Տեղեկատվություն

Ինչպե՞ս է տառադարձման արագության վրա ազդում ջերմաստիճանը:

Ինչպե՞ս է տառադարձման արագության վրա ազդում ջերմաստիճանը:


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ինչպե՞ս է տառադարձման արագության վրա ազդում ջերմաստիճանը: Ավելի ճիշտ, ես փնտրում եմ հոդված, որը քանակապես չափել է «միջին գենի» տրանսկրիպցիայի արագությունը և ցույց տալ, թե ինչպես է այս արագության վրա ազդում ջերմաստիճանը։

Այս հարցի վերաբերյալ Քրիսը գտավ այս հոդվածը, որտեղ նման չափումներ էին կատարվում, բայց նրանք օգտագործում էին ինչ -որ կամայական միավոր (ինչպես դա նշվեց այստեղ @shigeta- ի կողմից), որը չի կարող առնչվել որևէ համապարփակ միավորի, ինչպիսին է «ժամում ամինաթթվի մոլը»: կամ նման մի բան:


Եթե ​​դիտում եք տառադարձումը, ապա խոսում եք ՌՆԹ -ի պոլիմերազի մասին:

Եվ կան բազմաթիվ տարբերակներ: Ահա Nature- ի մի լավ թերթ, որը քննարկում է ջերմաստիճանը և RNA Pol- ը

http://www.nature.com/ncomms/journal/v1/n6/full/ncomms1076.html

Եվ մեկ այլ.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/m/pubmed/12729734/

Ես չկարողացա լիարժեք մուտք ունենալ այս JBC թերթին, բայց կարծում եմ, որ պատասխանը հստակ կլինի այստեղ, հավանաբար արժե նայել

Մ. Չեմբերլինը և J.. Ռինգը: T7-ին բնորոշ ռիբոնուկլեինաթթվի պոլիմերազի բնութագրումը: 1. Ֆերմենտային ռեակցիայի ընդհանուր հատկությունները և ֆերմենտի կաղապարային առանձնահատկությունը: Ջ Բիոլ Քիմ. 248: 2235-44 (1973)


Կարևոր գործոններ, որոնք ազդում են ֆերմենտի ակտիվության վրա

Ֆերմենտները անհրաժեշտ են գրեթե բոլոր քիմիական ռեակցիաների համար, որոնք տեղի են ունենում կենդանի բջիջների ներսում: Այնուամենայնիվ, ֆերմենտների գործունեությունը կարող է ուժեղացվել կամ արգելվել մի շարք գործոններով: Այս հոդվածում մենք խոսում ենք այն բոլոր գործոնների մասին, որոնք ազդում են ֆերմենտների գործունեության վրա: Շարունակեք կարդալ:

Ֆերմենտները անհրաժեշտ են գրեթե բոլոր քիմիական ռեակցիաների համար, որոնք տեղի են ունենում կենդանի բջիջների ներսում: Այնուամենայնիվ, ֆերմենտների գործունեությունը կարող է ուժեղացվել կամ արգելվել մի շարք գործոններով: Այս հոդվածում մենք խոսում ենք բոլոր այն գործոնների մասին, որոնք ազդում են ֆերմենտների գործունեության վրա։ Կարդացեք …

Ֆերմենտները սպիտակուցների վրա հիմնված բարդ մոլեկուլներ են, որոնք արտադրվում են բջիջների կողմից: Կան մի քանի ֆերմենտներ, որոնք ներգրավված են տարբեր կենսաքիմիական ռեակցիաներում: Մեր մարմնում առկա այս ֆերմենտներից յուրաքանչյուրը կարող է ազդել ցանկացած քիմիական ռեակցիայի կամ մի շարք ռեակցիաների վրա: Նրանք ծառայում են որպես օրգանական կատալիզատորներ և մեծացնում են ռեակցիաների արագությունը, որոնց մասնակցում են։ Ֆերմենտի բացակայության դեպքում քիմիական ռեակցիայի արագությունը դառնում է չափազանց դանդաղ: Այս ռեակցիաներից մի քանիսը կարող են տեղի չունենալ, եթե մարմնում չկա համապատասխան տեսակի ֆերմենտ:


Ջրի ջերմաստիճանի համատեքստային ազդեցությունը դաշտում գետակ իշխանի աճի տեմպերի վրա

The Nature Conservancy - Connecticut River Program, AG Annex A, University of Massachusetts, Amherst, MA, ԱՄՆ

Ս.Օ. Conte Anadromous Fish Research Center, US Geological Survey/Leetown Science Center, Turners Falls, MA, U.S.A.

Ս.Օ. Conte Anadromous Fish Research Center, ԱՄՆ Երկրաբանական ծառայություն/Leetown Science Center, Turners Falls, MA, ԱՄՆ

Հյուսիսային հետազոտական ​​կայան, USDA անտառային ծառայություն, Մասաչուսեթսի համալսարան, Ամհերստ, MA, ԱՄՆ

Բնության պահպանություն – Կոնեկտիկուտ գետի ծրագիր, AG Հավելված Ա, Մասաչուսեթսի համալսարան, Ամհերստ, ՄԱ, ԱՄՆ:

Ս.Օ. Conte Anadromous Fish Research Center, ԱՄՆ Երկրաբանական ծառայություն/Leetown Science Center, Turners Falls, MA, ԱՄՆ

Ս.Օ. Conte Anadromous Fish Research Center, ԱՄՆ Երկրաբանական ծառայություն/Leetown Science Center, Turners Falls, MA, ԱՄՆ

Հյուսիսային հետազոտական ​​կայան, USDA անտառային ծառայություն, Մասաչուսեթսի համալսարան, Ամհերստ, MA, ԱՄՆ

Ամփոփում

1. Քաղցրահամ ջրերի ձկների վրա կլիմայի փոփոխության ազդեցության մոդելավորումը պահանջում է դաշտի վրա հիմնված կայուն գնահատումներ՝ հաշվի առնելով բազմաթիվ գործոնների փոխազդեցությունը:

2. Մենք օգտագործել ենք վայրի իշխանի 8-ամյա անհատական ​​ուսումնասիրության տվյալները (Salvelinus fontinalisբնակչությունը `փորձելու ջրի ջերմաստիճանի ազդեցությունը սեզոնին համապատասխան աճի վրա` շրջակա միջավայրի այլ փոփոխությունների (այսինքն `սեզոնի, հոսքի հոսքի) կամ կենսաբանական գործոնների (տեղական առվակի իշխան կենսազանգվածի խտությունը և ձկների տարիքը և չափերը) West Brook- ում, երրորդը - պատվերի հոսք արևմտյան Մասաչուսեթսում, ԱՄՆ

3. Շրջակա միջավայրի ջերմաստիճանի փոփոխություններն ազդել են անհատական ​​աճի տեմպերի վրա: Ընդհանուր առմամբ, ավելի բարձր ջերմաստիճանը կապված է ձմռանը և գարնանը աճի ավելի բարձր տեմպերի հետ, իսկ ամռանը և աշնանը աճի ավելի ցածր տեմպերը: Այնուամենայնիվ, ջերմաստիճանի ազդեցությունը աճի վրա խիստ կախված էր համատեքստից՝ տարբերվելով և՛ մեծությամբ, և՛ ուղղությամբ՝ կախված սեզոնից, հոսքի հոսքից և ձկան կենսազանգվածի խտությունից:

4. Մենք պարզեցինք, որ հոսքի հոսքը և ջերմաստիճանը ուժեղ և բարդ ինտերակտիվ ազդեցություն են ունենում իշխանի աճի վրա: Ամենացուրտ ջերմաստիճանում (ձմռանը) առուների բարձր հոսքերը կապված էին իշխանի աճի տեմպերի նվազման հետ: Գարնանը և աշնանը և սովորական ամառներին (երբ ջրի ջերմաստիճանը մոտ էր աճի օպտիմալ ցուցանիշներին), ավելի բարձր հոսքերը կապված էին աճի տեմպերի աճի հետ: Բացի այդ, տվյալ ջերմաստիճանում հոսքի ազդեցությունը (հոսքի-ջերմաստիճանի փոխազդեցությունը) տարբերվում էր եղանակների միջև:

5. Իշխանի խտությունը բացասաբար է ազդել աճի տեմպի վրա և ուժեղ փոխազդեցություն է ունեցել ջերմաստիճանի հետ չորս եղանակներից երկուսում (այսինքն ՝ գարուն և ամառ) ՝ ավելի մեծ բացասական ազդեցություններով բարձր ջերմաստիճանների դեպքում:

6. Մեր ուսումնասիրությունը տրամադրեց կայուն, ինտեգրալային դաշտի վրա հիմնված գնահատումներ ջերմաստիճանի ազդեցության աճի տեմպերի վրա մի տեսակների համար, որոնք ծառայում են որպես սառը ջրի հարմարեցված էկտոթերմների մոդելային օրգանիզմ, որոնք բախվում են շրջակա միջավայրի փոփոխությունների հետևանքների հետ: Ուսումնասիրության արդյունքները վճռականորեն ենթադրում են, որ սեզոնին համապատասխան գնահատականներ չտալը կամ հոսքի ռեժիմի և ձկների խտության հետ փոխհարաբերությունները հստակ հաշվի չառնելը լրջորեն կվտանգի մեր ձկների աճի տեմպերի վրա կլիմայի փոփոխության ազդեցությունները կանխատեսելու ունակությունը: Ավելին, մեր գտած համապատասխանությունը էմպիրիկ դիտարկումների և հավանական էներգետիկ մեխանիզմների միջև հուշում է, որ մեր ընդհանուր արդյունքները պետք է համապատասխան լինեն ավելի լայն տարածական և ժամանակային մասշտաբներով:


Eneերմաստիճանի ազդեցությունը վերածննդի արագության վրա ժամանակավոր գնահատված վերածննդի դաշտում պլանարյանների մոտ

Ագնես Բրյունդսթեդ, Հ. Զարգացում 1961 թվականի մարտի 1 9 (1) ՝ 159–166: doi՝ https://doi.org/10.1242/dev.9.1.159

Գոյություն ունի պլանարների մոտ ժամանակի աստիճանի վերականգնման դաշտ՝ գլխի վերականգնման համար (Brøndsted, 1946, 1956 A. & H. V. Brøndsted, 1952): Այս դաշտի բնութագրերը, արտահայտված վերածննդի արագությամբ, հատուկ են տեսակին: Այս դաշտի առկայությունը ապահովում է ներդաշնակ վերածնում մարմնի ամենուր կտրվածքներից, քանի որ կտրվածքը միշտ կբացահայտի «բարձր կետը», որտեղ գլխի վերածնումն սկսվում է մեծագույն արագությամբ ՝ այդպիսով առաջատար լինելով կազմակերպությունում և միևնույն ժամանակ արգելակելով գլուխը: բլաստեմայի այլ վայրերում ձևավորելու հակումներ (Բրյունդսթեդ, 1956):

Ոլորտի այս բնութագրիչների հիմքում ընկած գործոններն անհայտ են: Ներկայացված խնդիրները մեր լաբորատորիայի վրա հարձակվում են մի քանի տեսանկյունից: Այս աշխատանքի համար որոշակի հետաքրքրություն է առաջանում իմանալ, թե ինչպես կարող են ժամանակի գնահատված դաշտերում տարբեր մակարդակներում վերածննդի տարբեր տեմպերը ազդել ջերմաստիճանի տարբեր մակարդակներից:

Նյութը և մեթոդները Փորձերն իրականացվել են երկու տեսակների վրա, որոնք մեծապես տարբերվում են իրենց ժամանակային աստիճանի վերածննդի դաշտերի բնութագրերով:


ՆՅՈՒԹԵՐ ԵՒ ՄԵԹՈԴՆԵՐ

Նեմատոդի աճեցում

Plectus murrayi Yeates 1970 -ը ՝ հավաքված հողերից և նստվածքներից Թեյլոր հովտում (77 ° S լայնություն, 163 ° E երկայնություն), Անտարկտիդա, NSF McMurdo Dry Valley Երկարաժամկետ բնապահպանական հետազոտությունների վայր, աճեցվել է զանգվածային մշակույթում ՝ փորձերի և վերահսկման համար բավարար քանակություն ստեղծելու համար: բուժումներ. Նեմատոդները մշակվել են ավազի ագարե սալերի մեջ (Bacto-agar 15 gl −1), որոնք պարունակում էին 20 մլ լ −1 Bold's Modified Basal Freshwater (BMBF) սննդանյութեր (Sigma Aldrich Inc., St Louis, MO, USA), ինչպես նկարագրված էր նախկինում (Adhikari et al., 2009): Ավազե ագարի թիթեղները նեմատոդներով 1-2 շաբաթ շարունակ ինկուբացվել են 26 ° C ջերմաստիճանում, այնուհետև 3-5 շաբաթ 15 ° C- ով: Նեմատոդները պահվել են 4°C ջերմաստիճանում 1-2 շաբաթ, նախքան հավաքվելը փորձերի համար:

Չորացման բուժման ազդեցությունը գոյատևման վրա

RH- ն վերահսկվում էր հագեցած աղի լուծույթներով (Winston and Bates, 1960) ապակու չորացման պալատներում (Ginsberg Scientific Inc., Fort Collins, CO, USA): Պահանջվող RH- ն պահպանվել է չորացման պալատում 4 ± 0.2 ° C ջերմաստիճանում 3 օր հավասարակշռության համար `նախքան նեմատոդների ավելացումը: Թորած ջրի գոլորշիով խոնավությունը պահպանվել է որպես 100% RH, իսկ տարբեր հագեցած աղի լուծույթներով ՝ 98%, 85%, 75%, 50% և 35% RH, մինչդեռ 0% RH պահպանվել է Drierite չորացնող միջոցով (Drierite Co. Ltd, Քսենիա, ՕՀ, ԱՄՆ):

RH- ի տարբեր պայմանների ենթարկվելուց հետո նեմատոդների գոյատևումը գնահատելու համար, մոտ 200 նեմատոդ պարունակող 100 մկ կասեցումը դրվել է 35 մմ Petri ամանի մեջ և տեղադրվել չորացման պալատներում, որոնք պահպանվում են 4 ± 0.2 ° C ջերմաստիճանում: Բուժումը բաղկացած էր 98%, 75%, 35%, 98%+85%+…+0% ազդեցությունից (ՌՀ-ի աստիճանական նվազման ենթարկված 98%-ից մինչև 85%, 75%, 50% և 35% RH 6-ի համար: h յուրաքանչյուրը `0% RH) և 0% RH- ի ազդեցությունից առաջ 10 օր: Նեմատոդները 24 ժամվա ընթացքում 4°C ջերմաստիճանում ջրում են ջրում: Կենսունակությունը որոշվում է նեմատոդի շարժումով: Այն վայրերում, որտեղ նեմատոդները ստատիկ էին, մազի զոնդն օգտագործվում էր շարժումը խթանելու համար: Այս գրգռումից հետո չշարժվող նեմատոդները գրանցվել են որպես մեռած: Բոլոր փորձերը կրկնվել են առնվազն 3 անգամ նույն պայմաններում, օգտագործելով խառը փուլային պոպուլյացիաներ:

Դանդաղ չորացման և սառեցման ազդեցությունը գոյատևման վրա

Դանդաղ չորացման ազդեցությունը նեմատոդների գոյատևման վրա գնահատելու համար մոտ 100 նեմատոդ պարունակող 100 մկ կասեցումը դրվեց 35 մմ Petri ամանի մեջ և տեղադրվեց չորացման խցիկներում ՝ տարբեր RH- ով: Բուժումը բաղկացած էր 3 և 7 օրվա ընթացքում 75% RH-ի հետ (նախաբուժում+չորացում) կամ առանց (չորացում) նախնական մշակման 98% (12 ժամվա ընթացքում), որին հաջորդում է 85% RH (12 ժամվա ընթացքում): Նեմատոդի կենսունակությունն ու գոյատևումը որոշվել է, ինչպես նշվեց վերևում:

Աստիճանաբար սառեցման ազդեցությունը նեմատոդների գոյատևման վրա գնահատելու համար մոտ 200 նեմատոդ պարունակող 100 մկ կասեցումը դրվեց 1,7 մլ Eppendorf խողովակի մեջ և տեղադրվեց ջերմաստիճանի խցիկում (Cincinnati Subzero Products Inc., Cincinnati, OH, USA), որը կարող է վերահսկել ջերմաստիճանը -30 ° C- ից մինչև 100 ° C ՝ 1 ° C ժամ −1 հովացման արագությամբ: Նեմատոդները կամ ուղղակիորեն ենթարկվել են −10°C (սառեցման) կամ աստիճանական սառեցման՝ 4°C-ից −10°C (նախամշակում+սառեցում) 1°C ժ −1 արագությամբ 3 և 7 օրվա ընթացքում: Յուրաքանչյուր բուժման համար կատարվել է առնվազն երեք կրկնություն, և գոյատևումը գնահատվել է ինչպես նկարագրված է վերևում:

Սթրեսի բուժում և գենի արտահայտում

Չորացման բուժման ազդեցությունը գենի արտահայտման վրա չափվել է 35 մմ Petri ամանի մեջ դնելով 200 մկ կասեցում, որը պարունակում է մոտավորապես 1000 նեմատոդներ և դրանք ենթարկելով տարբեր RH- ի: Բուժումը բաղկացած էր նախնական մշակումից (98% RH-ի ազդեցություն, որին հաջորդում է 85% RH յուրաքանչյուրը 12 ժամ), նախնական բուժում + չորացում (75% RH ազդեցությունը նախնական բուժումից հետո 3 օր), չորացում (75% RH ուղղակի ազդեցություն 3 օր առանց նախնական բուժման: ), նախաթերապիա+ ռեհիդրացում (ջրում չորացում 4 ° C ջերմաստիճանում նախամշակումից հետո+ չորացում) և ռեհիդրատացիա (ջրազրկում ջրի մեջ չորացումից հետո):

Սառեցման ազդեցությունը գենի արտահայտման վրա գնահատելու համար մոտ 200 նեմատոդ պարունակող 200 մկ կասեցումը դրվեց 1,7 մլ Eppendorf խողովակի մեջ և տեղադրվեց ջերմաստիճանի խցիկում: Բուժումներն իրականացվել են նախնական բուժում (24 ժամ 4 ° C- ի ազդեցության տակ), սառեցում (3 օր direct10 ° C- ի անմիջական ազդեցություն), նախամշակման+սառեցում (4 ° C- ից մինչև −10 ° C աստիճանական սառեցում 1 արագությամբ) ° C h −1 և թողել վերջնական ջերմաստիճանում 3 օր), նախաթերապիա+վերականգնում (ջրի վերականգնում 4 ° C- ում ՝ նախամշակման+սառեցումից հետո) և վերականգնում (ջրի սառեցումից 4 ° C ջերմաստիճանում վերականգնում):

Չորացումից հետո սառեցման գոյատևումը

Որոշելու համար, թե արդյո՞ք չորացումն ուժեղացնում է նեմատոդների սառեցման գոյությունը, 100 մկլ պարունակող կախոցը, որը պարունակում է մոտ 200 նեմատոդ, դրվել է 1.7 մլ Eppendorf խողովակի մեջ և ենթարկվել 98% -ի, որին հաջորդել է 85% RH 4 ° C ջերմաստիճանում `յուրաքանչյուրը 12 ժամվա ընթացքում: Նեմատոդներով այդ խողովակները տեղադրվել են վերահսկվող ջերմաստիճանի պալատում և ենթարկվել աստիճանական սառեցման 4 ° C- ից −10 ° C (չորացում+ սառեցում) 1 ° C h − 1 արագությամբ և թողել վերջնական ջերմաստիճանում 3 (կարճ ազդեցություն) ) և 7 (երկար ազդեցություն) օր: Նեմատոդներին թույլատրվեց ջրի մեջ վերականգնել 4 ° C ջերմաստիճանում 24 ժամվա ընթացքում, իսկ մահացությունը գնահատվեց, ինչպես նկարագրված է վերևում:

Այբբենարանի ձևավորում և գենի ընտրություն

Գեները ընտրվել են չորացման սթրեսի ժամանակ տարբեր արտահայտված արտագրությունների ցանկից (Adhikari et al., 2009): Հետազոտության համար ընտրվել են ութ տարբեր գեներ, որոնք ֆունկցիոնալ դեր ունեն սթրեսի արձագանքման, նյութափոխանակության և ազդանշանի փոխանցման գործում: Այբբենարանները նախագծվել են EST-ներից (ընտրվել են չորացած և թարմ նեմատոդների սուբտրակտիվ հիբրիդացման միջոցով) օգտագործելով PrimerQuest™ IDT-ից (Coralville, IA, ԱՄՆ) և սինթեզվել Operon Biotechnologies Inc.-ի կողմից (Huntsville, AL, ԱՄՆ) (Աղյուսակ 1):

ՌՆԹ արդյունահանում և cDNA սինթեզ

Ընդհանուր ՌՆԹ քանակական իրական ժամանակի ՊՇՌ-ի համար արդյունահանվել է Տրիզոլ ռեագենտի միջոցով (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, ԱՄՆ) տարբեր բուժումներից յուրաքանչյուրին ենթարկված նեմատոդներից: ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար օգտագործվել են յուրաքանչյուր սթրեսային բուժման երեք կրկնօրինակ (գումարած վերահսկիչների երեք խմբեր)՝ յուրաքանչյուր բուժման տարբեր համակցության համար ստանալով երեք անկախ ՌՆԹ քաղվածքներ: Տարբեր բուժման ենթարկված նեմատոդներն ուղղակիորեն համասեռացվել են հեղուկ ազոտի մեջ, խառնվել են Տրիզոլի ռեակտիվի հետ, և կախոցը ենթարկվել է սառեցման -հալման երեք ցիկլերի `օգտագործելով հեղուկ ազոտ և 37 ° C ջրային բաղնիք: Կախոցը մանրացվել է հավանգով և մուրճով, և պտտվող 40 մլ քլորոֆորմ ավելացվել է, և խողովակները 15 վրկ թափահարվել են ուժգին, այնուհետև ինկուբացվել 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Centենտրիֆուգումից հետո (15 րոպե, 12,000) է4°C), ՌՆԹ պարունակող ջրային փուլն առանձնացվել է մյուս փուլերից, որոնք պահվել են ԴՆԹ պատրաստման համար (տես ստորև)։ Անգույն վերին ջրային փուլը տեղափոխվեց թարմ սրվակների մեջ ՝ ՌՆԹ -ն նստեցնելու համար ՝ ավելացնելով 100 մլ իզոպրոպիլ սպիրտ: Նմուշները ինկուբացվել են 10 րոպե և ցենտրիֆուգացվել (20 րոպե, 12,000) է4°C): ՌՆԹ-ի նստվածքները այնուհետև երկու անգամ լվացվել են 75% էթանոլով, չորացվել են օդում, լվացվել են առանց նուկլազի ջրի մեջ և քանակականացվել և ստուգվել որակի վրա: միջոցով սպեկտրոֆոտոմետր (Ա260/Ա280& gt1.9 NanoDrop ND-1000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, ԱՄՆ) և ագարոզե գելի էլեկտրոֆորեզ:

Հակադարձ արտագրումը (RT) կատարվել է յուրաքանչյուր նմուշից 1 մկգ ընդհանուր ՌՆԹ -ով: Պոլիադենիլացված mRNA-ի RT արձագանքը cDNA-ին կատարվել է ImPromp-II™ հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով (Promega Corporation, Madison, WI, ԱՄՆ) և օլիգո(dT) պրայմեր: Ընդհանուր RNA- ն ինկուբացվել է 20 pmol oligo (dT) այբբենարանով 70 ° C ջերմաստիճանում 5 րոպե և արագ սառեցվել սառույցի վրա: Հակադարձ տառադարձման խառնուրդը (20 մկլ) պատրաստվել է 4 μl ImPromp-II 5 × ռեակցիայի բուֆերի, 2.4 μl (3 մմոլ l −1) MgCl- ի խառնուրդով:2 և 1 μl dNTP խառնուրդ (10 մմոլ լ -1 յուրաքանչյուր dNTP): Ավելացվեց նուկլեազազերծ ջուր (6,6 մկլ), պտտվեց, և ավելացվեց 1 մկլ ImPromp-II հակադարձ տրանսկրիպտազ: Հակադարձ տրանսկրիպցիայի խառնուրդը խառնվել է ՌՆԹ կաղապարի հետ և ինկուբացվել 25°C-ում 5 րոպե եռացման համար, իսկ առաջին շարանը երկարացվել է 60 րոպե 42°C-ում: Հակադարձ տրանսկրիպտազը ապաակտիվացվել է 15 րոպե տաքացնելով մինչև 70°C: CDNA- ն նստել է 100% էթանոլի մեջ և երկու անգամ լվացվել 75% էթանոլով, չորացվել է օդում և լուծարվել DEPC- ով մշակված ջրի մեջ:

Իրական ժամանակի քանակական RT-PCR

Իրական ժամանակի քանակական PCR- ն իրականացվել է LightCycler 480 SYBER Green I mastermix- ով (երեք կրկնվող նմուշ ՝ յուրաքանչյուր բուժում-ժամանակի համադրության համար) և գենին հատուկ պրիմերներով Light Cycler 480 RT-PCR համակարգում (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) հագեցած LightCycler 480 ծրագրով, հետևյալ ծրագրով. 3 րոպե 95°C ջերմաստիճանում 45 կրկնություն 30 վրկ 94°C-ում, 30 վրկ 58°C և 1 րոպե 72°C ջերմաստիճանում, որին հաջորդում է հալման ստանդարտ կորը: Իրական ժամանակի PCR ռեակցիայի խառնուրդը պարունակում էր հետևյալ տարրերը 10 մլ վերջնական ծավալով. 3 μl PCR կարգի ջուր, 5 μl PCR պրայմերներ (20 pmol μl −1), 5 մկլ կրկնակի խտացված SYBR Green mastermix և 1 μl ձևանմուշ ԴՆԹ: Բացասական վերահսկողության ռեակցիաները, որոնք պարունակում են ջուր cDNA-ի փոխարեն, ներառվել են PCR ռեակցիաների յուրաքանչյուր խմբաքանակում՝ ապահովելու համար, որ աղտոտումը խնդիր չէ: mRNA քանակական սխալները և գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածության շեղումները նվազագույնի հասցնելու և միջընտրանքային տատանումները շտկելու համար մենք օգտագործեցինք 18S ռիբոսոմային ՌՆԹ (Pm-18S) -ից P. murrayi որպես ներքին վերահսկողություն:

Գենային հատուկ պրիմերների ցանկ, որոնք օգտագործվում են իրական ժամանակի քանակական RT-PCR վերլուծության մեջ


ԱՐԴՅՈՒՆՔՆԵՐ

PlaNET-seq- ը խստորեն հայտնաբերում է նորածին RNAPII տառադարձումը Արաբիդոպսիս

RNAPII համալիրները մաքրելու համար մենք հիմնվել ենք երկրորդ ամենամեծ RNAPII ենթամիավորի (NRPB2-FLAG) FLAG-իմունոպրեցիպտացիայի վրա: NRPB2-FLAG կոնստրուկցիան ծածկում է մահացու նուլ-ալելները nrpb2, ինչը այս տողերը հարմար է դարձնում RNAPII-ը գրավելու համար, քանի որ բոլոր կոմպլեքսները կրում են հատկորոշված ​​NRPB2 ենթամիավորը (24): Կայուն գիծը ցույց է տալիս վայրի տիպի ֆենոտիպ: Մենք օգտագործեցինք արագ սառեցված միջուկի մասնաբաժինը Արաբիդոպսիս սածիլները որպես սկզբնական նյութ (Նկար 1 Ա): RNAPII համալիրները բարձր արդյունավետությամբ իմունային տեղումներ են ստացել (Լրացուցիչ նկար S1A), իսկ ծագող ՌՆԹ -ն մաքրվել է և օգտագործվել գրադարանաշինության համար (Լրացուցիչ նկար S1B): Մշակված ընթերցումները համընկնում էին Արաբիդոպսիս գենոմը, որը նույնականացնում է նորածին ՌՆԹ-ի 3'-ծայրերի դիրքերը (Նկար 1B, վերին վահանակ): Պատկերացված գենոմի զննարկիչում, plaNET-seq- ը ցույց է տալիս բնորոշ «բծավոր» օրինակը, որը ներկայացնում է նորածին RNAPII տառադարձումը յուրաքանչյուր նուկլեոտիդում: Մեր plaNET-seq գրադարանները ցուցադրեցին բարձր վերարտադրելիություն (Պիրսոնի գործակից ռ > 0.98) կրկնօրինակների և հաստատված ցածր արագությամբ նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի միջև գենի սահմաններում (Լրացուցիչ նկար S1C–F): Մենք նաև ստեղծել ենք կեղծ IP planNET-seq գրադարան՝ մեր արձանագրության խստությունը գնահատելու համար: Ockաղր-IP ազդանշանը ցույց տվեց թույլ փոխկապակցվածություն FLAG-IP գրադարանի ազդանշանի հետ (Լրացուցիչ նկար S1G, Pearson գործակից ռ & lt 0.35): Mաղր-IP plaNET-seq գրադարանների ազդանշանը չափազանց ցածր էր ՝ աջակցելով FLAG-IP- ի հատուկ ազդանշանին, որը համապատասխանում էր մեր նմուշներում ծագող RNAPII տառադարձմանը (Նկար 1 Բ, Լրացուցիչ նկար S1H): Մեր արձանագրությունը գելից զերծ է և որոշ քայլերով տարբերվում է հրապարակված pNET-seq արձանագրությունից:Օրինակ, FLAG հակամարմինը օգտագործվում է էնդոգեն RNAPII հակամարմինների փոխարեն IP փուլում (Լրացուցիչ նկար S2A – C): Nasագող ՌՆԹ-ի մեր գրադարանները հարստացված էին ինտոնիկ ընթերցումների և ընթերցումների համար `ծանոթագրված բազմա (A) կայքի ներքևում, որը ներկայացնում էր RNAPII համալիրները, որոնք տառադարձման դադարեցման են ենթարկվում: Մշտական ​​վիճակի մեթոդները, ինչպիսիք են RNA-seq- ը, չեն տալիս այս տեղեկատվությունը ծագող RNAPII տառադարձման վերաբերյալ ՝ հետագայում աջակցելով նորածին ՌՆԹ-ի մեր հաջող հարստացմանը (Նկար 1 Բ): Մենք զանգահարեցինք արտագրություններ դե նորո planNET-seq տվյալներից՝ օգտագործելով groHMM ալգորիթմը (32) և հայտնաբերել հազարավոր տառադարձումներ, որոնք ծանոթագրված չեն Araport11-ում (Նկար 1C և D, Լրացուցիչ Աղյուսակ S1): Այս նոր տեքստերի մեծամասնությունը մոտ էր հայտնի գեներին կամ դրանք համընկնում էին հակասենսային շղթայի վրա (Նկար 1C և D): Ընդհանուր առմամբ, RNA- հաջորդական տվյալները լավ փոխկապակցված են եղել ծանոթագրված տեքստերի մեր plaNET-seq տվյալների հետ, սակայն աննկատ տառադարձումների դեպքում `վատ, ընդգծելով plaNET-seq- ի ուժը ՝ գրանցել RNA- ի արագ քայքայման ենթարկվող տառադարձումները (լրացուցիչ Գծապատկեր S2D և E):

Genածր ջերմաստիճանի ի պատասխան plaNET- հաջորդականությամբ նորածին տառադարձման գենոմի լայնածավալ հայտնաբերում: (Ա) planNET-seq-ի աշխատանքային հոսք: NRPB2-FLAG կայուն գծի քրոմատինը մեկուսացված է և բուժվում է DNase I- ով: Իմունային տեղումների և սպիտակուցային համալիրների խափանումից հետո RNAPII- ին ամրացված ՌՆԹ-ն մաքրվում է և օգտագործվում գրադարանաշինության համար: Հերթականացված ՌՆԹ-ի 3'-վերջում գտնվող հիմքը RNAPII համալիրի կողմից ավելացված վերջին բազան է և, հետևաբար, համընկնում է տրանսկրիպցիոն ներգրավված RNAPII-ի գենոմային դիրքին: (Բ) PlaNET-seq ծածկույթի պրոֆիլի օրինակ At2g28305 գենի համար: RNAPII- ի դիրքերը ցուցադրվում են իմաստային (կապույտ) և հակասենսական (կարմիր) թելերի համար: Համեմատության համար ցուցադրվում են նաև ծածուկ-IP (բացասական հսկողություն) plaNET-seq նմուշը, ինչպես նաև խճճված RNA-seq, TSS-seq (արտագրման մեկնարկի վայրի հաջորդականացումը) և DR-seq (ուղիղ RNA հաջորդականացման) հետքերը: DR-seq հետքը բացահայտում է mRNA-ի ճեղքման և պոլիադենիլացման (PAS) վայրեր: (Գ) planNET-seq-ով հայտնաբերված նոր տառադարձումների սահմանում: Դիվերգենտ տառադարձումները սկսում են ոչ ավելի, քան 500 bp կոդավորման վերագրանցման TSS-ի վերևում: Վերին հոսանքով տառադարձումները սկսվում են իմաստային շղթայի վրա և մասամբ համընկնում են ծանոթագրված տառադարձման հետ: Կոնվերգենտ տառադարձումները սկսվում են հակազգայական շղթայի վրա կոդավորող գենային մարմնի 5'-ի կեսից: PAS-ի հետ կապված տառադարձումները սկսվում են 3'-կեսից կամ ոչ ավելի, քան 20%-ից ներքև՝ դրա երկարությունից հակազգայական շղթայի վրա: Ստորին հոսքի տառադարձումները սկսվում են զգայական շղթայի գենի ներսում և շարունակվում են ծանոթագրված PAS- ից դուրս: Հեռավոր հակասենսագրությունները համընկնում են հակասենսային շղթայի անոտացված գենի հետ, բայց սկսում են հետընթաց հոսանքից ավելի ցածր, քան գենի երկարության 20% -ը: Ի վերջո, եթե վերոնշյալ դասերից որևէ մեկի կողմից վերը նշված վերծանումը չի նկարագրվել, այն սահմանվել է որպես միջգենային տառադարձում: (Դ) (A) -ում նկարագրված դասարաններին պատկանող տառադարձումների թվի գծապատկերը: Araport11- ում հայտնի ոչ ծածկագրող տեքստերը ցուցադրվում են վանդակավոր լրացման և plaNET-seq- ի կողմից առանց լրացման վավերացված նոր տառադարձման մեջ:

Genածր ջերմաստիճանի ի պատասխան plaNET- հաջորդականությամբ նորածին տառադարձման գենոմի լայնածավալ հայտնաբերում: (Ա) PlaNET-seq- ի աշխատանքային հոսքը: Քրոմատինը կայուն NRPB2-FLAG գծից մեկուսացված է և բուժվում է DNase I: Իմունային նստվածքից և սպիտակուցային բարդույթների խզումից հետո RNAPII-ին կցված ՌՆԹ-ն մաքրվում և օգտագործվում է գրադարանի կառուցման համար: Հաջորդականացված ՌՆԹ-ի 3′-վերջի հիմքը վերջին հիմքն է, որն ավելացվել է RNAPII համալիրի կողմից և, հետևաբար, համընկնում է տրանսկրիպցիոնորեն ներգրավված RNAPII- ի գենոմային դիրքին: (Բ) PlaNET-seq ծածկույթի պրոֆիլի օրինակ At2g28305 գենի համար: RNAPII- ի դիրքերը ցուցադրվում են իմաստային (կապույտ) և հակասենսական (կարմիր) թելերի համար: Համեմատության համար ցուցադրվում են նաև ծածուկ-IP (բացասական հսկողություն) plaNET-seq նմուշը, ինչպես նաև խճճված RNA-seq, TSS-seq (արտագրման մեկնարկի վայրի հաջորդականացումը) և DR-seq (ուղիղ RNA հաջորդականացման) հետքերը: DR-seq ուղին բացահայտում է mRNA- ի ճեղքման և պոլիադենիլացման (PAS) տեղերը: (Գ) PlaNET-seq- ի կողմից հայտնաբերված նոր տառադարձումների սահմանում: Տարբեր տառադարձումները սկսում են ոչ ավելի, քան 500 bp կոդավորող տառադարձման TSS- ի հոսանքին հակառակ: Վերին հոսքի տառադարձումները սկսվում են զգայական շղթայի վրա և մասամբ համընկնում են ծանոթագրված տեքստերի հետ: Կոնվերգենտ տեքստերը սկիզբ են առնում հակասենսային շղթայի վրա ծածկագրող գենային մարմնի 5′-կեսից: PAS- ի հետ կապված սղագրությունները սկիզբ են առնում դրա երկարության 3′-կեսից կամ ոչ ավելի, քան 20% -ից ներքև ՝ հակասենսային շղթայի վրա: Ստորին հոսքի տառադարձումները սկսվում են զգայական շղթայի գենի ներսում և շարունակվում են ծանոթագրված PAS- ից դուրս: Դիստալ հակազգայական տառադարձումները համընկնում են հակազգայական շղթայի ծանոթագրված գենի հետ, բայց սկսում են ավելի ներքև, քան գենի երկարության 20%-ը: Ի վերջո, եթե վերոնշյալ դասերից որևէ մեկի կողմից վերը նշված վերծանումը չի նկարագրվել, այն սահմանվել է որպես միջգենային տառադարձում: (Դ) (A) -ում նկարագրված դասարաններին պատկանող տառադարձումների թվի գծապատկերը: Araport11-ում հայտնի չկոդավորող տառադարձումները ցուցադրվում են վանդակավոր լրացման և նոր տառադարձության տեսքով, որը նույնականացվում է planNET-seq-ի կողմից՝ առանց լրացման:

Տարբերվող և կոնվերգենտ տառադարձման բնութագրում

PlaNET-seq- ի կողմից հայտնաբերված նոր տեքստերը հետագա բնութագրելու համար մենք սահմանեցինք տեքստեր, որոնք սկիզբ են առնում (0–500 bp) սպիտակուցը կոդավորող գենի TSS- ից, բայց հակառակ շղթայի վրա ՝ որպես տարաբնույթ ոչ կոդավորող սղագրություններ (Նկար 1C և 2 Ա) DNC-ն ներկայացնում է lncRNA տրանսկրիպցիայի կարևոր աղբյուր խմորիչի և մետազոների մեջ (16, 35–37), սակայն DNC-ի առկայությունը Արաբիդոպսիս հարցաքննվել է (38): plaNET-seq- ը DNC- ի համար ապացույցներ ներկայացրեց 917 սպիտակուցը ծածկագրող գեների վերաբերյալ, և DNC տառադարձման մեկնարկային վայրը (divTSS) ամենից հաճախ գտնվում էր կոդավորող TSS- ից 200–400 բ.փ հոսանքին հակառակ (Նկար 2 Բ): Այսպիսով, այս տվյալները հաստատում են բույսերի գենոմներում DNC- ի առկայությունը, չնայած խմորիչի կամ կաթնասունների համեմատ ավելի ցածր չափով: DNC- ի օրինակ է հայտնաբերվել At3g28140 լոկուսում (Նկար 2C): Ընդհանուր առմամբ, բույսերում DNC-ն առաջնորդող գեներն ավելի բարձր նորածին RNAPII տրանսկրիպցիա են ունեցել կոդավորման շղթայի վրա՝ համեմատած ոչ DNC գեների հետ (Նկար 2D), ինչը ցույց է տալիս, որ DNC-ը կապված է բարձր արտահայտված գեների նուկլեոսոմային սպառված շրջանների (NDRs) հետ: DNC-ի մետագենային վերլուծություններ՝ օգտագործելով TSS-seq տվյալները hua ուժեղացուցիչ 2-2 մուտանտ (հավ 2-2, միջուկային էկզոսոմի մուտանտ) (39) ցույց տվեց DNC- ի քայքայում միջուկային էկզոսոմի կողմից Արաբիդոպսիս (Նկար 2E), նման է խմորիչի և մետազոների ( 36, 40): DNC խթանողներն ունեին ավելի բարձր նուկլեոսոմային խտություն տարբերվող ոչ կոդավորող ուղղությամբ՝ համեմատած տրանսկրիպցիայի նմանատիպ մակարդակով գեների վերահսկիչ խմբի հետ (Լրացուցիչ նկար S3A): DNC- ի խթանողները ցուցադրեցին NDR- ներ `հստակ սահմանված կողային -1 և +1 նուկլեոզոմներով (Լրացուցիչ նկար S3B): Եզրափակելով, DNC տրանսկրիպցիան կիսում է կարգավորիչ սկզբունքները բողբոջող խմորիչի հետ (41), ասոցիացիա -1 նուկլեոսոմի բարձր սահմանման հետ և ճնշվում է համատրանսկրիպցիոն ՌՆԹ-ի քայքայմամբ (42):

Տարբեր տառադարձումը տեղի է ունենում բարձր ակտիվ NDR- ներում: (Ա) Տարբեր խթանողի սխեմատիկ նկարազարդում: Ընդհանուր NDR- ն շրջապատող նուկլեոսոմները սահմանվում են –1 (DNC ուղղություն) և +1 (կոդավորման ուղղություն): (Բ) Հիստոգրամը և միջուկի խտությունը բացարձակ հեռավորության սկզբնական վայրի միջև ՝ տարբերվող տառադարձման (divTSS) և ծածկագրող TSS- ի (bp) միջև: (Գ) Տարբեր խթանողի օրինակ (At3g28140): Nasագող RNAPII տառադարձումը ցուցադրվում է համապատասխանաբար իմաստային և տարաբնույթ տառատեսակների համար `համապատասխանաբար կապույտ և մանուշակագույն: (Դ) Սպիտակուցը կոդավորող գեների տառադարձման մակարդակի տուփի գծապատկեր՝ DNC-ով (մանուշակագույն) և առանց DNC-ի (մոխրագույն), որը չափվում է planNET-seq-ով: Տարբերությունների վիճակագրական նշանակությունը գնահատվել է երկկողմանի Mann-Whitney-ի կողմից U փորձարկում. (Է) TSS-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն DNC խթանիչների հակազգայական շղթայի վրա: Վայրի տիպի ազդանշանը ցուցադրվում է սև գույնով և միջուկային էկզոսոմային մուտանտ հավ 2–2 կարմիրով. DNC- ն կարող էր հայտնաբերվել TSS-seq տվյալների միջոցով, և DNC- ն թիրախավորվել էր միջուկային էկզոսոմի կողմից: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Դիվերգենտ տրանսկրիպցիան տեղի է ունենում բարձր ակտիվ NDR-ների դեպքում: (Ա) Տարբեր խթանողի սխեմատիկ նկարազարդում: Ընդհանուր NDR-ը շրջապատող նուկլեոսոմները սահմանվում են որպես –1 (DNC ուղղություն) և +1 (կոդավորման ուղղություն): (Բ) Հիստոգրամը և միջուկի խտությունը մեկնարկային տեղամասի միջև տարբերվող տառադարձման (divTSS) և կոդավորող TSS-ի (bp) միջև բացարձակ հեռավորության վրա: (Գ) Տարբեր խթանողի օրինակ (At3g28140): Նորածին RNAPII տառադարձումը ցուցադրվում է համապատասխանաբար կապույտ և մանուշակագույն գույներով իմաստային և տարբեր տառադարձումների համար: (Դ) Սպիտակուցը կոդավորող գեների տառադարձման մակարդակի տուփի գծապատկեր՝ DNC-ով (մանուշակագույն) և առանց DNC-ի (մոխրագույն), որը չափվում է planNET-seq-ով: Տարբերությունների վիճակագրական նշանակությունը գնահատվել է երկկողմանի Mann-Whitney-ի կողմից U փորձարկում. (Է) TSS-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն DNC խթանիչների հակազգայական շղթայի վրա: Վայրի տիպի ազդանշանը ցուցադրվում է սև գույնով և միջուկային էկզոսոմի մուտանտը հավ 2–2 կարմիրով. DNC-ը կարող էր հայտնաբերվել TSS-seq տվյալների միջոցով, և DNC-ն թիրախավորվեց միջուկային էկզոսոմի կողմից: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Բացի DNC-ից, groHMM-ը հայտնաբերել է 5313 նոր տառադարձումներ, որոնք համընկնում են մեկ ծանոթագրված գենի տառադարձման միավորի վրա ամբողջությամբ կամ մասնակիորեն հակասթափ շղթայի վրա (Նկար 3Ա): Մենք համարում էինք, որ նոր տեքստերը հակասենսագրություններ են, երբ դրանք կամ սկսվել են հյուրընկալող գենի ներքին կամ դրա երկարության 20% -ից ոչ ավելի (n = 4922): Մենք հայտնաբերեցինք գենային մարմնի երկայնքով նման հակազգայական տառադարձումների երկու արտոնյալ սկզբնակետեր (Նկար 3Ա): Գործարկման վայրի հաճախականության գերակշռող գագաթը հայտնաբերվել է գեների 3′ ծայրում, որը սահմանվում է որպես PAS- ի հետ կապված հակասենսագրություն (n = 3223): Երկրորդ գագաթը գտնվում էր գենային մարմնի առաջին 50% -ի սահմաններում, և մենք այդ տեքստերը սահմանեցինք որպես կոնվերգենտ հակասենսագրություններ (CAS n = 1699): Մարդկային բջիջներում (13, 19) CAS- եր են հայտնաբերվել, սակայն մինչ այժմ բույսերում դրանք բնութագրված չեն: Կոնվերգենտ տեքստերի (casTSS) TSS- ն առավել հաճախ սկսվում է 250 և 1000 bp միջև TSSs իմաստից (Լրացուցիչ նկար S4A) հեռավորության վրա, օրինակ ՝ At2g46710 գենով (Նկար 3 Բ): Հետաքրքիր է, որ castTSS-ները ցույց տվեցին ուժեղ կողմնակալություն դեպի վաղ էկզոն-ինտրոնի սահմանները, որոնց գագաթը շատ մոտ էր առաջին 5' միացման վայրին (5'SS, Նկար 3C): Բոլոր CAS- ի ավելի քան 50% -ը սկսվել է հյուրընկալող գենի առաջին էքսոնից կամ ինտրոնից (Լրացուցիչ նկար S4B): Ավելին, CAS կրող գեներն ունեին զգալիորեն ավելի երկար առաջին էկզոն և ինտրոն, ինչը ցույց է տալիս, որ հատուկ 5'-գենի կառուցվածքը փոխկապակցված է CAS արտահայտության հետ (Լրացուցիչ նկար S4B): Նուկլեոզոմների խտությունը casTSS- ի վերևում ցույց տվեց կտրուկ նվազում, ինչը ենթադրում է ներգենային NDR (Լրացուցիչ նկար S4C): Հետաքրքիր է, որ երբ մենք վերագրված քրոմատինի վիճակներ (34) նշանակեցինք նրանց մարմիններին Արաբիդոպսիս գեները և ուսումնասիրելով CAS տառադարձման սկիզբը, մենք հայտնաբերեցինք casTSS- ի չափից ավելի ներկայացուցչություն քրոմատինային վիճակներում, որոնք մենք նշեցինք որպես խթանող մինչև վաղաժամ երկարացում (լրացուցիչ նկար S4D և E): Սա ցույց տվեց, որ CAS- ի նախաձեռնման շրջանը համընկնում է այն վայրի հետ, որտեղ RNAPII համալիրները մտնում են արտադրական երկարաձգման մեջ: CAS- ի առաջացման գեներն ունեին ավելի բարձր զգայական շղթայի տառադարձում `համեմատած առանց հայտնաբերվող CAS- ի (Նկար 3D): Այս տվյալները ցույց են տվել, որ CAS- ը կապ ունի բարձր տառադարձված գեների ենթաբազմության հետ: Բացի այդ, TSS-seq տվյալների համեմատությունը վայրի տիպի Col-0 տնկիներում և հավ 2-2 մուտանտները ցույց տվեցին, որ CAS տեքստերը միջուկային էկզոսոմների թիրախներ են (Նկար 3 Ե): Այսպիսով, մենք բնութագրեցինք Արաբիդոպսիս CAS-ը որպես միջուկային էկզոսոմային թիրախներ, որոնք սկիզբ են առնում NDR-ից բարձր արտահայտված գեների պրոմոդեր-մոտակա միջակայքերում՝ երկար առաջին էկզոնով և ինտրոնով: Ընդհանուր առմամբ, մեր plaNET-seq տվյալները կարևորում են նորածին ՌՆԹ-ի հայտնաբերման մեթոդի ուժը `գաղտնագրված ոչ ծածկագրող տեքստերը բացահայտելու համար:

Կոնվերգենտ հակասական տառադարձումը սովորական հատկանիշ է Արաբիդոպսիս. (Ա) Հակասոգրաֆների սկիզբի տեղերի և իմաստային TSS- ի միջև հարաբերական հեռավորության հիստոգրամ (արտահայտված որպես զգայական գենի երկարության մասնաբաժին): Հակազգայական տրանսկրիպցիան սահմանվել է կամ որպես կոնվերգենտ (եթե սկսվել է զգայական գենի երկարության առաջին 50%-ի սահմաններում՝ կարմիր գծեր), կամ որպես PAS-ի հետ կապված (եթե սկսվել է զգայական գենի երկարության երկրորդ 50%-ում կամ PAS-ից հետո մինչև գենի երկարության 20% -ի հեռավորությունը գենի ավարտից հետո): (Բ) Կոնվերգենտ տառադարձման օրինակ (At2g46710): Nasագող RNAPII տառադարձումը ցուցադրվում է իմաստով և համապատասխանող տառատեսակների համար `համապատասխանաբար կապույտ և կարմիր: (Գ) castTSS-ի հարաբերական դիրքերի հիստոգրամ առաջին և երկրորդ 5' միացման տեղամասերի միջև (5'SS): (Դ) CAS- ով և առանց CAS- ի ծածկագրերի տառադարձման մակարդակի տեքստային գծապատկեր: Տարբերության վիճակագրական նշանակությունը չափվել է երկկողմանի Ման-Ուիթնիի կողմից U փորձարկում. CAS-ով գեներն ավելի բարձր տառադարձում են ցույց տվել իմաստային ուղղությամբ, քան այն գեները, որոնք չունեն CAS: (Է) TSS-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն հակազգայական շղթայի վրա 1 կբ պատուհաններում, որոնք խարսխված են castTSS-ում: Վայրի տիպի ազդանշանը ցուցադրվում է սև գույնով և միջուկային էկզոսոմի մուտանտը հավ 2–2 կարմիրով. Առնվազն որոշ CAS կարող են հայտնաբերվել TSS-seq տվյալների միջոցով, և դրանք թիրախավորվում են միջուկային էկզոսոմի կողմից: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Կոնվերգենտ հակասենսագրությունը սովորական հատկություն է Արաբիդոպսիս. (Ա) Անտիզգայական տառադարձումների մեկնարկային տեղամասերի և զգայական TSS-ի հարաբերական հեռավորության հիստոգրամ (արտահայտված որպես զգայական գենի երկարության մասնաբաժին): Հակասենսային տառադարձումը սահմանվում էր կամ որպես կոնվերգենտ (եթե նախաձեռնված էր զգայական գենի առաջին 50% -ի սահմաններում `կարմիր շերտեր), կամ որպես PAS- ի հետ կապված (եթե սկսված էր զգայական գենի երկարության երկրորդ 50% -ի սահմաններում կամ PAS- ից հետո մինչև գենի ավարտից հետո գենի երկարության 20%-ի հեռավորությունը): (Բ) Կոնվերգենտ տառադարձության օրինակ (At2g46710): Nasագող RNAPII տառադարձումը ցուցադրվում է իմաստով և համապատասխանող տառատեսակների համար `համապատասխանաբար կապույտ և կարմիր: (Գ) Առաջին և երկրորդ 5 ′ միացման տեղերի (5′SS) միջև casTSS- ի հարաբերական դիրքերի հիստոգրամ: (Դ) CAS-ով և առանց CAS-ի կոդավորման տառադարձումների տառադարձման մակարդակի տուփի գծապատկեր: Տարբերության վիճակագրական նշանակությունը չափվել է երկկողմանի Ման-Ուիթնիի կողմից U փորձարկում. CAS ունեցող գեները ցույց տվեցին ավելի բարձր տառադարձում իմաստային ուղղությամբ `համեմատած CAS- ի հետ: (Է) TSS-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն հակազգայական շղթայի վրա 1 կբ պատուհաններում, որոնք խարսխված են castTSS-ում: Վայրի տիպի ազդանշանը ցուցադրվում է սև գույնով և միջուկային էկզոսոմի մուտանտը հավ 2–2 կարմիրով. Առնվազն որոշ CAS կարող են հայտնաբերվել TSS-seq տվյալների միջոցով, և դրանք թիրախավորվում են միջուկային էկզոսոմի կողմից: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջին վստահության 95% միջակայք:

Ցածր ջերմաստիճանը հանգեցնում է նորածին RNAPII տառադարձման հիմնական վերածրագրավորման

Pticպտյալ տեքստերի գրավումից բացի, NET-seq- ը հարցաքննում է RNAPII տառադարձման դինամիկան `ծածկագրման և ոչ կոդավորման արտագրման միավորների վրա` բացահայտելով ցածր արագությամբ տառադարձման շրջաններ: Բույսերում ջերմաստիճանի և տրանսկրիպցիոն արդյունքի միջև կապը (3) մեզ ստիպում է ենթադրել, որ սառեցման ջերմաստիճանը կարող է կարգավորել նորածին RNAPII տրանսկրիպցիան այս շրջաններում: Հետևաբար, մենք տնկիներին ենթարկեցինք սառնամանիքի վաղ շրջանի (3 և 12 ժամ 4 ° C- ում, Նկար 4 Ա): Մեր պայմաններում բազմաթիվ սղագրություններ զգալիորեն փոխել են plaNET- հաջորդական ազդանշանը իրենց տառադարձման միավորների նկատմամբ (Նկար 4 Բ, Լրացուցիչ աղյուսակ S2): Դիֆերենցիալ կերպով տառադարձված հայտնի գեների թիվը 3 ժամում 4°C-ի դիմաց 22°C-ի դեպքում զգալիորեն գերազանցում էր նույն պայմաններում և նույնական անջատված արժեքներին, որոնք հայտնաբերված էին Տրանսկրիպցիայի սկզբի տեղամասի հաջորդականությամբ (TSS-seq) (2): Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ ՌՆԹ-ի տեսակների կայուն վիճակի մակարդակների հայտնաբերումը (այսինքն՝ TSS-seq-ով) ամբողջությամբ չի արտացոլում նորածին տառադարձման իրական փոփոխությունները 4°C-ի ազդեցության ժամանակ (Նկար 4C) (2): Զարմանալի է, որ հայտնի տառադարձումների 47%-ը և 50%-ը, որոնք վերկարգավորվել կամ իջեցվել են 3 ժամ հետո 4°C-ում, վերադարձել են ելակետային մակարդակներին 12 ժամ հետո 4°C-ում (Նկար 4D), ինչը ենթադրում է նորածին RNAPII տառադարձության անցողիկ վերածրագրավորում: Վեպի ոչ ծածկագրող տառատեսակների նորաստեղծ տառադարձումը նույնպես ազդել է սառը վերաբերմունքի վրա, ինչպես ցույց է տրված մետագենային սյուժեներում տարբերվող, կոնվերգենտ և PAS- ի հետ կապված հակասենսագրությունների համար (Նկար 4 Ե – Գ): Մենք հայտնաբերեցինք plaNET-seq ազդանշանի արագ նվազում 3 ժամ հետո 4 ° C- ում, որը վերադարձավ կամ մոտ էր վերահսկողության մակարդակին 12 ժամ հետո 4 ° C- ում: Այսպիսով, մեր արդյունքները հաստատում են այն հասկացությունը, որ բազմաթիվ ոչ ծածկագրող սղագրությունների տառադարձումը արագ արձագանքում է փոփոխվող միջավայրին (43): Միասին ՝ plaNET-seq- ը հայտնաբերեց գենոմի վրա կատարվող տառադարձման փոփոխություններ `կայուն վիճակի մեթոդների համեմատ աճող զգայունությամբ և բացահայտեց նորածին RNAPII տառադարձման հիմնական վերծրագրավորում` ի պատասխան ցրտահարության ջերմաստիճանի:

Ցածր ջերմաստիճանը հանգեցնում է նորածին RNAPII տառադարձման վերածրագրավորման: (Ա) Ցածր ջերմաստիճանի ազդեցության փորձարարական նախագծման նկարազարդում: Սածիլները աճեցվեցին 12 օր երկար լույսի ռեժիմով ագարի սալերի վրա: Ցածր ջերմաստիճանի ազդեցությունը կատարվել է 3 կամ 12 ժամ լուսային ժամերի ընթացքում, և նմուշները հավաքվել են և սառեցվել հեղուկ ազոտի մեջ: (Բ) Temperatureածր ջերմաստիճանի բուժման արդյունքում plaNET-seq- ի կողմից որոշված ​​տարբեր կերպ արտագրված գեների թիվը: (Գ) Վերև և ներքև կարգավորվող տառադարձումների քանակը 3 ժամ հետո 4°C-ում (համեմատ 22°C-ում աճեցված հսկողության հետ), ինչպես որոշվում է DESeq2-ով՝ օգտագործելով planNET-seq և TSS-seq տվյալները: PlanNET-seq-ի կողմից հայտնաբերված տառադարձման փոփոխությունները գերազանցում են TSS-seq-ի կողմից նույն անջատիչ արժեքներով հայտնաբերված փոփոխությունները: (Դ) Սխեմատիկ ժամանակային ընթացքը, թե քանի գեն, որոնք հայտնաբերվել են տարբեր կերպ տառադարձված 4°C-ում 3 ժամ հետո, վերադարձել են ելակետային արտահայտությանը 12 ժամում 4°C-ում: (E-G) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որի կենտրոնում կենտրոնացած է (Ե) divTSS, (F) casTSS և (G) PAS-AS TSS: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Lowածր ջերմաստիճանը հանգեցնում է նորածին RNAPII տառադարձման վերծրագրավորման: (Ա) Ցածր ջերմաստիճանի ազդեցության փորձարարական նախագծման նկարազարդում:Սածիլները աճեցվեցին 12 օր երկար լույսի ռեժիմով ագարի սալերի վրա: Ցածր ջերմաստիճանի ազդեցությունը կատարվել է 3 կամ 12 ժամ լուսային ժամերի ընթացքում, և նմուշները հավաքվել են և սառեցվել հեղուկ ազոտի մեջ: (Բ) Temperatureածր ջերմաստիճանի բուժման արդյունքում plaNET-seq- ի կողմից որոշված ​​տարբեր կերպ արտագրված գեների թիվը: (Գ) Վերև և ներքև կարգավորվող տառադարձումների քանակը 3 ժամ հետո 4°C-ում (համեմատ 22°C-ում աճեցված հսկողության հետ), ինչպես որոշվում է DESeq2-ով՝ օգտագործելով planNET-seq և TSS-seq տվյալները: PlanNET-seq-ի կողմից հայտնաբերված տառադարձման փոփոխությունները գերազանցում են TSS-seq-ի կողմից նույն անջատիչ արժեքներով հայտնաբերված փոփոխությունները: (Դ) Սխեմատիկ ժամանակային ընթացքը, թե քանի գեն, որոնք հայտնաբերվել են տարբեր կերպ տառադարձված 4°C-ում 3 ժամ հետո, վերադարձել են ելակետային արտահայտությանը 12 ժամում 4°C-ում: (E-G) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որի կենտրոնում կենտրոնացած է (Ե) divTSS, (F) casTSS և (G) PAS-AS TSS: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Էկզոնները և համատեքստային համակցումը ցածր ջերմաստիճանի դեպքում ներկայացնում են անցողիկ տառադարձային արգելքներ

Նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի վերածրագրավորումը՝ ի պատասխան սառեցնող ջերմաստիճանի, մեզ դրդեց ավելի մոտիկից նայել գենոմի կոդավորման շրջանների վրա ազդեցություններին: Էուկարիոտիկ գեները ունեն էզոն-ինտրոնային ճարտարապետություն, որտեղ ինտրոնները զուգահեռաբար արտատպվում են ՝ կազմելով ֆունկցիոնալ mRNA: Տրանսկրիպտիվ RNAPII համալիրի և սփլիկոսոմի մոտիկությունը հայտնաբերվում է NET-seq- ով (15, 21): Միացման միջանկյալ նյութերը կարող են հեշտությամբ հայտնաբերվել NET-seq տվյալների մեջ, մասնավորապես `5 ′ միացման վայրում (5′SS), որը պաշտպանված է համամաքրված սփլիսեոսոմով (Նկար 5 Ա), ինչպես նախկինում հաղորդվել էր մարդու NET-seq- ում (15): Այսպիսով, մենք զտեցինք այս ընթերցված դիրքերը մեր վերլուծության մեջ, քանի որ RNAPII-ի հետ կապված ՌՆԹ-ի 3'-ավարտվում է սպլայսոսոմի համատեղ մաքրման միջոցով, կարող է ճշգրիտ չտեղեկացնել նորածին RNAPII տառադարձման դիրքի մասին (15): Հետաքրքիր է, որ երբ մենք վերլուծում էինք 5′SS- ի մասնաբաժինը մեր ցածր ջերմաստիճանի ենթարկված plaNET-seq նմուշներում, մենք հայտնաբերում էինք 5′SS- ի ընթերցման ուժեղ նվազում 3 ժամ հետո 4 ° C- ում ՝ 22 ° C- ի համեմատ (Նկար 5 Բ և C, Լրացուցիչ Նկար S5A): Նվազումը վերադարձավ վերահսկման մակարդակին 12 ժամ հետո 4 ° C- ում, ինչը ենթադրում է, որ միացման ռեակցիայի կինետիկան սկզբում ազդել է ցածր ջերմաստիճանի վրա (Նկար 5 Բ): Ավելին, մենք հայտնաբերեցինք նորածին RNAPII արտագրման էկզոն-ինտրոն հարաբերակցության անցողիկ աճ 3 ժամ հետո 4°C-ում՝ համեմատած 22°C-ի և 12-ի 4°C-ի հետ (Նկար 5D): Այս տվյալները ցույց են տվել ժամանակավոր աճող նորածին RNAPII տրանսկրիպցիան էկզոնների նկատմամբ 4°C-ում: Հետևողականորեն, 3 ժամից հետո վերկարգավորված տառադարձություններից շատերը համեմատաբար երկար, բազմաէկզոնիկ գեներ էին՝ համեմատած ներքևակարգավորված գեների հետ, մինչդեռ հակադարձ կապ է հայտնաբերվել 4°C-ում 3 ժամից մինչև 12 ժամ արտահայտման փոփոխությունների համար (Լրացուցիչ նկար S5B և C):

Splicing-ի և ներգենային RNAPII-ի հապաղման ազդեցությունը: (Ա) RNAPII -spliceosome համալիրի պատկերացում ակտիվ արտագրման ընթացքում: Spliceosome- ը պաշտպանում է 5′SS- ը, իսկ միացման միջանկյալ նյութերը համամաքրվում են NET-seq- ում ՝ transcriptionally ներգրավված RNAPII համալիրով: (Բ) Ստուգիչ աղյուսակ `5′SS միջանկյալների տոկոսադրույքների մեջ, որոնք հայտնաբերվել են հսկողության և ցածր ջերմաստիճանի ենթարկված plaNET- հարևանությամբ կրկնօրինակների մեջ: (Գ) 5′SS տեսակների վրա սառեցման ջերմաստիճանի ազդեցությունը At3g11070 գենի վրա: (Դ) Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս planNET-seq-ի հարաբերակցությունը բոլոր էկզոններին և բոլոր ինտրոններին ցածր ջերմաստիճանի մշակման կրկնօրինակներում: (Է) PlaB բուժման արդյունավետության RT-qPCR վավերացում (ցուցադրվում է At2g39550 mRNA- ի միացման իրադարձության համար): Ձողերը ներկայացնում են երեք կենսաբանական կրկնօրինակների (շրջանների) միջին ± SEM: Տարբերությունների վիճակագրական նշանակությունը հաշվարկվել է երկկողմանի տ-փորձարկում. *Պ & lt 0.05, **Պ & lt 0.01: (Ֆ) PlaNET-seq- ը համամաքրում է միացման միջանկյալ նյութերը, հիմնականում `5′SS տեսակներ: PLB միացման արգելակիչի ազդեցությունը ցուցադրվում է At2g39550 գենի համար: (Գ) planNET-seq DMSO և plaB կրկնօրինակներում հայտնաբերված 5'SS միջանկյալների տոկոսի գծապատկեր: (Հ) Ներքին էքսոնների 3′-կեսի վրա նորածին RNAPII տառադարձման մետագենային վերլուծություն, ինչպես որոշվել է plaNET- հաջորդականությամբ: DMSO-ն ցուցադրվում է կապույտով, իսկ plaB-ը՝ կարմիրով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ես) Նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի մետագենային վերլուծություն ներքին էկզոնների 3'-կեսով, ինչպես որոշվում է pNET-seq-ով: Ser5P հակամարմինի տվյալները ներկայացված են սևով, Ser2P-ն կարմիրով, չֆոսֆորիլացված՝ մանուշակագույնով և Total RNAPII՝ կապույտով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ջ) նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի մետագենային վերլուծություն ներքին էկզոնների 3'-կեսով, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Կ) At1g01320 գենի ինտրոնի 2 -ի էկզոնիկ կանգառի օրինակ: Էկզոնիկ կասեցումը մեծանում է 3 ժամ հետո 4 ° C- ում `22 ° C- ի համեմատ:

Միացման և ներգանգային RNAPII կասեցման ազդեցությունը: (Ա) RNAPII -spliceosome համալիրի պատկերացում ակտիվ արտագրման ընթացքում: Spliceosome- ը պաշտպանում է 5′SS- ը, իսկ միացման միջանկյալ նյութերը համամաքրվում են NET-seq- ում ՝ transcriptionally ներգրավված RNAPII համալիրով: (Բ) Ստուգիչ աղյուսակ `5′SS միջանկյալների տոկոսադրույքների մեջ, որոնք հայտնաբերվել են հսկողության և ցածր ջերմաստիճանի ենթարկված plaNET- հարևանությամբ կրկնօրինակների մեջ: (Գ) Սառեցման ջերմաստիճանի ազդեցությունը 5'SS տեսակների վրա At3g11070 գենի համար: (Դ) Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս planNET-seq-ի հարաբերակցությունը բոլոր էկզոններին և բոլոր ինտրոններին ցածր ջերմաստիճանի մշակման կրկնօրինակներում: (Է) RT-qPCR plaB-ի բուժման արդյունավետության վավերացում (ցուցված է At2g39550 mRNA-ի միացման իրադարձության համար): Ձողերը ներկայացնում են երեք կենսաբանական կրկնօրինակների (շրջանների) միջին ± SEM: Տարբերությունների վիճակագրական նշանակությունը հաշվարկվել է երկկողմանի տ-փորձարկում. *Պ & lt 0.05, **Պ & lt 0.01: (Ֆ) PlaNET-seq- ը համամաքրում է միացման միջանկյալ նյութերը, հիմնականում `5′SS տեսակներ: Splicing inhibitor plaB-ի ազդեցությունը ցուցադրվում է At2g39550 գենի համար: (Գ) PlaNET-seq DMSO- ի և plaB- ի կրկնօրինակներում հայտնաբերված 5′SS միջանկյալ միջուկների տոկոսային գծապատկեր: (Հ) Ներքին էքսոնների 3′-կեսի վրա նորածին RNAPII տառադարձման մետագենային վերլուծություն, ինչպես որոշվել է plaNET- հաջորդականությամբ: DMSO- ն ցուցադրվում է կապույտ, իսկ plaB- ը ՝ կարմիր գույնով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ես) Նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի մետագենային վերլուծություն ներքին էկզոնների 3'-կեսով, ինչպես որոշվում է pNET-seq-ով: Ser5P հակամարմինի տվյալները ներկայացված են սևով, Ser2P-ն կարմիրով, չֆոսֆորիլացված՝ մանուշակագույնով և Total RNAPII՝ կապույտով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ջ) նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի մետագենային վերլուծություն ներքին էկզոնների 3'-կեսով, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Կ) At1g01320 գենի ինտրոնի 2 -ի էկզոնիկ կանգառի օրինակ: Էկզոնային հապաղումն ավելանում է 3 ժամ հետո 4°C-ում՝ 22°C-ի համեմատ:

Հիպոթեզը, որ միացման կինետիկան կարող է ժամանակավոր ազդել ցածր ջերմաստիճանի պատճառով, մեզ հուշեց ավելի սերտորեն ուսումնասիրել կապը զուգավորման և RNAPII տրանսկրիպցիայի միջև: Մենք կիրառեցինք զուգավորման ինհիբիտորները պլադիենոլիդ B (plaB) և հերբոքսիդին և հաստատեցինք դրանց ազդեցությունը զուգավորման զգայուն իրադարձությունների վրա (44, 45) RT-qPCR-ով (Նկար 5E, Լրացուցիչ նկար S6A): Հաջորդը, մենք տնկիները DMSO կամ plaB- ով բուժեցինք 6 ժամ և ստեղծեցինք plaNET-seq գրադարաններ: Մենք մեր plaB նմուշներում հայտնաբերեցինք գենոմի 5 decreaseS- ի ընթերցումների մեծ նվազում `համեմատած DMSO- ի նմուշների հետ, ինչը հաստատեց միացման ռեակցիայի հաջող արգելակումը (Նկար 5F և G, Լրացուցիչ նկար S6B): Մեր վերլուծությունը հայտնաբերեց միացման փոքր միջուկային ՌՆԹ-ներ, որոնք ներգրավված են միացման գործընթացում ՝ հաստատելով սփլիկոսոմի համամաքրումը RNAPII համալիրներով (Լրացուցիչ նկար S6C) ՝ համապատասխան ավելի վաղ զեկույցներին (15, 21): Ներքին էկզոնների մետագենային պրոֆիլները բացահայտեցին նորածին RNAPII տրանսկրիպցիան 5'SS-ի վերևում DMSO-ում plaB-ի համեմատ՝ աջակցելով զուգավորումից կախված RNAPII-ի դադարեցմանը մինչև էկզոնների վերջը (Նկար 5H, գծիկ տուփ): Այս էկզոնիկ RNAPII դադարեցումը տեսանելի էր նաև pNET-Seq-ի վերավերլուծված տվյալների մեջ (14), սակայն միայն սերին-5 ֆոսֆորիլացման (Ser5P) ուղու վրա, որը համապատասխանում է NRPB1 ֆոսֆորիլացված իր C-տերմինալ տիրույթի Ser5 դիրքում (Նկար 5I): . Սառը մշակման ենթարկված մեր նմուշներում մենք հայտնաբերեցինք բարձրացած գագաթը էքսոնների վերջում 3 ժամ 4 ° C- ից հետո `22 ° C- ի համեմատ (Նկար 5J և K, գծանշված տուփ): Պիկի բարձրության բարձրացումն անցողիկ էր և 12 ժամ հետո 4 ° C ջերմաստիճանում վերադարձվեց ելակետային մակարդակին: Ամփոփելով ՝ մեր վերլուծությունները աջակցում են ցածր ջերմաստիճանի ժամանակ նորածին RNAPII տառադարձման դինամիկ աճը ՝ էկզոնների վերջում: Այս տվյալները կարող են ցույց տալ, որ միացման ռեակցիայի կինետիկան անցողիկորեն նվազում է սառնասրտության պատասխանի ժամանակ:

Նոր ներգենային RNAPII-ի դադարեցման վայրի նույնականացում

Ինտրոններում, մեր plaB և DMSO նմուշների planNET-seq մետագենային պրոֆիլները բացահայտեցին նորածին RNAPII տառադարձման գագաթնակետը մոտ 5'SS (Նկար 6Ա): Ավելին, այս ինտրոնիկ գագաթը առավել հստակ տեսանելի է pNET-seq տվյալների Ser5P գծում (Լրացուցիչ նկար S7A): Մենք զանգահարեցինք գագաթային կոորդինատները յուրաքանչյուր ինտրոնի մեջ `օգտագործելով սահող պատուհանի մոտեցումը Ser5p pNET-seq տվյալների վրա: Հաջորդը, մենք հաշվեցինք «Intronic stalling index» (ISI) յուրաքանչյուր ինտրոնի համար: Ի վերջո, մենք բաժանեցինք ISI-ի վրա հիմնված ինտրոնները ուժեղ, միջին կամ թույլ դադար ունեցողների (ավելի մանրամասն տե՛ս Մեթոդներ): Արտահայտված ինտրոնների ISI-ն կարելի է գտնել Լրացուցիչ Աղյուսակ S4-ում: Ինտրոնիկ գագաթնակետը ամենից հաճախ դիտվել է 5'SS-ի ներքև 25 նտ-ում՝ անկախ ISI մակարդակից (Նկար 6B): Ինտրոնիկ գագաթի օրինակ կարելի է տեսնել At1g59870 ինտրոնի 2 -ի համար (Նկար 6C): ISI-ով ինտրոնների խմբավորումը ցույց տվեց, որ ավելի բարձր ISI միավորներ ունեցող ինտրոնները միջինում ավելի երկար էին, քան ցածր ISI-ի ինտրոնները (Լրացուցիչ նկար S7B): Այս խորաթափանցությունը մեզ ստիպեց վերադառնալ գեների `կոնվերգենտ հակասենսագրությամբ (CAS), որոնք ցույց են տալիս ավելի երկար առաջին ինտրոն` համեմատած հսկիչ գեների հետ: Իրոք, CAS ընդունող գեները ցույց տվեցին զգալիորեն ավելի բարձր ISI՝ համեմատած հսկիչ գեների հետ (Լրացուցիչ նկար S7C): Այսպիսով, կար հարաբերություն CAS- ի առկայության և զգայուն RNAPII- ի միջև, որը կանգ էր առնում CAS- ի ընդունող գեներում հայտնաբերված առաջին առաջին ինտրոնի մեջ: Հաջորդը, մենք շերտավորեցինք ինտրոնները `ըստ դրանց երկարության` ուսումնասիրելու համար ներքին գագաթնակետի այլ պոտենցիալ ազդեցությունները: Մենք կարճ ինտրոններում (60–250 բ n = 97 558), Լրացուցիչ նկար S7D): Այնուամենայնիվ, մենք հայտնաբերեցինք նուկլեոզոմների խտության գագաթներ ավելի երկար ինտրոններում (250–1000 բ. n = 15 991) ՝ առաջարկելով, որ դրանք ներառում էին մեկ կամ մի քանի փուլային նուկլեոզոմներ (Լրացուցիչ նկար S7D): Հաջորդը մենք պլանավորեցինք նորաստեղծ RNAPII տառադարձումը երկար ինտրոնների համեմատ `համեմատած կարճ ինտրոնների հսկողության հավաքածուի հետ (ստացվել է նույն գեներից` գենի արտահայտման մակարդակի որևէ ազդեցությունից խուսափելու համար): Մենք հայտնաբերեցինք ավելի բարձր planNET-seq ազդանշան ավելի երկար ինտրոնների վրա՝ ենթադրելով, որ երկար ինտրոններն ավելի դանդաղ են տառադարձվում՝ համեմատած կարճ ինտրոնիների հետ (Լրացուցիչ նկար S7E): Այսպիսով, նուկլեոսոմային արգելքները կարող են նպաստել տառադարձման արագության նվազմանը և ավելի երկար ինտրոնների plaNET-seq ազդանշանի բարձրացմանը: Հետաքրքիրն այն է, որ կարճ ինտրոններում ինտրոնիկ գագաթնակետը մեծապես անզգայուն էր plaB-ին (Նկար 6D), մինչդեռ երկար ինտրոններում կանգը զգայուն էր plaB-ի նկատմամբ (Նկար 6E): Նմանապես, սառը եղանակով մշակված մեր նմուշները ցույց տվեցին ինտրոնի գագաթնակետի փոքր ազդեցությունը կարճ ինտրոնների համար (Նկար 6F), բայց նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի մեծ աճ 3 ժամ հետո 4°C-ում, որը վերադարձավ վերահսկման մակարդակին 12 ժամ հետո 4°C ջերմաստիճանում: երկար ինտրոններ (Նկար 6G): Այս դիտարկումը հետագայում աջակցեց ցածր ջերմաստիճանի ազդեցությունից հետո միացման ռեակցիայի կինետիկայի ժամանակավոր նվազմանը: Ընդհանուր առմամբ, մեր plaB և սառը մշակված նմուշները տալիս են առանցքային տեղեկատվություն `տարբերելու plaNET-seq ազդանշանը, որը կախված է միացման արձագանքից ՝ անկախ զուգավորումից RNAPII գործունեության գագաթներից: Մեր տվյալները աջակցում են RNAPII- ի արգելափակման կայանը 25 nt բույսերի ինտրոնների մեջ: Այս գագաթնակետի զգայունությունը plaB-ի և ցածր ջերմաստիճանի նկատմամբ փոխկապակցված է ինտրոնի երկարության հետ՝ հավանաբար ցույց տալով RNAPII-ի հետ կապված հսկիչ կետը՝ երկար ինտրոնների միացման ճշգրտությունը բարելավելու համար: RNAPII գործունեության ներքին գագաթնակետը ներկայացնում է RNAPII- ի նոր գիծ, ​​որը փակվում է գենի տրանսկրիպցիայի ընթացքում, որը ներկայացնում է երրորդ կանգնեցման վայրը `բացի գենի սահմաններում դիրքերից:

Ինտրոնների մեջ նոր RNAPII կասեցման վայրի նույնականացում: (Ա) Centագող RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն բոլոր ինտրոններում, ինչպես որոշվել է plaNET- հաջորդականությամբ: DMSO- ն ցուցադրվում է կապույտ, իսկ plaB- ը ՝ կարմիր գույնով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Բ) Ներքին գագաթնակետի և 5′SS- ի միջև բացարձակ հեռավորությունների բաշխում: Ցուցադրվում են միայն FPKM-ով նորմալացված planNET-seq ծածկույթով 10-ից բարձր ինտրոններ: Intron- ի ուժեղ փակման ինդեքսով (ISI ≥ 5.5) կարմիրով, միջինում (3.5 & lt ISI & lt 5.5) սևով և թույլ (ISI ≤ 3.5) կապույտով: (Գ) Intron 2 գագաթի օրինակ, որը ցուցադրվում է ինտրոնի 2 -ի համար At1g59870 գենի մեջ: (Դ) Նորաստեղծ RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն կարճ ինտրոններով, ինչպես որոշվել է plaNET-seq- ով: DMSO-ն ցուցադրվում է կապույտով, իսկ plaB-ը՝ կարմիրով: Կտրված վանդակը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ վերջում կանգառի տեղը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Է) Մետագենի վերլուծություն նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի երկար ինտրոններում, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: DMSO-ն ցուցադրվում է կապույտով, իսկ plaB-ը՝ կարմիրով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ֆ) Նորաստեղծ RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն կարճ ինտրոններով, ինչպես որոշվել է plaNET-seq- ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Կտրված վանդակը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ վերջում կանգառի տեղը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Գ) Մետագենի վերլուծություն նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի երկար ինտրոններում, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Ինտրոնների մեջ նոր RNAPII կասեցման վայրի նույնականացում: (Ա) Centագող RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն բոլոր ինտրոններում, ինչպես որոշվել է plaNET- հաջորդականությամբ: DMSO- ն ցուցադրվում է կապույտ, իսկ plaB- ը ՝ կարմիր գույնով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Բ) Ներքին գագաթնակետի և 5′SS- ի միջև բացարձակ հեռավորությունների բաշխում: Fուցադրված են միայն 10-ից բարձր FPKM- ով նորմալացված plaNET-seq ծածկույթով ինտրոններ: Intron- ի ուժեղ փակման ինդեքսով (ISI ≥ 5.5) կարմիրով, միջինում (3.5 & lt ISI & lt 5.5) սևով և թույլ (ISI ≤ 3.5) կապույտով: (Գ) Intron 2 գագաթի օրինակ, որը ցուցադրվում է ինտրոնի 2 -ի համար At1g59870 գենի մեջ: (Դ) Նորաստեղծ RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն կարճ ինտրոններով, ինչպես որոշվել է plaNET-seq- ով: DMSO- ն ցուցադրվում է կապույտ, իսկ plaB- ը ՝ կարմիր գույնով: Կտրված վանդակը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ վերջում կանգառի տեղը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Է) Մետագենի վերլուծություն նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի երկար ինտրոններում, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: DMSO- ն ցուցադրվում է կապույտ, իսկ plaB- ը ՝ կարմիր գույնով: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Ֆ) Նորաստեղծ RNAPII տառադարձման մետագենի վերլուծություն կարճ ինտրոններով, ինչպես որոշվել է plaNET-seq- ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Գ) Մետագենի վերլուծություն նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի երկար ինտրոններում, ինչպես որոշվում է planNET-seq-ով: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Asեղքված տուփը ցույց է տալիս էկզոնների 3′ ծայրում կանգնեցման վայրը: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը:

Lowածր ջերմաստիճանը ազդում է խթանող-պրոքսիմալ RNAPII կանգառի վրա

Գենի սահմաններում RNAPII-ի դադարեցումը հետագայում ուսումնասիրելու համար մենք նախ կենտրոնացանք տրանսկրիպցիոն միավորների սկզբի վրա (այսինքն՝ խթանող-մոտակա դադար): plaNET-seq- ը գեների 5′ ծայրերում հայտնաբերեց ընթերցումների մեծ մասը, ինչը համահունչ է բույսերի և մետազոանների նախորդ ուսումնասիրություններին (5, 14) (Լրացուցիչ նկար S1C): Այնուամենայնիվ, մենք հստակ կապ չգտանք ծանոթագրված TSS դիրքի և զգայական շղթայի վրա ծագող RNA ազդանշանի առավելագույն խտության միջև (Լրացուցիչ նկար S8A և B): Ստուգելու համար, թե արդյոք գենոմային այլ հատկանիշները կարող են ավելի լավ համակցություն առաջարկել, մենք օգտագործեցինք նուկլեոզոմների դիրքավորման տվյալները (MNase-seq): Առաջին նուկլեոսոմի կենտրոնում խարսխված մետագենային սյուժեները բացահայտեցին ուժեղ կապ նորածին RNAPII տրանսկրիպցիայի գագաթնակետերի հետ (Նկար 7A, Լրացուցիչ Նկար S8C), ինչը ենթադրում է նուկլեոսոմի կողմից սահմանված պրոմոտորի մոտակա կանգառի մեխանիզմ: Արաբիդոպսիս. Մենք պարզեցինք, որ արտահայտված գեների 16.6% -ը (FPKM ≥ 1) ցույց է տվել, որ RNAPII- ը կանգ է առել խթանողի պրոքսիմալ շրջանում (Promoter-proximal Stalling Index ≥ 3, Supplementary Table S5):Մետագենի պրոֆիլները 0, 3 և 12 ժամ 4 ° C- ում ցույց են տվել, որ ցածր ջերմաստիճանը ազդել է RNAPII- ի կանգառի վրա առաջին (այսինքն ՝ +1) նուկլեոզոմում (Նկար 7 Ա): 3 ժամ 4 ° C- ում հանգեցրեց +1 նուկլեոզոմի կենտրոնի շուրջ գագաթնակետի ավելացման, ինչը վկայում է ավելի մեծ խթանող-մոտիկ կանգառի մասին: Ի հակադրություն, 12 ժամ 4 ° C նմուշները հանգեցրին թուլացման նվազմանը: Այս արդյունքները մեզ դրդեցին հետաքննել, արդյոք RNAPII- ի լողավազանները, որոնք զբաղվում են պրոմո-պրոքսիմալ փակմամբ, կարող են նպաստել ջերմաստիճանից կախված գենի կարգավորմանը: Մենք հաշվարկել ենք «Promoter – proximal stalling index» ՝ plaNET-seq տվյալներից (այսինքն ՝ հարաբերական ծագող RNAPII տառադարձում խթանողի պրոքսիմալ շրջանում գենի մարմնի համեմատ), ինչպես նկարագրված էր նախկինում (14): Տեքստերը, որոնք բարձրացվել են 3 ժամ հետո 4 ° C ջերմաստիճանում, ցույց են տվել զգալիորեն աճող կասեցման ինդեքսը մինչև ցածր ջերմաստիճանի բուժումը (22 ° C): Բացի այդ, 4 ° C ջերմաստիճանում 3 ժամ հետո նվազեցված արտագրությունները զգալիորեն նվազել են խթանողի մոտիկ կանգառները `չկարգավորվող սղագրությունների համեմատ (Նկար 7 Բ): Այս արդյունքներն աջակցում են RNAPII պրոմոութեր-մոտակա դադարի դերին՝ տրանսկրիպցիան ցածր ջերմաստիճանին հարմարեցնելու համար: Եզրափակելով ՝ plaNET-seq- ը բացահայտեց նուկլեոզոմով սահմանված խթանող-մոտավոր RNAPII կասեցման մեխանիզմը, որը կարող է հեշտացնել գենի արտահայտման ծրագրավորումը `ի պատասխան ջերմաստիճանի փոփոխությունների:

Ցածր ջերմաստիճանը ազդում է RNAPII-ի դադարեցման վրա գեների սահմաններում: (Ա) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որը խարսխված է +1 նուկլեոզոմի կենտրոնում: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Բ) Պրոմոութ -պրոքսիմալ կասեցման ինդեքսի տուփի գծապատկեր գեների վերահսկման պայմաններում (22 ° C), որոնք դիֆերենցիալ արտագրված են 3 ժ 4 ° C ջերմաստիճանում: Սևը նշանակում է անփոփոխ արտահայտություններով տառատեսակներ, կարմիրը `կանոնակարգված տառադարձումներ, իսկ կապույտը` նվազեցված կանոնագրեր: Վիճակագրական տարբերությունները գնահատվել են երկկողմանի Ման-Ուիթնիի կողմից U փորձարկում. (Գ) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որը խարսխված է PAS- ում: Սև գույնով պատկերված է 22°C, կապույտով` 3 ժ 4°C, բաց կապույտով` 12 ժ 4°C: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (ԴՎերին վահանակը պատկերում է ընթերցման հեռավորության սահմանումը, իսկ ներքևում ՝ 22 ° C (սև), 3 ժամ 4 ° C (կապույտ) և 12 ժամ 4 ° C (ընթերցման հեռավորության տուփի գծապատկեր): բաց կապույտ) նմուշներ: Վիճակագրական տարբերությունները գնահատվել են երկկողմանի Ման-Ուիթնիի կողմից U փորձարկում.

Ցածր ջերմաստիճանը ազդում է RNAPII-ի դադարեցման վրա գեների սահմաններում: (Ա) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որը խարսխված է +1 նուկլեոզոմի կենտրոնում: 22 ° C (հսկիչ նմուշ) ցուցադրվում է սև գույնով, 3 ժ 4 ° C ՝ կապույտ, 12 ժ 4 ° C ՝ բաց կապույտ: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Բ) Պրոմոութ -պրոքսիմալ կասեցման ինդեքսի տուփի գծապատկեր գեների վերահսկման պայմաններում (22 ° C), որոնք դիֆերենցիալ արտագրված են 3 ժ 4 ° C ջերմաստիճանում: Սևը նշանակում է անփոփոխ արտահայտություններով տառատեսակներ, կարմիրը `կանոնակարգված տառադարձումներ, իսկ կապույտը` նվազեցված կանոնագրեր: Վիճակագրական տարբերությունները գնահատվել են երկկողմանի Ման-Ուիթնիի կողմից U փորձարկում. (Գ) PlaNET-seq ազդանշանի մետագենային վերլուծություն 1 կբ պատուհանում, որը խարսխված է PAS- ում: 22 ° C- ը ցուցադրվում է սև գույնով, 3 h 4 ° C- ը `կապույտ, 12 h 4 ° C- ը` բաց կապույտ: Ստվերավորված տարածքը ցույց է տալիս միջինի 95% վստահության միջակայքը: (Դ) Վերին վահանակը ցույց է տալիս ընթերցման հեռավորության սահմանումը, մինչդեռ ներքևի վահանակը ցույց է տալիս 22°C (սև), 3 ժ 4°C (կապույտ) և 12 ժ 4°C (կապույտ) ջերմաստիճանի ընթերցման հեռավորության վանդակը (bp): բաց կապույտ) նմուշներ: Վիճակագրական տարբերությունները գնահատվել են երկկողմանի Mann-Whitney-ի կողմից U փորձարկում.

Ցածր ջերմաստիճանը ժամանակավոր նվազեցնում է 3'-վերջին առնչվող RNAPII-ի դադարեցումը և ընթերցման միջոցով տառադարձումը

Բացի խթանող-մոտիկ դիրքերից, RNAPII- ը կանգնած է 3′ ծայրերի մոտ Արաբիդոպսիս գեներ (14, 38, 46): Մենք հայտնաբերեցինք աճող ծագող RNAPII տառադարձում պոլի (Ա) տեղանքների (PAS) հոսանքն ի վար (Նկար 7C): Մենք գծագրեցինք միջին plaNET-seq ազդանշանը, որը խարսխված էր PAS կայքերում `ուսումնասիրելու ցածր ջերմաստիճանի ազդեցությունը PAS- ի հետ կապված RNAPII- ի կանգառի վրա: Ինչպես և սպասվում էր, նախքան բուժումը (22 ° C) և 12 ժամ հետո 4 ° C- ում վերցված նմուշները ցույց տվեցին, որ RNAPII- ը կանգ է առել PAS- ի հոսանքն ի վար (Նկար 7C): Զարմանալիորեն, RNAPII-ի գագաթնակետը, որը կանգ է առել PAS-ից ներքև, վերացվել է 3 ժամ հետո 4°C ջերմաստիճանում, ինչը ենթադրում է տառադարձման դինամիկայի լուրջ փոփոխություն՝ կապված դադարեցման հետ (Նկար 7C): RNAPII համալիրները տառադարձում են PAS- ից այն կողմ ՝ ներկայացնելով տառադարձման դադարեցման գոտին (նկար 7D, վերին վահանակ): Հսկողության պայմաններում (22 ° C) մենք հայտնաբերեցինք ընթերցման միջին հեռավորությունը ՝ 497 bp (Նկար 7D): Այս հեռավորությունը զգալիորեն կրճատվել է 3 ժամ 4°C-ում (միջինը՝ 462 bp, Նկար 7D): Այնուամենայնիվ, 12 ժ 4°C-ում մենք հայտնաբերեցինք մի փոքր ավելացած ընթերցման հեռավորություն (միջին 524 bp, Նկար 7D): Այսպիսով, RNAPII- ի գենոմի բաշխումը, ինչպիսին է PAS- ի հետ կապված կանգնեցումը և ընթերցման հեռավորությունը, անցողիկորեն փոխվել են ցածր ջերմաստիճանի պատճառով:


Մետաբոլիկ պատեհապաշտներ. Կերակրումը և ջերմաստիճանը ազդում են շնչառության արագության և ձևի վրա բարձր արկտիկական բրդյա թրթուռ թրթուրի gynaephora groenlandica (Lymantriidae)

Վ.Ա. Բենեթը, Օ. Կուկալը, Ռ.Է. Լի Մետաբոլիկ պատեհապաշտներ. Կերակրումը և ջերմաստիճանը ազդում են բարձր արկտիկական բրդյա արջուկի թրթուրի բարձրորակ թրթուրի (Lymantriidae) շնչառության արագության և ձևի վրա: J Exp Biol 1 հունվարի 1999 202 (1): 47–53. doi՝ https://doi.org/10.1242/jeb.202.1.47

Արկտիկական բրդե արջի թրթուրները՝ Gynaephora groenlandica, կարող էին արագ և կտրուկ ավելացնել շնչառության հաճախականությունը մինչև չորս անգամ կերակրվելուց հետո 12-24 ժամվա ընթացքում և ցույց տվեցին շնչառության նման նվազում՝ 60-85%՝ ընդամենը 12 ժամ սովի ժամանակ: Իրենց կերակրման սեզոնի գագաթնակետին թրթուրների շնչառության արագությունը նույնպես զգալիորեն ավելացել է 0,5-ից մինչև 22 °C ջերմաստիճանի դեպքում ինչպես սնված, այնպես էլ սովամահ թրթուրների համար (Q10=1-5): Դիապաուզիայի նշան է, որ ուշ սեզոնի թրթուրներն ունեին ճնշված շնչառության արագություն, որն ավելի քիչ զգայուն էր ջերմաստիճանի փոփոխությունների նկատմամբ (Q10 մոտ 1.5), մինչդեռ ձմեռային ձմեռ պտտած թրթուրների շնչառության մակարդակը նույնիսկ ավելի ցածր էր: G. groenlandica- ն, ըստ երևույթին, ցույց չի տալիս նյութափոխանակության նկատմամբ սառը հարմարվողականություն `համեմատած այլ չափավոր լիպիդոպտերային թրթուրների հետ: Սննդամթերքի սպառմանն ու ջերմաստիճանին ի պատասխան նյութափոխանակության արագությունը արագ կարգավորելու սեզոնային ունակությունը (որը կարող է բարձրացնել սնվելով) կարող է նպաստել էներգիայի արդյունավետ ձեռքբերմանը ամառային կարճատև (1 ամիս) աճման և կերակրման սեզոնի ընթացքում ՝ միաժամանակ պահպանելով էներգիան ՝ մտնելով դիապաուզա, երբ պայմաններն ավելի քիչ բարենպաստ են: Այս հարմարեցումները, իրենց երկար 15-20 տարվա կյանքի ցիկլով և սառեցման հանդուրժողականության պահպանմամբ ամբողջ տարվա ընթացքում, նպաստում են G. groenlandica-ի գոյատևմանը այս կոշտ բևեռային միջավայրում:


ՓՈԽԱԴՐՈԹՅԱՆ ԳՈՐՈՆԵՈԹՅՈՆՆԵՐԻ ԱՎԵԼԻ ԱՌԱՅՈԹՅՈՆԸ ԱՇԽԱՏԱՆՔԱՅԻՆ ՍՏՐԵՍԻ ՀԱՆԴԻՐՈԹՅԱՆ ԵՎ ՖՈՏՈՍԻՆԹԵISԻ ԲԱՐՁՐԱՈՄ

Հայտնի է, որ բույսերի հանդուրժողականությունը աբիոտիկ սթրեսների նկատմամբ բազմգեն հատկություն է: Այդ պատճառով, բույսերի բարելավումը `օգտագործելով գեները, որոնք դեր են խաղում աբիոտիկ սթրեսի արձագանքման մեջ, հաճախ անբավարար է սթրեսի հանդուրժողականությունը զգալիորեն բարելավելու համար: Դա հաղթահարելու համար սթրեսին արձագանքող մի քանի գեներ կարգավորող TF- ներ (օրինակ ՝ AP2/EREBP ընտանիքը) հաճախ օգտագործվել են բույսերը մանիպուլացնելու համար ՝ ավելի լայն արձագանք ունենալու համար: Սթրեսի հանդուրժողականության տեսանկյունից ստացված արդյունքները հաճախ շատ ավելի լավ են, քան չկարգավորող սպիտակուցը կոդավորող մեկ գենի օգտագործումը, և ֆոտոսինթեզի արդյունավետության կամ ֆոտոսինթետիկ սարքավորումների վրա նկատվող ազդեցությունները սովորաբար դրական են: Աղյուսակ 1-ը ցույց է տալիս TF-ների ցանկը, որոնք փոխակերպվում են տարբեր բույսերի և ապահովում սթրեսի հանդուրժողականության բարելավում` կապված բարելավված ֆոտոսինթետիկ պարամետրերի հետ: Այս արդյունքների մեկնաբանումը, այնուամենայնիվ, պետք է զգույշ լինի, քանի որ գնահատվում են ընդամենը մի քանի պարամետրեր, իսկ երբեմն էլ մեթոդները թույլ են: Բացի այդ, աբիոտիկ սթրեսի հանդուրժողականությունը հիմնականում գնահատվել է լաբորատոր պայմաններում և քիչ բան է հայտնի դաշտում անբարենպաստ պայմաններին բույսերի արձագանքման մասին:

Սթրեսի հետ կապված աբիոտիկ տրանսկրիպցիոն գործոնները, որոնք արտահայտված են տարբեր բույսերում, հաղորդում են սթրեսի հանդուրժողականություն և բարելավում ֆոտոսինթեզը

Չափազանց արտահայտված TF. TF ընտանիք. Տրանսգենային բույս. Սթրեսի հանդուրժողականություն: Ազդեցություն ֆոտոսինթեզի վրա սթրեսային պայմաններում: Հղում .
NtTsi1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ցածր կորուստ Այգի et al. (2001)
AtCBF1 AP2/EREBP Լոլիկ Սառնասրտություն PSII/քլորոֆիլի կուտակման առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Հսիյե et al. (2002բ)
AtCBF1 AP2/EREBP Բրինձ Սառը հանդուրժողականություն չկա Ոչ մի ազդեցություն PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության վրա Լի et al. (2004)
SHN AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտի հանդուրժողականություն և վերականգնում Կրճատված ստոմատիկ խտություն (հավանական նվազեցված տրանսպիրացիա) Ահարոնին et al. (2004)
BNCBF5 և BNCBF17 AP2/EREBP Brassica napusՍառեցում CO- ի ավելացում2 յուրացում/ֆոտոքիմիական արդյունավետության բարձրացում Սավիչ et al. (2005)
AtCBF3 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օհ et al. (2005)
CaPF1 AP2/EREBP Սոճին Օքսիդատիվ սթրես Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Թանգ et al. (2006)
TaERF1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Սյու et al. (2007)
JcERF AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԲարձր աղ/սառեցում Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Թանգ et al. (2007)
HvCBF4 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օհ et al. (2007)
NtOPBP1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ցածր կորուստ Գուո et al. (2004)
AtHRD AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ստորին ստոմատային հաղորդունակություն/ուժեղացված ֆոտոսինթեզի յուրացում և արդյունավետություն Կարաբա et al. (2007)
GhDREB1 AP2/EREBP Ծխախոտ Ցածր ջերմաստիճան Բարձրագույն քլորոֆիլի ֆլուորեսցենցիա/ավելի բարձր զուտ ֆոտոսինթեզման արագություն Շան et al. (2007)
AtABP9 bZIP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ/ջերմային ցնցում Ֆոտոսինթեզի կարողությունների բարելավում Չժան et al. (2008)
SNAC1 NAC Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ավելի դանդաղ է կորցնում ջուրը՝ փակելով ավելի շատ ստոմատային ծակոտիներ/ոչ մի ազդեցություն ֆոտոսինթեզի արագության վրա Հու et al. (2006)
AtNFXL1 NF-X1 ԱրաբիդոպսիսԱղի սթրես PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Լիսո et al. (2006)
AtNF-YB1 NF-Y (HAP) ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ Waterրի ներուժի և ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր ցուցանիշներ, քան վերահսկվողները Նելսոն et al. (2007)
ZmNF-YB2 NF-Y (HAP) Եգիպտացորեն Երաշտ Ավելի բարձր քլորոֆիլային ինդեքս, ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր արագություն և ավելի բարձր ստոմատիկ հաղորդունակություն Նելսոն et al. (2007)
GmSCOF-1 Գ2Հ2 ցինկ մատը Ծխախոտ Ցուրտ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի արագ վերականգնում Քիմ et al. (2001)
OsMYB4 MYB ԱրաբիդոպսիսՍառը/սառեցում Բարելավված PSII կայունություն: Ֆոտոինհիբիացիայի նկատմամբ հանդուրժողականություն Վանինին et al. (2004)
Չափից դուրս արտահայտված TF: TF ընտանիք. Տրանսգենային բույս. Սթրեսի հանդուրժողականություն: Ազդեցությունը ֆոտոսինթեզի վրա սթրեսային պայմաններում: Տեղեկանք.
NtTsi1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Այգի et al. (2001)
AtCBF1 AP2/EREBP Լոլիկ Սառեցնող PSII/քլորոֆիլի կուտակման առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Հսիյե et al. (2002բ)
AtCBF1 AP2/EREBP Բրինձ Սառը հանդուրժողականություն չկա Ոչ մի ազդեցություն PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության վրա Լի et al. (2004)
ՇՆ AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտի հանդուրժողականություն և վերականգնում Կրճատված ստոմատիկ խտություն (հավանական նվազեցված տրանսպիրացիա) Ահարոնի et al. (2004)
BNCBF5 և BNCBF17 AP2/EREBP Brassica napusՍառեցում CO- ի ավելացում2 յուրացում/ֆոտոքիմիական արդյունավետության բարձրացում Սավիչ et al. (2005)
AtCBF3 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օհ et al. (2005)
CaPF1 AP2/EREBP Սոճին Օքսիդատիվ սթրես Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Թանգ et al. (2006)
TaERF1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Ավելի բարձր քլորոֆիլ պարունակություն Սյու et al. (2007)
JcERF AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԲարձր աղ/սառեցում Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Թանգ et al. (2007)
HvCBF4 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/ բարձր աղ/ ցածր ջերմաստիճան PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օ՜ et al. (2007)
NtOPBP1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Գուո et al. (2004)
AtHRD AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ստոմատի ցածր հաղորդունակություն/ուժեղացված ֆոտոսինթեզի յուրացում և արդյունավետություն Կարաբա et al. (2007)
GhDREB1 AP2/EREBP Ծխախոտ Lowածր ջերմաստիճան Ավելի բարձր քլորոֆիլային ֆլուորեսցենտություն/ավելի բարձր զուտ ֆոտոսինթետիկ արագություն Շան et al. (2007)
AtABP9 bZIP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ/ջերմային ցնցում Ֆոտոսինթեզի կարողությունների բարելավում Չժան et al. (2008)
SNAC1 NAC Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ավելի դանդաղ է կորցնում ջուրը՝ փակելով ավելի շատ ստամոքսի ծակոտիները/ոչ մի ազդեցություն ֆոտոսինթեզի արագության վրա Հու et al. (2006)
AtNFXL1 NF-X1 ԱրաբիդոպսիսԱղի սթրես PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Լիսո et al. (2006)
AtNF-YB1 NF-Y (HAP) ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ Ջրի ներուժի և ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր արագություն, քան հսկիչները Նելսոն et al. (2007)
ZmNF-YB2 NF-Y (HAP) Եգիպտացորեն Երաշտ Ավելի բարձր քլորոֆիլային ինդեքս, ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր արագություն և ավելի բարձր ստոմատիկ հաղորդունակություն Նելսոն et al. (2007)
GmSCOF-1 Գ2Հ2 ցինկ մատը Ծխախոտ Ցուրտ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի արագ վերականգնում Քիմ et al. (2001)
OsMYB4 MYB ԱրաբիդոպսիսՍառը/սառեցում PSII կայունության բարելավում: Հանդուրժողականություն լուսանկարի նկատմամբ Վանինի et al. (2004)

Տարբեր բույսերում հաստատապես արտահայտված աբիոտիկ սթրեսի հետ կապված արտագրման գործոնները հաղորդում են սթրեսի հանդուրժողականություն և բարելավում ֆոտոսինթեզը

Չափից դուրս արտահայտված TF: TF ընտանիք: Տրանսգենային բույս. Սթրեսի հանդուրժողականություն: Ազդեցություն ֆոտոսինթեզի վրա սթրեսային պայմաններում: Տեղեկանք.
NtTsi1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Այգի et al. (2001)
AtCBF1 AP2/EREBP Լոլիկ Սառեցնող PSII/քլորոֆիլի կուտակման առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Հսիյե et al. (2002բ)
AtCBF1 AP2/EREBP Բրինձ Սառը հանդուրժողականություն չկա Ոչ մի ազդեցություն PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության վրա Լի et al. (2004)
SHN AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտի հանդուրժողականություն և վերականգնում Կրճատված ստոմատիկ խտություն (հավանական նվազեցված տրանսպիրացիա) Ահարոնին et al. (2004)
BNCBF5 և BNCBF17 AP2/EREBP Brassica napusՍառեցում CO- ի ավելացում2 յուրացում/ֆոտոքիմիական արդյունավետության բարձրացում Սավիչ et al. (2005)
AtCBF3 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օ՜ et al. (2005)
CaPF1 AP2/EREBP Սոճին Օքսիդատիվ սթրես Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Թանգ et al. (2006)
TaERF1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Ավելի բարձր քլորոֆիլ պարունակություն Սյու et al. (2007)
JcERF AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԲարձր աղ/սառեցում Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Թանգ et al. (2007)
HvCBF4 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/ բարձր աղ/ ցածր ջերմաստիճան PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օ՜ et al. (2007)
NtOPBP1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Գուո et al. (2004)
AtHRD AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ստոմատի ցածր հաղորդունակություն/ուժեղացված ֆոտոսինթեզի յուրացում և արդյունավետություն Կարաբա et al. (2007)
GhDREB1 AP2/EREBP Ծխախոտ Ցածր ջերմաստիճան Բարձրագույն քլորոֆիլի ֆլուորեսցենցիա/ավելի բարձր զուտ ֆոտոսինթեզման արագություն Շան et al. (2007)
AtABP9 bZIP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ/ջերմային ցնցում Ֆոտոսինթետիկ կարողությունների բարելավում Չժան et al. (2008)
SNAC1 NAC Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ավելի դանդաղ է կորցնում ջուրը՝ փակելով ավելի շատ ստամոքսի ծակոտիները/ոչ մի ազդեցություն ֆոտոսինթեզի արագության վրա Հու et al. (2006)
AtNFXL1 NF-X1 ԱրաբիդոպսիսԱղի սթրես PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Լիսոն et al. (2006)
AtNF-YB1 NF-Y (HAP) ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ Waterրի ներուժի և ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր ցուցանիշներ, քան վերահսկվողները Նելսոն et al. (2007)
ZmNF-YB2 NF-Y (HAP) Եգիպտացորեն Երաշտ Քլորոֆիլի ավելի բարձր ինդեքս, ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր արագություն և ավելի բարձր ստոմատիկ հաղորդունակություն Նելսոն et al. (2007)
GmSCOF-1 Գ2Հ2 ցինկի մատը Ծխախոտ Ցուրտ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի արագ վերականգնում Քիմ et al. (2001)
OsMYB4 MYB ԱրաբիդոպսիսՍառը/սառեցում PSII կայունության բարելավում: Հանդուրժողականություն լուսանկարի նկատմամբ Վանինին et al. (2004)
Չափից դուրս արտահայտված TF: TF ընտանիք. Տրանսգենային բույս: Սթրեսի հանդուրժողականություն. Ազդեցությունը ֆոտոսինթեզի վրա սթրեսային պայմաններում: Հղում .
NtTsi1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Այգի et al. (2001)
AtCBF1 AP2/EREBP Լոլիկ Սառնասրտություն PSII/քլորոֆիլային կուտակման առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Հսիյե et al. (2002բ)
AtCBF1 AP2/EREBP Բրինձ Սառը հանդուրժողականություն չկա Ոչ մի ազդեցություն PSII- ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության վրա Լի et al. (2004)
SHN AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտի հանդուրժողականություն և վերականգնում Կրճատված ստոմատիկ խտություն (հավանական նվազեցված տրանսպիրացիա) Ահարոնի et al. (2004)
BNCBF5 և BNCBF17 AP2/EREBP Brassica napusՍառեցում CO- ի ավելացում2 յուրացում/ֆոտոքիմիական արդյունավետության բարձրացում Սավիչ et al. (2005)
AtCBF3 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օհ et al. (2005)
CaPF1 AP2/EREBP Սոճին Օքսիդատիվ սթրես Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Թանգ et al. (2006)
TaERF1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Սյու et al. (2007)
JcERF AP2/EREBP ԱրաբիդոպսիսԲարձր աղ/սառեցում Քլորոֆիլի ավելի բարձր պարունակություն Թանգ et al. (2007)
HvCBF4 AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ/ցածր ջերմաստիճան PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Օ՜ et al. (2007)
NtOPBP1 AP2/EREBP Ծխախոտ Բարձր աղ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի փոքր կորուստ Գուո et al. (2004)
AtHRD AP2/EREBP Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ստորին ստոմատային հաղորդունակություն/ուժեղացված ֆոտոսինթեզի յուրացում և արդյունավետություն Կարաբա et al. (2007)
GhDREB1 AP2/EREBP Ծխախոտ Ցածր ջերմաստիճան Ավելի բարձր քլորոֆիլային ֆլուորեսցենտություն/ավելի բարձր զուտ ֆոտոսինթետիկ արագություն Շան et al. (2007)
AtABP9 bZIP ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ/ջերմային ցնցում Ֆոտոսինթետիկ կարողությունների բարելավում Չժան et al. (2008)
SNAC1 NAC Բրինձ Երաշտ/բարձր աղ Ավելի դանդաղ է կորցնում ջուրը՝ փակելով ավելի շատ ստամոքսի ծակոտիները/ոչ մի ազդեցություն ֆոտոսինթեզի արագության վրա Հու et al. (2006)
AtNFXL1 NF-X1 ԱրաբիդոպսիսԱղի սթրես PSII-ի առավելագույն քվանտային արդյունավետության բարելավում Լիսոն et al. (2006)
AtNF-YB1 NF-Y (HAP) ԱրաբիդոպսիսԵրաշտ Waterրի ներուժի և ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր ցուցանիշներ, քան վերահսկվողները Նելսոն et al. (2007)
ZmNF-YB2 NF-Y (HAP) Եգիպտացորեն Երաշտ Քլորոֆիլի ավելի բարձր ինդեքս, ֆոտոսինթեզի ավելի բարձր արագություն և ավելի բարձր ստոմատիկ հաղորդունակություն Նելսոն et al. (2007)
GmSCOF-1 Գ2Հ2 ցինկի մատը Ծխախոտ Ցուրտ Քլորոֆիլի պարունակության ավելի արագ վերականգնում Քիմ et al. (2001)
OsMYB4 MYB ԱրաբիդոպսիսՍառը/սառեցում PSII կայունության բարելավում: Հանդուրժողականություն լուսանկարի նկատմամբ Վանինին et al. (2004)

ՌՆԹ պոլիմերազով տրանսկրիպցիայի պիկոկալորիմետրիա

Ջերմային տատանումները կարող են կտրուկ ազդեցություն ունենալ ֆերմենտների արագության վրա: Ջերմաստիճանի ազդեցությունը ՌՆԹ պոլիմերազի վրա առանձնահատուկ հետաքրքրություն է ներկայացնում, քանի որ նրա տրանսկրիպցիոն ակտիվությունը կարգավորում է գեների արտահայտման ընդհանուր մակարդակները և, հետևաբար, կարող է դրսևորել պլեյոտրոպ ազդեցություն բջիջներում: Օգտագործելով հատուկ ձևափոխված օպտիկական որսման սարք, մենք օգտագործեցինք խիտ կենտրոնացված ինֆրակարմիր լազեր ՝ մեկ մոլեկուլները տաքացնելու համար Escherichia coli ՌՆԹ պոլիմերազը `տրանսկրիպցիոն գործունեությունը վերահսկելիս: Մենք գտանք էական փոփոխություն ջերմաստիճանի հետ տառադարձման երկարացման տեմպերում, որը համընկնում է ՌՆԹ -ի պոլիմերացման հետ կապված խտացման ռեակցիայի մեծ էնթալպիկ արգելքի հետ (∼13 կկալ/մոլ): Ի հակադրություն, մենք քիչ փոփոխություններ գտանք կամ ճանապարհից դուրս կանգնած վիճակների հաճախականության կամ կյանքի ընթացքում, ինչը ցույց է տալիս, որ տառադարձման դադարեցման էներգետիկ խոչընդոտը հիմնականում էնտրոպիկ է:

Ջոշուա Վ. Շաևիցի ներկայիս հասցեն է Կալիֆորնիայի համալսարանի ինտեգրացիոն կենսաբանության բաժինը, Բերքլի, CA 94720:


Ասպեկտ 3. Տվյալների հավաքագրման մեթոդի մշակում

Նյութեր:

  • Mauna Loa Supreme նույն չափի և զանգվածի տերևները։
  • Vernier թթվածնի ցուցիչ
  • Երմաչափ
  • Ապակե erlenmayer տափաշիշ
  • 100 մլ (±0,5 մլ) աստիճանավոր բալոն
  • Թեյնիկ
  • Նոթբուք
  • Դանակ
  • Մնացորդ
  • սառնարան

Մեթոդ

  1. Կտրեք նույն չափի և զանգվածի 6 տերեւ Մաունա Լոա Գերագույն. Չափել դրանց զանգվածը ՝ օգտագործելով Հաշվեկշիռ:
  2. Յուրաքանչյուր տերեւ լցրեք էրլենմայերի կոլբայի մեջ։

Նմուշի 10 0 C ջերմաստիճանի համար,

  • Տեղադրեք vernier թթվածնի տվիչը erlenmayer շշերից մեկի վրա և պարաֆիլմով ծածկեք vernier թթվածնի տվիչի և տուփի միջև ընկած գուլպաները `թթվածնի գազի կորուստը կանխելու համար:
  • Միացրեք vernier թթվածնի տվիչը ձեր նոութբուքին և պատրաստեք Logger Pro ծրագիրը ձեր նոութբուքում:
  • Չափել 100 մլ ծորակի ջուր աստիճանավորված գլանով: Չափել դրա ջերմաստիճանը: Նրա ջերմաստիճանը կլինի ավելի քան 10 0 C, այնպես որ սառեցրեք այն սառնարանով:
  • Youրի ջերմաստիճանը 10 0 C- ով չափելիս այն անմիջապես աղքատանում է ջրի լոգարանում:
  • Տեղադրեք erlenmayer ֆլեշը, որի մեջ տերևն է, իսկ թթվածնի զոնդը դրված է դրա վրա ջրային բաղնիքում:
  • Սկսեք Logger Pro ծրագրաշարը՝ ձեր տվյալները հավաքելու համար:
  • Կրկնեք նույն քայլերը մնացած 4 նմուշների համար:
  • Carefulգույշ եղեք դրա համար, եթե անհրաժեշտ է տաքացնել ծորակի ջուրը `նմուշի ակնկալվող ջերմաստիճանը ստանալու համար, ջուրը մի տաքացրեք ջրի քանակը չափելուց հետո, քանի որ ջուրը գոլորշիանում է, երբ այն տաքանում եք, և մի քանի ջուր թողնում է թեյնիկը որպես գազ: Նախքան ջրի քանակը չափելը, տաքացրեք շատ ջուր և տաքացնելուց հետո չափեք դրա ջերմաստիճանը:
  • Տաքացնելուց հետո, եթե ջերմաստիճանը ակնկալվող արժեքից բարձր է, չափեք 100 մլ ջուր աստիճանավոր բալոնով և թողեք, որ սառչի աստիճանավոր բալոնում: Մինչ այն սառչում է, տեղադրեք ջերմաչափը ջրի մեջ և սպասված արժեքը ստանալուն պես 100 մլ (,5 0,5 մլ) ջուր լցրեք ջրային բաղնիքում:
  • Heatingեռուցվելուց հետո, եթե ջրի ջերմաստիճանը սպասված արժեքից ցածր է, ավելի տաքացրեք այն և կրկնում եք քայլերը 10-բ.

Յուրաքանչյուր նմուշի համար առնվազն 3 փորձարկումներով տվյալներ հավաքելուց հետո, ավելի ճշգրիտ արդյունքներ ստանալու համար, Microsoft Office Excel-ի միջոցով պետք է հաշվարկվեն փորձարկումների միջին արժեքները յուրաքանչյուր նմուշի համար: Հաշվարկից հետո պետք է գտնել տոկոսային անորոշություններ և գծել թթվածնի գազի կոնցենտրացիայի համեմատ ջերմաստիճանի գրաֆիկը: Գրաֆիկը գծելիս գրաֆիկին պետք է ավելացնել սխալի շերտեր: Ի վերջո, պետք է եզրակացություն անել և որոշ այլընտրանքային լուծումներ գտնել մեթոդի թույլ կողմերի համար `տվյալների ճշգրտությունը բարձրացնելու համար:

Փորձի ավարտից հետո, լաբորատորիայի մաքրման ընթացքում, փորձի ժամանակ օգտագործված տերևները չպետք է աղբամանի մեջ դրվեն, քանի որ նրանք դեռ ողջ են:


Դիտեք տեսանյութը: A FEHÉRJESZINTÉZIS LÉNYEGE I. RÉSZ - TRANSZKRIPCIÓ (Հունվարի 2023).