ Dscam mRNA-ներ: Որոնք են ընտրվածները, ըստ երևույթին, պատահականության հարց են, բայց հնարավորությունների մեծ քանակի պատճառով ամեն մի նեյրոն, ամենայն հավանականությամբ, կավարտվի մեկ տասնյակից ավելի Dscam սպիտակուցների յուրահատուկ փաթեթով: Քանի որ կենտրոնական նյարդային համակարգի յուրաքանչյուր զարգացող նեյրոն ծլում է դենդրիտներ և աքսոններ, դրանք արտահայտում են Dscam սպիտակուցների իր յուրահատուկ հավաքածուն: Եթե ​​մեկ նեյրոնի տարբեր ընդարձակումները պետք է հանդիպեն միմյանց խճճված ցանցում, որը նյարդային հյուսվածքի բնորոշ նշանն է, դրանք հետ են մղվում: Այս կերպ հազարավոր տարբեր նեյրոններ կարող են գոյակցել ինտիմ շփման մեջ՝ առանց նույն նեյրոնի տարբեր ընդարձակումների միջև ոչ ֆունկցիոնալ շփումների վտանգի։

նեյրոնը պետք է հանդիպի միմյանց, նրանք խուսափում են սինապս ստեղծելուց՝ հակահարվածի միջոցով, որը միջնորդվում է պրոտոկադերինների իրենց նույնական հավաքածուով: Այս կերպ հազարավոր տարբեր նեյրոններ կարող են գոյակցել ինտիմ շփման մեջ՝ առանց նույն նեյրոնի տարբեր ընդարձակումների միջև ոչ ֆունկցիոնալ շփումների վտանգի։

ՌՆԹ -ի որոշակի հատված կպահպանվի որպես էքսոն կամ կտրված որպես ինտրոն, կարող է տարբեր լինել տարբեր հանգամանքներում, օրինակ ՝

  • ինչ տեսակի բջիջում է գտնվում գենը
  • այդ բջիջն ինչ տարբերակման փուլով է անցնում
  • ինչ արտաբջջային ազդանշաններ է ստանում այդ բջիջը:

Ակնհայտ է, որ այլընտրանքային միացման ուղու անցումը պետք է սերտորեն կարգավորվի:

Trans-splicing

Գեների մեծամասնությունը տառադարձվում է, և դրանց տեքստերը մշակվում են վերը նկարագրվածի պես: ՌՆԹ պոլիմերազան անցնում է մեկ գենային տեղանքի մեկ շղթայով ՝ ձևավորելով նախնական mRNA, որը մշակվում է (ներառյալ ինտրոնների հեռացումը) ՝ հասուն mRNA ձևավորելու համար: Բայց կան բացառություններ: Հայտնաբերվել են մի շարք դեպքեր, երբ երկու տարբեր պրեկուրսորային սղագրություններ միացվել են միասին ՝ կազմելով վերջնական ՌՆԹ մոլեկուլը: Երեւույթը կոչվում է տրանս-զուգավորում

Օրինակներ. Մեկ ՌՆԹ մոլեկուլի սինթեզ `տեղանքների սղագրությունների միաձուլման միջոցով

  • գտնվում են նույն քրոմոսոմի վրա իրարից հեռու կամ
  • նույն գենային տեղանքի հակառակ շղթաների վրա կամ
  • որոնք գենի երկու ալելներն են իրենց առանձին (հոմոլոգ) քրոմոսոմների վրա։

Դրանց կենսաբանական նշանակությունը տրանս-դրանցից շատերի համար առայժմ անհայտ պատճենները անհայտ են:


Դիտեք տեսանյութը: Регуляция транскрипции (Հունվարի 2023).