Տեղեկատվություն

Ո՞րն է տարբերությունը ազատ քրոմոսոմի բեկորի և էքստրաքրոմոսոմային զանգվածի միջև:


Սա հղում է Յոխեմի և Հերմանի կողմից C. elegans-ի խճանկարային վերլուծության ակնարկին, որտեղ հեղինակները տարբերակում են ազատ քրոմոսոմային բեկորների և արտաքրոմոսոմային զանգվածների միջև:

Առաջինի համար նրանք հղում են անում Herman 1984-ին: Երկրորդի համար նրանք հղում են անում Lackner et al 1994-ին և Miller et al-ին 1996-ին, սակայն դրանք ուսումնասիրություններ են, որոնք օգտագործում են արտաքրոմոսոմային զանգվածներ, այլ ոչ թե փաստաթղթեր, որոնք դրանք սահմանում են որպես տեխնիկա, ինքնին:

Ինձ հետաքրքիր է իմանալ, թե որն է տարբերությունը. Ինձ մոտ այնպիսի տպավորություն է, որ արտաքրոմոսոմային զանգվածները են հատվածներ `հետաքրքրության գենի բազմաթիվ օրինակներով + նշիչ:


Ես հարցրեցի իմ պրոֆեսորին, և պատասխանը, ըստ երևույթին, տարբերություններ են ինչպես սերնդի, այնպես էլ վերջնական արտադրանքի մեջ:

Անվճար քրոմոսոմային բեկորները ստեղծվում են մեկ կենդանու ճառագայթման/սերմնահեղուկի այլ վնասների միջոցով: Մի շարք խաչմերուկների միջոցով հնարավոր է մուտանտ ֆոնի մեջ ներմուծել առանձին բեկորներ (որոնք պարունակում են ձեր հետաքրքրող գենի կրկնօրինակում, ինչպես նաև մարկեր): Էքստրակրոմոսոմային բեկորը կկորցնի միտոզի ընթացքում զարգացման տարբեր կետերում, և խճանկարային վերլուծության դեպքում կարող եք փնտրել ձեր նշիչի կորուստը (և, հետևաբար, վայրի տեսակի ալելի կորուստը), և տեսնել, թե արդյոք yfg արտադրանքը պահանջվում է որոշակի բջիջում: տեսակներ վայրի տեսակի ֆենոտիպի համար:

Էքստրաքրոմոսոմային զանգվածները ստեղծվում են կլոնավորման միջոցով, և դուք սովորաբար ունենում եք ինչպես գենի, այնպես էլ մարկերի բազմաթիվ պատճեններ: Դա նույն սկզբունքն է, ինչ ազատ քրոմոսոմային բեկորները՝ խճանկարային վերլուծության առումով, բայց շատ հզոր է, քանի որ դուք հեշտությամբ կարող եք կլոնավորել առանձին գեներ (ի հակառակ ճառագայթահարման և հույս ունենալով հայտնաբերել yfg հատվածի վրա) և մարկերներ (և այժմ կարող եք օգտագործել ոչ էնդոգեն մարկերներ։ ինչպես GFP):

Թեև արտաքրոմոսոմային զանգվածները համեմատաբար ավելի հեշտ են ստեղծվում, խնդիրն այն է, որ դուք ստանում եք գենի բազմաթիվ պատճեններ, ինչը հանգեցնում է ոչ էնդոգեն դեղաչափերի մակարդակի: Նույնիսկ եթե դա բջիջներում բոլորովին այլ մուտանտ ֆենոտիպ չի առաջացնում, հնարավոր է, որ այդ սպիտակուցներից բավականաչափ կարող են բաժանվել դիսյակ բջիջների մեջ միտոզով, այնպես որ, եթե նույնիսկ հատվածը կորչի, դուք դեռ կարող եք ունենալ ձեր գենային արտադրանքը: դուստր բջիջներում (եթե ձեր մարկերային սպիտակուցը նույնպես առանձնացված չլիներ այսպես, կարող եք սխալ եզրակացություններ անել այդ հատուկ բջիջներում yfg արտադրանքի անհրաժեշտության վերաբերյալ):


Քրոմոսոմային հաջորդականության մոտիվների նույնականացում, որոնք միջնորդում են մեիոտիկ զուգավորում և սինապսիա C. էլեգանս

Caenorhabditis elegans քրոմոսոմները պարունակում են մասնագիտացված շրջաններ, որոնք կոչվում են զուգավորման կենտրոններ, որոնք միջնորդում են միոլոգիայի զուգահեռ զուգավորումն ու սինապսիան: Չորս հարակից սպիտակուցներ ՝ ZIM-1, 2, 3 և HIM-8, կապվում են այդ տեղամասերի հետ և պահանջվում են դրանց հիմնական գործառույթների համար: Այստեղ մենք ցույց ենք տալիս, որ համապատասխան քրոմոսոմային շրջաններում հարստացված կարճ հաջորդականության տարրերը ընտրովի կերպով հավաքագրում են այդ սպիտակուցները in vivo. Արհեստական ​​պայմաններում SELEX-ի օգտագործմամբ վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ յուրաքանչյուր սպիտակուցի կապակցման առանձնահատկությունն առաջանում է երկու ցինկի մատների և հարակից տիրույթի համակցությունից: Հավաքագրման մոտիվների կլաստերի տեղադրումը քրոմոսոմի մեջ, որը զուրկ է իր էնդոգեն զուգավորման կենտրոնից, բավական է վերականգնել համասեռ զուգավորումը, սինապսիան, խաչաձև ռեկոմբինացիան և տարանջատումը: Այս բացահայտումները օգնում են պարզել, թե ինչպես են քրոմոսոմային տեղամասերը միջնորդում մեյոտիկ քրոմոսոմային դինամիկայի էական կողմերը:


Արդյունքները

SDC սպիտակուցները գործում են որպես ճնշում `ճնշելու համար in vivoնրա -1 եւ X քրոմոսոմներ

Ինչպե՞ս է SDC-2- ը խտրականություն դնում տարբեր թիրախների միջև և ճնշում դրանք տարբեր աստիճանի: Այս հարցին պատասխանելու համար մենք նախ հայտնաբերեցինք սպիտակուցներ, որոնք գործում են SDC-2-ով նրան-1. sdc-2 հայտնի էր, որ գենետիկորեն փոխազդեցության մեջ էր sdc-1 եւ sdc-3 սեռի որոշման և դեղաչափի փոխհատուցման իրականացման համար XXկենդանիներ (Villeneuve and Meyer 1990 Davis and Meyer 1997 Dawes et al. 1999), սակայն SDC-1-ի և SDC-3-ի ճշգրիտ մոլեկուլային դերերը չեն հասկացվել: Այստեղ մենք ներկայացնում ենք ապացույցների երեք տող, որ SDC- ի երեք սպիտակուցները in vivo- ն ճնշելու համար բարդույթ են կազմում նրա -1 եւX քրոմոսոմները ուղղակիորեն:

Նախ, SDC-1, SDC-2 և SDC-3 բոլորը համակողմանի են X քրոմոսոմներ և դեպի նրա -1 կարգավորող շրջանները in vivo. Հերմաֆրոդիտները, որոնք կրում են բազմաթիվ տանդեմ պատճեններ նրա -1 GFP մակնշմամբ էքստրաքրոմոսոմային զանգվածների վրա կարգավորվող շրջանները ներկված են համակցվածությամբ մաքրված SDC հակամարմիններով (տես Նյութեր և մեթոդներ): SDC սպիտակուցի տեղայնացումը գնահատվել է մեծահասակների աղիքային միջուկներում, որոնց մեծ չափերը և պոլիպլոիդ ԴՆԹ -ի պարունակությունը հեշտացնում են հետազոտությունը: Բարձր լիցքավորված SDC-2 սպիտակուցը, որը կրում է ոլորված-կծիկ մոտիվ, տեղայնացված է X քրոմոսոմներ և նրա -1 զանգվածներ մեծահասակների աղիքային բջիջներում (նկ. 1 Ա), ինչպես ցույց է տրված նախկինում սաղմերում (Dawes et al. 1999), դրանով իսկ հաստատելով անալիզը: SDC-1 և SDC-3 (Nonet and Meyer 1991 Klein and Meyer 1993) ցինկի մատների սպիտակուցները համակցված են SDC-2- ի հետ նրա -1 և շարունակ X քրոմոսոմներ (նկ. 1A,B), որոնք համապատասխանում են այս սպիտակուցների անմիջական դերին նրան-1ռեպրեսիա և դեղաչափի փոխհատուցում: Մեջ XX անասուն կրող կենդանիներsdc-3(Tra) մուտացիա, SDC-1, SDC-2 և SDC-3-ի տեղայնացում դեպի նրա -1 զգալիորեն կրճատվել է, բայց տեղայնացումը դեպիX քրոմոսոմը հայտնվեց անփոփոխ (նկ. 1F տվյալները ցույց չեն տրված), որը համընկնում է մուտացիայի հետ, որը խաթարում է սեռի որոշումը, բայց ոչ դեղաչափի փոխհատուցումը (DeLong et al. 1993): sdc-3(Tra) depresspressնրա -1 տառադարձումը՝ առաջացնելով 100%-ով XX կենդանիները պետք է խստորեն առնականացվեն `խափանելով SDC-3- ում ATP- ի հետ կապված ենթադրյալ մոտիվը (DeLong et al. 1993 Klein and Meyer 1993): Հետևաբար, SDC-1-ը, SDC-2-ը և SDC-3-ը տեղայնացված են պատշաճ կերպով՝ հասնելու ինչպես գենային հատուկ, այնպես էլ քրոմոսոմային ռեպրեսիայի:

The X-քրոմոսոմային դեղաչափերի փոխհատուցման մեքենաները տեղայնացված են այնտեղ նրա -1 կարգավորող շրջաններ in vivo. Առանձին աղիքային միջուկի համակցված պատկերներ (ԱՖ) կամ սաղմնային միջուկ (Գ, Հ) վայրի տիպից կամ մուտանտից [sdc-3(Տրա) կամ dpy-27] XX SDC, DPY կամ MIX հակամարմիններով իմունոստատավորված կենդանիներ, ինչպես նշված է յուրաքանչյուր վահանակում: Միջուկները պարունակում են արտաքրոմոսոմային ԴՆԹ զանգվածներ, որոնք կրում են դրանց մի քանի օրինակ նրա -1 կարգավորիչ շրջաններ (նկ. 3A պլազմիդ pHD25),լակ օպերատորը կրկնում է (lacO), և տրանսգեն, որը կոդավորում է LacI-GFP միաձուլման սպիտակուցը: LacI – GFP ռեպրեսորը պարտադիր էlacO թույլ է տալիս զանգվածի հայտնաբերումը GFP ավտոֆլյորեսցենտով: Համագոյացում (դեղին) զանգվածների (կանաչ) և հակամարմինների (կարմիր) միջև միաձուլված պատկերներում (ճիշտ վահանակներ) ցույց տվեցին սպիտակուցի կապը դրա հետ նրան-1 կարգավորիչ հաջորդականություններ: Սլաքների ծայրերը նշում ենX քրոմոսոմներ: Համահունչ sdc-3(Tra) առաջացնելով դեպրեսիա նրա -1, այն արգելափակում է SDC և DPY սպիտակուցների հետ կապը նրան-1.

Երկրորդ, SDC սպիտակուցները ֆիզիկապես փոխազդում են՝ կազմելով բարդույթ: SDC- ի սպիտակուցներից որևէ մեկի հակամարմինները զուգահեռաբար տեղացել են վայրի սաղմնային քաղվածքներից ստացված բոլոր երեք SDC սպիտակուցները (նկ. 2 Բ): Տեղումների այս ռեակցիաները հատուկ էին, քանի որ նախաիմունային շիճուկներից ոչ մեկը չի տեղակայել SDC սպիտակուցներից որևէ մեկը (նկ. 2 Բ), և SDC- ի հակամարմիններից ոչ մեկը չի նստել (տվյալները ցույց չեն տրված) կամ նույնականացվել (նկ. 2 Ա) նրանց հարակից սպիտակուցները քաղվածքների քաղվածքներից: համապատասխան sdc զրոյական մուտանտներ.

SDC սպիտակուցները կազմում են համալիր in vivo: (Ա) Սաղմնային քաղվածքներում SDC սպիտակուցների հայտնաբերում: Վայրի տիպի (N2) քաղվածքների արևմտյան բլոտներ կամ sdc (զրո) մուտանտ սաղմեր, որոնք կրում են ջնջում կամ անհեթեթ մուտացիա sdc գենը հետազոտվել է ձախ կողմում նշված SDC հակամարմինով: 250 kD, 240 kD (կրկնակի) և 140 kD սպիտակուցներ հայտնաբերվել են SDC-2, SDC-3 կամ SDC-1 հակամարմիններով, համապատասխանաբար, վայրի տիպի, բայց ոչ sdc (զրո) քաղվածքներ, որոնք ցույց են տալիս հակամարմինների յուրահատկությունը: (Բ) Ցանկացած մեկ SDC սպիտակուցի նկատմամբ հակամարմինները համակեցված են բոլոր երեք SDC սպիտակուցներին: SDC- ի յուրաքանչյուր հակամարմինով զուգահեռաբար տեղումներ են կատարվել վայրի սաղմնային քաղվածքների վրա: Համաիմունաթափվող նյութը առանձնացվել է SDS-PAGE- ով և իմունոբլոտացվել ձախում նշված հակամարմինով: (PI) Նախամիմուն շիճուկներ SDC-1 հակամարմինների համար, (IP) իմունոպրեպրիտացիա:

Երրորդ, SDC համալիրը ճնշում է արտագրումը նրան-1, քանի որ ներսում SDC սպիտակուցների արտարգանդային արտադրությունը XO կենդանիները (սովորաբար տղամարդիկ) առաջացրել են հերմաֆրոդիտ սեռական զարգացում: SDC-2-ը սովորաբար արտահայտվում է միայն XX կենդանիներ, իսկ SDC-2- ի արտարգանդային արտահայտությունը փոխակերպեց դրանց 36% -ը XO կենդանիները դառնում են հերմաֆրոդիտներ (Dawes et al. 1999), սեռական փոխակերպում, որը պահանջում էր վայրի տեսակsdc-3 գործունեությունը: Հաշվի առնելով միայն SDC-2- ի ոչ լիարժեք ֆեմինիզացիան, մենք միաժամանակ գերարտահայտեցինք SDC-2- ը կամ SDC-1- ով կամ SDC-3- ով `գնահատելու նրանց համատեղ ներդրումը հերմաֆրոդիտների զարգացման գործում: Միայն SDC-1 (տվյալները ցուցադրված չեն) կամ SDC-3 (Դևիս ​​և Մեյեր 1997) գերարտահայտումը չհաջողվեց կանացիացնել XO կենդանիներ: Այնուամենայնիվ, ինչպես SDC-2- ի, այնպես էլ SDC-1- ի գերարտահայտումը մեծապես բարձրացրեց XOկանացիացում՝ առաջացնելով դրանց ~88%-ը XO սեռական կերպարանափոխության ենթարկվող կենդանիներ (աղյուսակ 1): Գրեթե բոլորը ինքնաբերաբար էին, ի տարբերություն կերպարանափոխվածների XO կենդանիներ, որոնք արտահայտել են միայն SDC-2: SDC-3 մակարդակի բարձրացում XOկենդանիները, ինչպես հաստատվել է հակամարմինների ներկման միջոցով, չեն ուժեղացրել SDC-2-ով առաջացած կանացիացումը (31% կանացիացում երկու սպիտակուցներով), ինչը ցույց է տալիս, որ SDC-3-ը սահմանափակող չէ (Աղյուսակ 1): SDC-1- ի և SDC-2- ի սիներգիան կանացիացման մեջ XO կենդանիները SDC-3-ից կախված ձևով ապահովում են ֆունկցիոնալ ապացույցներ, որ բոլոր երեք SDC սպիտակուցները գործում են միասին՝ ճնշելու համար նրա -1 ուղղակիորեն։

sdc-1 ուժեղացնում է sdc-2 իգականացման մեջXO կենդանիներ

SDC սպիտակուցները հավաքագրում են X-քրոմոսոմային դեղաչափի փոխհատուցման համալիր դեպի նրան-1

Քանի որ SDC-2 և SDC-3- ն առանցքային դեր են խաղում դեղաչափերի փոխհատուցման համալիրը հավաքելիս X քրոմոսոմներ (Chuang et al. 1996 Davis and Meyer 1997 Dawes et al. 1999), մենք հարցրինք, թե արդյոք SDC սպիտակուցները հավաքագրում են այս համալիրը նրան-1. Դոզայի փոխհատուցման համալիրը ներառում է դեղաչափի փոխհատուցման հատուկ սպիտակուց DPY-27 և երկֆունկցիոնալ սպիտակուցներ DPY-26 և MIX-1, որոնք նույնպես գործում են համապատասխանաբար մեիոզի և միտոզի դեպքում (Chuang et al. 1996 Lieb et al. 1996, 1998 ) Դոզայի փոխհատուցման սպիտակուցները նման են լայնորեն պահպանված կոնդենսինային համալիրի բաղադրիչներին, որոնք առաջացնում են միտոտիկ քրոմոսոմների խտացում in vitro, ինչը ենթադրում է, որ կարգավորում էX-քրոմոսոմային արտահայտությունը ներառում է քրոմատինի կառուցվածքի մոդուլյացիա (Կոշլանդ և Ստրուննիկով 1996 թ. Հիրանո 2000): Բոլոր դեղաչափերի փոխհատուցման սպիտակուցները, բացառությամբ SDC-2- ի, պահանջում են SDC-3 դրանց տեղայնացման համար X քրոմոսոմը (Chuang et al. 1996 Davis and Meyer 1997), իսկ SDC-3-ը, իր հերթին, պահանջում է SDC-2՝ դրա տեղայնացման համարX քրոմոսոմ (Davis and Meyer 1997): SDC-2- ը կարող է տեղայնացվել դեպիX քրոմոսոմ առանց այլ չափաբաժնի փոխհատուցման սպիտակուցների (Dawes et al. 1999), ինչը ենթադրում է, որ այն ճանաչում է X քրոմոսոմը և քրոմոսոմի առանձնահատկությունը տալիս է դեղաչափի փոխհատուցմանը: Դեղաչափի փոխհատուցման ոչ բոլոր բաղադրիչներն են էական թվում նրա -1ռեպրեսիա, քանի որ հազվադեպ dpy-26, dpy-27, կամdpy-28 XX մուտանտները, որոնք խուսափում են մահաբերությունից, զարգանում են որպես հերմաֆրոդիտներ (Plenefisch et al. 1989): Հետևաբար, դեղաչափի ամբողջական փոխհատուցման մեխանիզմի հայտնաբերումը նրա -1 ցույց կտա, որ SDC-2-ը թիրախավորում է այս մեքենան այն քրոմատինին, որը կապում է:

DPY-26, DPY-27 և MIX-1 բոլորը համակցված են SDC սպիտակուցներով երկուսի վրանրա -1 զանգվածներ և X քրոմոսոմներ (նկ. 1C–E): Ավելին, երեք դեղաչափերի փոխհատուցման սպիտակուցների տեղայնացումը դեպինրա -1 կախված էր SDC սպիտակուցներից, քանի որsdc-3(Tra) մուտացիան խաթարեց տեղայնացումը դեպինրա -1 բայց ոչ դեպի X քրոմոսոմ (նկ. 1F տվյալները ցույց չեն տրված): SDC-2-ի և SDC-3-ի տեղայնացումը կախված չէր DPY-27-ից (Նկար 1G), սակայն DPY-26-ը պահանջում էր DPY-27, որպեսզի դրա տեղայնացումընրա -1 (Նկար 1H), ինչպես դա անում է դրա տեղայնացման համարX քրոմոսոմ Այսպիսով, հայտնի դեղաչափերի փոխհատուցման բաղադրիչների հավաքումը վրա նրա -1 նման է նրանց հավաքման վրաX քրոմոսոմ Ավելին, SDC-2- ը հավաքագրում է դեղաչափի փոխհատուցման մեքենան իր քրոմատինի թիրախներին, չնայած որոշ բաղադրիչներ կարող են անհասանելի լինել ճնշման համար:

SDC/դոզան փոխհատուցման համալիրը կապված է երեք տարբեր քրոմատինային թիրախների հետ նրա -1

Մենք որոշեցինք ճշգրիտ վայրերը ներսում նրա -1 որոնք հավաքագրում են դեղաչափերի փոխհատուցման մեքենա: Օգտագործելով էքստրաքրոմոսոմային զանգվածի անալիզը՝ 1-կբ-ով առանձին բեկորներ ուսումնասիրելու համար նրա -1, մենք գտանք, որ SDC-1, SDC-2, SDC-3, DPY-26, DPY-27 և MIX-1 բոլորը համախմբված են երեք տարբեր շրջաններով, որոնք սահմանված են B, C և D բեկորներով (նկ.3A,B) . Բոլոր սպիտակուցների տեղայնացումը խաթարվել է ան sdc-3(Տրա) մուտացիա (տվյալները չեն ցուցադրվում) ՝ ցույց տալով, որ կապումը հատուկ էր:

SDC-2 տեղայնացում դեպի նրան-1 նշվում է ԴՆԹ-ի ճանաչման երեք տարբեր տարրերով, որոնց կապող կարողությունը խաթարվում է հատուկ մուտացիաների պատճառով: (Ա) Սխեմաննրա -1 գեն և ենթածաշրջանների ամփոփում, որոնք փորձարկվել են SDC-2 կոլոկալիզացիայի համար `զանգվածային անալիզի միջոցով: P1 խթանողից տառադարձումը արտադրում է արական հատուկ գործառական հատկություններ նրան-1 տառադարձում, ներառյալ չորս էկզոն (կանաչ): Խթանողը (P2) բնակվում է երկրորդ ինտրոնի ներսում նրա -1. P2- ը հիմնավորված է P1- ով և կազմում է անհայտ գործառույթի 0,8-կբ տառ, որը ներառում է վերջին երկու էկզոններընրա -1 (Trent et al. 1991 Perry et al. 1993): Աստիճանը SDC-2 colocalization հետ նրան-1 շրջանները ցուցադրվում են ըստ գույնի, իսկ բանալին ՝ աջ կողմում: Երեք ամենափոքր շրջաններն ուժեղ SDC-2 կոլոկալիզացիայով (տարածաշրջան 1 [B], տարածաշրջան 2 [C5] և շրջան 3 [D6]) ցուցադրվում են մուգ մոխրագույն ստվերներով: C5- ը և D6- ը կիսում են միևնույն 15-bp տարրը (պինդ ուղղահայաց գծեր) և հաջորդականության ընդհանուր 50% ինքնությունը: B- ն ակնհայտ նմանություն չունի C5- ի կամ D5- ի հետ, բայց պարունակում էնրան-1(gf) (կտրված ուղղահայաց գիծ): SDC-2-ի կոլոկալիզացիան ամբողջությամբ խաթարվել է պատահականացված 15-մերով կամ C5-ում կամ D5-ում և G → A անցումով: նրան-1(gf) B-ում (դեղին աստղերը B', C5' և D5'): (Բ) Վայրի տիպի առանձին աղիքային միջուկի կոնֆոկալ պատկերներ XX Կենդանիներ, որոնք կրում են GFP պիտակավորված արտաքրոմոսոմային զանգվածներ (կանաչ)՝ 1–3 շրջանների վայրի տիպի (B, C5 և D5) կամ մուտանտի (B‘, C5' և D5') տարբերակներով: Կենդանիներին իմունոներկայացրել են DPY-27 (կարմիր) կամ SDC-3 (կապույտ) հակամարմիններով: Theանգվածի և սպիտակուցի միջև կոլոկալիզացիան միավորված պատկերում դեղին է թվում: Սլաքների ծայրերը ցույց են տալիս X քրոմոսոմներ:

Բ հատվածը ներառում է P1 խթանիչը, որն արտադրում է 1,2 կբ ֆունկցիոնալնրա -1 տառադարձում (Trent et al. 1991 Perry et al. 1993): Այս կարգավորիչ տարածաշրջանը առաջին անգամ ներգրավվեց նրա -1 ռեպրեսիա՝ ֆունկցիոնալ աճի մուտացիայով, նրա -1(gf), որը մասամբ ճնշում է նրա -1 տառադարձում ՝ առաջացնելով դրանց էական, բայց ոչ լիարժեք առնականացում XX մուտանտներ (Trent et al. 1988): -ի գտնվելու վայրը նրան-1(gf) 2 bp նախքան տառադարձման մեկնարկի կայքէջը մեզ հուշում էր ստուգելու, թե արդյոք նրա -1(gf) խանգարում է ռեպրեսիոն համալիրի կապակցմանը (Perry et al. 1994): Իրոք, SDC-2-ը, SDC-3-ը և DPY-27-ը չկարողացան կապվել հատվածի (B‘) հետ, որը պարունակում էր A → T անցումը: նրա -1(gf) ՝ ցույց տալով, որ այդ դեպրեսիան նրան-1 տառադարձումը գոնե մասամբ առաջանում է ռեպրեսորների միացման խափանումով (նկ. 3 Ա, B տվյալները ցույց չեն տրված): Theնրա -1(gf) մուտացիան, ըստ երևույթին, վերացնում է ոչ թե նվազեցնում SDC- ի կապը, քանի որ SDC-2- ի գերարտահայտումը չի կարող ճնշելXX առնականացում, որն առաջացել է նրա -1(gf) (տես Նյութեր և մեթոդներ):

C և D հատվածները գտնվում են նրա մեծ երկրորդ ինտրոնի սահմաններում նրա -1. Ի տարբերություն P1- ի, այս կոնկրետ տարածաշրջանը ներգրավված չէրնրա -1 ճնշումը գործառույթի մուտացիաների միջոցով: Այնուամենայնիվ, մասնակի առնականացումը XX կենդանիներ ըստ նրա -1(gf) համեմատությամբ գրեթե ամբողջական առնականացման հետsdc-3(Tra) առաջարկեց, որ SDC- ի միջնորդությամբ նրա -1ռեպրեսիան պահանջում է հաջորդականություններ դուրս gf շրջան։ Ավելին, անուղղակի փորձերը ենթադրեցին երկրորդ ինտրոնի հնարավոր ներգրավվածություն նրան-1 ճնշում (Li et al. 1999):

Մենք ուսումնասիրեցինք, թե արդյոք սպիտակուց -ԴՆԹ փոխազդեցությունները, որոնք դիտվում են C և D բեկորներով էքստրաքրոմոսոմային զանգվածների վրա, նույնպես տեղի են ունեցել էնդոգեն նրան-1 գեն ՝ քրոմատինի իմունային տեղումների (ChIP) միջոցով ՝ ֆորմալդեհիդով մշակված վայրի սաղմերի լիզատներից: SDC-2 հակամարմինները օգտագործվել են SDC համալիրը իմունային ԴՆԹ-ով իմունոմիջեցնելու համար, և ԴՆԹ-ն վերլուծվել է հարստացնելու համար նրա -1 հատվածներ օգտագործելով այբբենարաններ A -F շրջաններին առանձին PCR ռեակցիաներում: Կողմնակի այբբենարաններ նրան -1, գենը մեկ այլ քրոմոսոմի վրա, և գենոմային բեկորները Ա շրջանից անմիջապես վերևում օգտագործվել են որպես հսկիչ: Միայն C և D շրջաններից ԴՆԹ -ն հատուկ հարստացվել է բացասական հսկողության համեմատ եռապատիկից չորսապատիկով (նկ. 4 Ա): SDC-2 կամ SDC-3 հակամարմիններով կատարված զուգահեռ չիպեր, միայն վայրի տիպի ԴՆԹ, բայց ոչsdc-3(Tra) լիզատները հարստացվել են C հատվածի համար (նկ. 4 Բ): Այս արդյունքը հաստատեց Chip-ի առանձնահատկությունը՝ ցույց տալով, որ այն ճիշտ է արտացոլում SDC-ի հետ կապված կապի խախտումը։ նրան-1պատճառած sdc-3(Տրա): Ստուգումներում C շրջանի ԴՆԹ-ի համարժեք մակարդակները հայտնաբերվել են PCR-ներում՝ օգտագործելով վայրի տիպի և մուտանտի լիզատներից արդյունահանված ԴՆԹ (նկ. 4B): Նմանապես, SDC սպիտակուցների համադրելի մակարդակներ են հայտնաբերվել ինչպես լիզատներում, այնպես էլ Վեստերն բլոտներով (նկ. 4C) և IP փորձերով (նկ. 4D): Այս փորձերը միասին ցույց են տալիս, որ SDC համալիրը էնդոգեն ասոցացվում է C և D շրջանների հետնրան-1 գենը: Այս վերլուծության միջոցով B տարածաշրջանը հայտնաբերելու անկարողությունը հուշեց, որ B տարածաշրջանը SDC- ի կապման համար ունի ավելի ցածր հզորություն, քան C և D շրջանները, ինչպես ցույց է տրված ստորև և նախկինում վարկածավորված (Li et al. 1999):

Քրոմատինի իմունային տեղումների փորձերը (ChIP) ցույց են տալիս SDC սպիտակուցների փոխազդեցությունը էնդոգեն նրա -1գենը: (Ա) ՉԻՊ-ից ԴՆԹ-ի PCR վերլուծություն, որը կատարվում է SDC-2 հակամարմիններով և ֆորմալդեհիդի խաչաձև կապով լիզատներով XXսաղմերը. Այբբենարանի հավաքածուները հատուկ են նրան-1 շրջաններ կամ վերահսկող գեն (նրան -1) օգտագործվել են PCR- ների համար, որոնք ունեն կեղծված ԴՆԹ (Մ) և SDC-2 նստված ԴՆԹ-ի (SDC-2) կամ մուտքային ԴՆԹ (մուտքագրում) կրկնակի սերիական նոսրացումներ: IP-ով հարստացված ԴՆԹ-ից յուրաքանչյուր պրայմերային զույգի կողմից արտադրված PCR ժապավենի ինտենսիվությունը նորմալացվել է մուտքային ԴՆԹ-ի ամենաբարձր կոնցենտրացիայից ստացված համապատասխան PCR ժապավենի նկատմամբ: -ի D և C շրջանները նրա -1 մասնավորապես հարստացվել են վերևում նրան -1վերահսկում են ԴՆԹ-ն համապատասխանաբար եռակի կամ քառակի: (Այբբենարանները կողքինրան-1 արտադրել է PCR արտադրանք IP- ով հարստացված 22% նորմալացված ինտենսիվության ԴՆԹ-ից, մինչդեռ D և C շրջաններին հարող այբբենարանները համապատասխանաբար 67% և 86% շերտեր են արտադրել ՝ նորմալացված ինտենսիվությամբ):Բ) PCR վերլուծությունը C շրջանի պրայմերներով իրականացվել է ՉԻՊ-ից ԴՆԹ-ի կրկնակի սերիական նոսրացումների վրա՝ օգտագործելով SDC-2 կամ SDC-3 հակամարմիններ և ֆորմալդեհիդով մշակված վայրի տիպի կամ լիզատներ:sdc-3(Tra) XX սաղմերը. Յուրաքանչյուր PCR խմբի ինտենսիվությունը նորմալացվել է PCR խմբի ինտենսիվությանը, որը պատրաստված է վայրի տիպի լիզատից IP- ով հարստացված ԴՆԹ-ի ամենաբարձր կոնցենտրացիայից: Միջին ինտենսիվությունը և ստանդարտ շեղումները հաշվարկվել են երկու անկախ ChIP փորձերի նյութերի վրա PCR վերլուծությունների չորս հավաքածուներից: ՉԻՊ արձանագրության առանձնահատկությունը ցույց տվեց վայրի տիպի, բայց ոչ մուտանտի լիզատներից C տարածաշրջանի ԴՆԹ-ի տեղումները: C շրջանի ԴՆԹ-ի նման մակարդակները հայտնաբերվել են PCR-ի միջոցով՝ օգտագործելով վայրի տիպի և կրկնակի սերիական նոսրացումներ sdc-3(Tra) մուտքային լիզատներ: (Գ, Դ) SDC-2- ի և SDC-3- ի նման մակարդակները հայտնաբերվել են որևէ մեկի (Western blot) վերլուծությամբ:Գ) ամբողջական լիզատներ կամ (Դ) SDC-2 IP նյութ ՝ ֆորմալդեհիդով մշակված վայրի տիպի լիզատներից և sdc-3(Tra) սաղմերը.

ԴՆԹ-ի ճանաչման տարատեսակ տարրերը գտնվում են երեք տարբերության մեջնրան-1 քրոմատինի թիրախներ

Ցույց տալով, որ B, C և D բեկորները ճշմարիտ SDC թիրախներ են, մենք ավելի ճշգրիտ սահմանեցինք ԴՆԹ-ի հաջորդականության պահանջները SDC կապի համար: Տարածաշրջան B- ի չորս ենթամասերից միայն B2- ն է աջակցել SDC-2- ի նշանակալի կոլոկալիզացիային (նկ. 3 Ա): Այնուամենայնիվ, B2- ի տեղայնացումը ավելի քիչ հետևողական էր, քան B- ին տեղայնացումը, ինչը ենթադրում էր, որ SDC-2- ի ուժեղ կապը պահանջում է մեկից ավելի տարանջատված տարր B տարածաշրջանում: C5) C- ի և D- ի 192-bp հատվածի (D6) (նկ. 3A, B): SDC-1, SDC-3, DPY-26, DPY-27 և MIX-1 բոլորը համակցված են SDC-2-ով այս բեկորների վրա՝ ցույց տալով, որ SDC սպիտակուցների համար անհրաժեշտ ամբողջ տեղեկատվությունը քրոմատինի հետ փոխազդելու և դեղաչափի փոխհատուցման համալիր հավաքագրելու համար կարող է պետք է նշվի 192 bp ԴՆԹ-ով (նկ. 3A,B տվյալները ցույց չեն տրված), որը հեռացվել է իր բնիկ քրոմոսոմային համատեքստից:

ԴՆԹ -ի հաջորդականությունների շատ սահմանափակ նմանություն է հայտնաբերվել B (տարածաշրջան 1) և C5 (տարածաշրջան 2) կամ D6 (տարածաշրջան 3) միջև: Ի հակադրություն, C5- ը և D5- ը (287-bp հատված, որը ներառում է D6- ը) կիսում են ընդհանուր ինքնության 50% -ը և C5- ի հակասահմանային շղթայի և D5- ի իմաստային շղթայի ամբողջական ինքնության 15-bp (CAAAAACTGAGCCTG): Այս տարրի ճշգրիտ պատճենը չկա X կամ գենոմի մեկ այլ տեղ: 15-bp տարրի պատահականացումը ACAGACTGCAGATAC (C5 ′ և D5 for) կամ GA CAGACGTCAATAC (D5 for համար) կանխեց SDC-2, SDC-3 և DPY-27 սպիտակուցների տեղայնացումը մուտանտի բեկորների զանգվածների մեջ (նկ. 3 Ա , B տվյալները ցուցադրված չեն): Հետևաբար, 15-bp կրկնվող հաջորդականությունը անհրաժեշտ է SDC և DPY սպիտակուցները 2-րդ և 3-րդ շրջանները թիրախավորելու համար: Այնուամենայնիվ, 15-mer-ը բավարար չէ, քանի որ SDC-2-ը չկարողացավ կապվել պատահական ԴՆԹ-ի բազմաթիվ պատճեններ կրող զանգվածների հետ կամ 15-ը: -mer կամ 28-bp տարր, որը ներառում է 15-mer և հարակից ընդհանուր հաջորդականությունները (տվյալները չեն ցուցադրվում): Այլ cis-գործող հաջորդականությունները պետք է էական լինեն: Այսպիսով, ԴՆԹ -ի երեք տարրերը, որոնք օգտագործվում են դեղաչափերի փոխհատուցման սարքավորումների վրա նրա -1 բազմազան են: Կա՛մ SDC սպիտակուցներն իրենք ունեն ճկունություն հաջորդականության ճանաչման հարցում, կա՛մ այլ բջջային բաղադրիչներն օգնում են փոխանցել հաջորդականության առանձնահատկությունն ու կապը:

SDC-2-ի դիֆերենցիալ հավաքագրում դեպի նրան-1 անհատական ​​ճանաչման տարրերով

Մուտացիաների բացահայտում, որոնք վերացրել են SDC- ի կապը առանձին կայքերում նրա -1 մեզ թույլ տվեց in vivo գնահատել և փոխկապակցել յուրաքանչյուր տեղամասի ֆունկցիոնալ ներդրումը SDC-ի ընդհանուր կապակցման և ճնշելու գործում: նրան-1. Մենք ներկայացրել ենքնրան-1(gf) 1-ին շրջանի և 2-րդ և 3-րդ շրջանների պատահականացված 15-անձի մուտացիան միասին կամ առանձին `ամբողջական երկարությամբնրան-1- փրկարարական կոնստրուկցիաներ՝ յուրաքանչյուր տեղամասի դերը ստուգելու համար:XX GFP- ով պիտակավորված արտաքրոմոսոմային զանգվածից մեկ կոնստրուկցիա արտահայտող կենդանիները հետազոտվել են զանգվածներում SDC-2 տեղայնացման հաճախականությամբ և արական ճակատագրին սեռական կերպարանափոխության համար `տրանսկրիպցիոն դեպրեսիայի ցուցիչ (տես Նյութեր և մեթոդներ): Այնուհետև կայքի գործառական նշանակությունը կարելի է եզրակացնել ՝ համեմատելով SDC- ի տեղայնացման փոփոխությունը այդ կայքի խափանումով առաջացած սեռական փոխակերպման աստիճանի հետ (Նկար 5 Ա):

Երեքի հարաբերական ներդրումները նրա -1ճանաչման տարրերը տարբերվում են SDC- ի պարտադիր և նրան-1ռեպրեսիա. (Ա) ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունների մուտացիա ամբողջ երկարությամբ նրան-1 տրանսգենները խաթարում են SDC-2 տեղայնացումը դեպինրան-1 և ճնշումը նրա -1 նրան-1Տրանսգենային զանգվածներում ներառված կոնստրուկցիաները պատկերված են ձախ կողմում գտնվող գծապատկերներով՝ սպիտակ աստղերով նշված մուտացիաներով: Տրանսգեն զանգվածների SDC-2 տեղայնացման տոկոսը ներկայացված է մոխրագույն շերտերով: Փորձարկված գծերի միջև ստանդարտ շեղումը ներկայացված է կետագծով: (n) Բոլոր տողերում միավորված միջուկների ընդհանուր թիվը: Առնականացում՝ առաջացած ամբողջ երկարությամբ նրա -1 transgenes-ը քանակականացվել է (տես Նյութեր և մեթոդներ), այնուհետև գնահատվել է որպես (−) ոչ մեկը, (+) թույլ, (++) միջին, (+++) ուժեղ կամ (++++) ծանր: (ԲԳ) Առատաձևացման օրինակներ, որոնք առաջացել են դեպրեսիայի հետևանքով նրա -1. Պոչերի DIC- ի ֆոտոմիկրոագրերը (Բ) վայրի տեսակ XX հերմաֆրոդիտ, (ԳՖ) XX կենդանիներ, որոնք առնականացված են ամբողջ երկարությամբ նրան-1 տրանսգեններ և (Գ) վայրի տիպXO արական: Կողային տեսարաններ (ԲԴ) և փորոտ տեսարաններ (ԵԳ): (Սպիտակ սլաք) արական երկրպագու (սև սլաք) արական զգայական ճառագայթներ (սև նետի գլուխ) արական ցողուններ:

2-րդ և 3-րդ շրջաններն ունեին մոտավորապես համարժեք SDC-2 պարտադիր ակտիվություն ամբողջ երկարության համատեքստում նրան-1 գենը, և այդ շրջաններն ապահովում էին ավելի ամուր կապ, քան 1 -ին շրջանը (նկ. 5 Ա): SDC-2-ը տեղայնացված է վայրի տեսակ կրող զանգվածների 90%-ում նրան-1 գենը: Տեղայնացումը փոքր-ինչ կրճատվել է մինչև 85%,նրա -1(gf) ախտահարում 1-ին շրջանում, թեև այս վնասվածքը վերացրել է SDC-2-ի տեղայնացումը միայն 1-ին շրջան պարունակող հատվածում: Մնացած SDC կապը պետք է տեղի ունենար 2-րդ և 3-րդ շրջանների միջոցով: 15-mer-ի պատահականացումը նվազեցրեց SDC-2-ի տեղայնացումը մինչև 20%-40%, իսկ երկու 15-մերերի պատահականացումը նվազեցրեց SDC-2-ի տեղայնացումը մինչև 10%: SDC-ի տեղայնացումը էականորեն չի կրճատվել՝ խախտելով 1-ին շրջանը տրանսգենի վրա, որն արդեն մուտանտ է 2-րդ կամ 3-րդ տարածաշրջանի համար, բայց մեղմորեն կրճատվել է՝ խախտելով 1-ին շրջանը տրանսգենային մուտանտի վրա երկու շրջանների և 2-րդ և 3-րդ շրջանների համար: Համեմատաբար թույլ SDC կապող կապը տարածաշրջանի համար 1 լիամետրաժ համատեքստում նրան-1 տրանսգենը համապատասխանում է էնդոգեն գենի վրա ՉԻՊ վերլուծության միջոցով 1-ին շրջանի հայտնաբերման դժվարությանը:

-Ի ամբողջական ճնշումը նրա -1 պահանջում է SDC- ի պարտադիր բոլոր երեք շրջանների մասնակցությունը

Արդյո՞ք SDC-ի ուժը կապված է տարածաշրջանի հետ, փոխկապակցված է ճնշելու արդյունավետության հետ նրա -1? Սեռական ֆենոտիպի վերլուծություն XX վայրի տիպի կամ փոփոխված ամբողջ երկարությամբ կենդանիներնրա -1 տրանսգենները բացահայտեցին այդ ամբողջական ճնշումընրա -1 պահանջում էր SDC-ին պարտադիր բոլոր երեք շրջանների մասնակցությունը: Այնուամենայնիվ, SDC- ի հետ կապված գործունեության ամենաթույլ տարածաշրջանը 1-ն ամենամեծ ներդրումն է ունեցել ճնշումների համար (նկ. 5 Ա – Գ): 2-րդ և 3-րդ շրջանները նպաստեցին ռեպրեսիոն գործունեությանը՝ 1-ին շրջանի բացակայության դեպքում, սակայն ռեպրեսիան ավելի քիչ արդյունավետ էր, քան 1-ին շրջանը (նկ. 5A–G): Աստիճանը նրան-1 2 -րդ և 3 -րդ շրջաններից բռնաճնշումները կարող են ավելի համեմատելի լինել բռնաճնշումների հետ X- կապված գեներ, որոնք առաջանում են դեղաչափի փոխհատուցման ժամանակ:

Այս եզրակացությունները արվել են հետևյալ դիտարկումներից (նկ.5Ա–Գ). XX վայրի տեսակներ կրող կենդանիներ նրա -1տրանսգենները ցույց տվեցին տղամարդկայնացման շատ ցածր մակարդակներ ( -), ինչը վկայում էր ուժեղ ճնշումների մասին: 2-րդ կամ 3-րդ շրջանի մուտացիան առաջացրեց թույլ առնականացում (+), որը փոխկապակցված էր SDC-2 տեղայնացման միջանկյալ խախտման հետ: Երկու և 3 շրջանների մուտացիան առաջացրեց չափավոր առնականացում (++), չնայած SDC-2 տեղայնացման ուժեղ խախտմանը: Ի վերջո, 1 -ին շրջանի մուտացիան առաջացրեց ուժեղ առնականացում (+++), չնայած SDC- ի տեղայնացման միայն մի փոքր նվազմանը: Այս առնականացումը չի բարելավվել միայն 2-րդ կամ 3-րդ շրջանները խաթարելով, այլ ուժեղացել է 2-րդ և 3-րդ շրջաններն էլ խանգարելով՝ առաջացնելով ծանր առնականացում (++++):

SDC սպիտակուցների թույլ կապը տարածաշրջանի 1-ին ՝ ամբողջ երկարությամբնրա -1 transgene- ն մտահոգություն հայտնեց, որ SDC սպիտակուցները չեն կարող միջնորդել տարածաշրջանից 1 -ի ընկճմանը: Հետևաբար, մենք գնահատեցինք SDC- ի ՝ հատկապես տարածաշրջան 1 -ի հետ կապը խափանելու ազդեցությունը `ներկայացնելովsdc-3(Տր) մուտացիա գենոտիպորեն նրան-1(−) ամբողջ հասակ ունեցող կենդանիներ նրան-12 և 3. շրջաններում մուտացիաներով տրանսգեններ են հայտնաբերվել տղամարդկացած կենդանիների թվի կրկնակի և եռակի աճ, ինչը ցույց է տալիս, որ SDC սպիտակուցները նպաստում են in vivo տարածաշրջանից 1 -ի ճնշմանը:

2-րդ և 3-րդ շրջանների ներգրավումը SDC միջնորդությամբ նրա -1in vivo- ի ճնշումը հետագայում ամրապնդվում է ՝ նախորդ գենետիկական տվյալները մեկնաբանելով SDC- ի պարտադիր տվյալների համատեքստում: Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ նրա -1(gf) մուտացիան վերացնում է SDC-ի կապը 1-ին, բայց ոչ 2-րդ և 3-րդ շրջանների հետ, մինչդեռ sdc-3(Tra) մուտացիան խիստ նվազեցնում է SDC կապը բոլոր երեք շրջանների հետ: Այսպիսով, տղամարդկացման ավելի մեծ աստիճանը XX կենդանիների կողմից առաջացածsdc-3(Tra) մուտացիա (մուտանտների 100%) `համեմատածնրա -1(gf) մուտացիան (մուտանտների 30%-ը) պետք է առաջանա 2-րդ և 3-րդ շրջանների հետ SDC-ի կապի կրճատման արդյունքում: Հետևաբար, 2-րդ և 3-րդ շրջանները էապես նպաստում են SDC-ով միջնորդավորված էնդոգեն ռեպրեսիային:նրա -1 գենը ՝ 1 -ին շրջանի հետ միասին:


EccDNA- ների դասակարգումը և ծագումը

Էուկարիոտների գենոմը բաղկացած է քրոմոսոմային ԴՆԹ -ից և արտաքրոմոսոմային ԴՆԹ -ի տարրերից, որոնք ֆիզիկապես դուրս են հանվում քրոմոսոմներից 3: «#x0201ceccDNA”» տերմինն այժմ օգտագործվում է էուկարիոտներում շրջանաձև ԴՆԹ-ների ամբողջ սպեկտրը նկարագրելու համար: eccDNAs- ը լայնորեն տարածված են տարբեր էուկարիոտների մեջ `խմորիչից մինչև մարդու 12-14: eccDNA-ները կարելի է բաժանել օրգանելային eccDNA-ների, ինչպիսիք են միտոքոնդրիալ ԴՆԹ-ները (mtDNAs) և ավելի ճկուն ոչ օրգանական eccDNA-ների, ինչպիսիք են կրկնակի րոպեները (DMs), էպիզոմները, փոքր բազմաշերտ շրջանաձև ԴՆԹ-ները (spcDNA) և միկրոԴՆԹ-ները (Աղյուսակ 𠂱 (Աղյուսակ 1) ) 15. Նրանց չափերը տատանվում են հարյուրավոր բազային զույգերից (bp) մինչև այնքան մեծ, որքան մի քանի մեգա հիմքեր (Mb): Համընդհանուր գոյության և տարասեռ ածանցման շնորհիվ eccDNA- ներն արտացոլում են գենոմային պլաստիկությունն ու անկայունությունը:

Աղյուսակ 1

EccDNA-ների դասակարգումը էուկարիոտներում

eccDNA-ի անվանումըՉափերի տիրույթԿենսաբանական գործառույթՀղումներ
Միտոքոնդրիալ ԴՆԹ16 կբՄիտոքոնդրիայի գործառույթի պահպանում134
Կրկնակի րոպե100 կբ-3 ՄբԳործելով որպես էքստրակրոմոսոմային գենի ուժեղացման միջոց6, 56
Փոքր polydispersed շրջանաձեւ ԴՆԹ100 բպր -10 կբԳենոմային անկայունության բարձրացում34
միկրոԴՆԹ100-400 բպMiRNA- ների արտադրություն75
Տելոմերիկ շրջան738 bp ինտեգրալ բազմապատիկՏելոմերների երկարության վերականգնում135

Աճող ապացույցները վկայում են, որ էուկարիոտիկ բջիջներում eccDNA- ները սովորաբար կրում են իրար ցրված կրկնվող հաջորդականություններ կամ տենդեմային կրկնվող գենոմային հաջորդականություններ 16-18: Կարելի է եզրակացնել, որ տանդեմալ կրկնվող ԴՆԹ -ները հատկապես հակված են eccDNA ձևավորման 17: Մյուս կողմից, eccDNA- ները նույնպես բխում են չկրկնվող ԴՆԹ -ից: Լուն և այլք: 19-ը պարզել է, որ HeLa S3 բջիջների eccDNA- ները բաղկացած են ոչ կրկնվող կամ ցածր կրկնօրինակված ԴՆԹ հաջորդականություններից: Բացի այդ, որոշ չկրկնվող spcDNA- ներ երկու կողմից սահմանազատված էին 9-11 բ. 20, 21 միջին երկարության ուղիղ կրկնումներով: eccDNA- ներ կարող են ծագել ինչպես ծածկագրող, այնպես էլ ոչ ծածկագրող շրջաններից: Օրինակ, օնկոգենները և դեղամիջոցներին դիմակայող գեները ճանաչվել են որպես DMs 22 -ի գերակշռող բաղադրիչներ: Բացի այդ, միկրոԴՆԹ-ները նախընտրելիորեն բխում են էկզոններից, 5' ոչ թարգմանական շրջաններից (5' UTR) և CpG կղզիներից 23:


NIPT տեխնոլոգիայի տեսակները

NIPT-ի համար սովորաբար օգտագործվող տեխնոլոգիական հարթակները ամբողջ գենոմի հաջորդականությունն են՝ օգտագործելով հաջորդ սերնդի հաջորդականությունը (NGS) կամ տարբեր նպատակային մեթոդներ: Ձեր լաբորատորիայի համար լավագույն NIPT տեխնոլոգիան դիտելիս կցանկանաք հաշվի առնել տվյալների ստեղծումը և վերլուծությունը, լաբորատոր աշխատանքի ընթացքը և դրանից բխող կլինիկական հետևանքները:

NIPT և ամբողջ գենոմի հաջորդականացում

NIPT-ն՝ օգտագործելով ամբողջ գենոմի հաջորդականության տեխնոլոգիան, ապահովում է NIPT-ի 1-7 ամենատեղեկատվական արդյունքները՝ համապարփակ տեսարանով ողջ գենոմի վրա: Ամբողջ գենոմի հաջորդականությամբ NIPT- ը հետևողականորեն ունի ձախողման ավելի ցածր տեմպեր `համեմատած նպատակային հաջորդականության կամ զանգվածների վրա հիմնված հարթակների հետ 8:

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) առանց նմուշի պատրաստումը, որն օգտագործվում է ամբողջ գենոմի հաջորդականության վրա հիմնված NIPT- ով, բարելավում է լաբորատոր աշխատանքի ընթացքը, մեծապես նվազեցնում է հետազոտության բարդությունը և զգալիորեն բարելավում շրջադարձի ժամանակը (TAT): Այս տեսակի NIPT NGS տեխնոլոգիան կարող է նաև հեշտությամբ չափվել `աճող լաբորատորիայի կարիքները բավարարելու համար:

NIPT և ամբողջ գենոմի հաջորդականացում

Թիրախավորված մոտեցումներ NIPT- ի համար

NIPT- ի նպատակային տեխնոլոգիաները ներառում են մեկ նուկլեոտիդային պոլիմորֆիզմի (SNP) վերլուծություն, միկրոզանգվածի վերլուծություն և շարժակազմի շրջանակի ուժեղացում: Նպատակային մոտեցումներով վերլուծվում են ընտրված քրոմոսոմների միայն սահմանափակ շրջանները:

Այս նպատակային մոտեցումներն ունեն լրացուցիչ քայլեր և կիրառում են ավելի շատ փուլեր, քան ամբողջ գենոմի հաջորդականության մեթոդները ՝ ներկայացնելով ավելի բարդ աշխատանքային հոսք:

SNP վերլուծություն

SNP- ները գենետիկական տատանումներ են անհատների շրջանում: Այս տեխնիկան որոշում է ծնողի և երեխայի ԴՆԹ -ի միջև եղած տարբերությունը և գենետիկական տատանումների հարաբերական դեղաչափը `պատճենների թիվը եզրակացնելու համար: cfDNA-ն ուժեղացվում է PCR-ի միջոցով՝ օգտագործելով հատուկ SNP թիրախներ: Այս թիրախները հաջորդականացվում են, և որոշվում է մոր և երեխայի ալելների բաշխումը: Ալգորիթմը որոշում է ակնկալվող ալելային հաճախականությունների աննորմալությունները:

SNP վերլուծություն

Microarray վերլուծություն

Այս տեսակի NIPT- ում օգտագործվում է միկրոզանգված, որը ամուր մակերեսին ամրացված ԴՆԹ -ի մանրադիտակային շրջանների հավաքածու է: cfDNA- ի բեկորներն ուժեղացվում են PCR- ով, նշվում են լյումինեսցենտային զոնդով և կապվում են NIPT միկրոզանգվածի կոմպլեմենտար հաջորդականությունների հետ: Both the light intensity and binding position indicate the relative amount of DNA and presence or absence of the target, respectively. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

Microarray Analysis

Rolling Circle Amplification

Rolling circle amplification targets specific cfDNA fragments which bind to a circular template and replicate by a rolling mechanism. The rolling circle replication products are fluorescently labeled and counted. Deviations in expected fluorescent counts indicate aneuploidy.

Rolling Circle Amplification

A Guide to NIPT Technology Options

Learn more about evaluating NIPT options and key considerations when selecting a technology for your lab.

A Guide to NIPT Technology Options

Comparison of NIPT Technology Types

How is NIPT Data Generated?

Purified cfDNA fragments are labelled with universal sequencing adapters to create a library. The library is amplified through bridge amplification (PCR-free) or PCR.

The sample libraries are sequenced using single or paired-end sequencing.

SNPs on chromosomes of interest are amplified by PCR and sequenced from cfDNA isolated from the plasma of pregnant women.

Probes designed to match specific sequences of the genome are synthesized onto specific areas on the microarray.

Targeted cfDNA fragments are amplified by PCR, tagged with a fluorescent probe, and bind to complimentary sequences on the microarray.

Target cfDNA fragments hybridize to probes designed to form circular complexes.

The DNA circles are copied thousands of times to generate rolling circle products.

How is NIPT Data Analyzed?

An over or under representation of sequenced reads based on expected distribution indicates aneuploidy.

An altered ratio of target alleles compared with expected ratios indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

An over or under representation of fluorescent counts compared with a reference genome indicates aneuploidy.

What are the Clinical Considerations of NIPT?

All chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

Only select chromosomes are evaluated.

What are the NIPT Lab Workflow Implications?

A PCR-free workflow eliminates the need for pre- and post-PCR lab space, allowing steps to be performed in a single area.

This workflow requires less hands-on time, faster TAT, and is less prone to contamination since PCR amplification is not employed.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

PCR involves a more complicated workflow, significantly longer TAT, and necessitates pre- and post-PCR workspace considerations.

There is reduced risk for contamination since PCR is not employed however, this method results in a long TAT.

Լրացուցիչ ռեսուրսներ

The Science Behind NIPT

See how this NIPT workflow detects aneuploidy in three simple steps.

Noninvasive Prenatal Testing and NIPT

Dr. Wapner, Vice Chair of Research in Obstetrics and Gynecology for Columbia University, shares his perspective on prenatal screening and NIPT.

NIPT Delivers Relief to Expectant Mother

Whole-genome sequencing provides results when another test was inconclusive.

NIPT: Effective Screening for the General Pregnancy Population

Glenn Palomaki, PhD, discusses the clinical validity and utility of offering NIPT as a primary screen in the general pregnancy population.

Հղումներ
  1. Illumina Inc. VeriSeq™ NIPT Solution v2 Package Insert. 2020 թ
  2. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 201113(11):913-920
  3. Ryan A, Hunkapiller N, Banjevic M, et al.Validation of an Enhanced Version of a Single-Nucleotide Polymorphism-Based Noninvasive Prenatal Test for Detection of Fetal Aneuploidies. Fetal Diagn Ther. 201640(3):219-223.
  4. Stokowski R, Wang E, White K, et al. Clinical performance of non-invasive prenatal testing (NIPT) using targeted cell-free DNA analysis in maternal plasma with microarrays or next generation sequencing (NGS) is consistent across multiple controlled clinical studies. Prenat Diagn. 2015doi: 10.1002/pd.4686.
  5. Jones KJ, Wang E, Bogard P, et al. Targeted cell-free DNA analysis with microarray quantitation for assessment of fetal sex and sex chromosome aneuploidy risk. Ultrasound Obstet Gynecol. 201851(2):275-276.
  6. Taneja PA, Snyder HL, de Feo E, et al. Noninvasive prenatal testing in the general obstetric population: clinical performance and counseling considerations in over 85,000 cases. Prenat Diagn. 2016 doi:10.1002/pd.4766.
  7. McCullough RM, Almasri EA, Guan X, et al. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing--clinical experience: 100,000 clinical samples.
  8. Data on file. Illumina, Inc. November 2018.
Միայն հետազոտական ​​օգտագործման համար

Չի օգտագործվում ախտորոշիչ ընթացակարգերում, բացառությամբ հատուկ նշված դեպքերի:

Նորարար տեխնոլոգիաներ

Illumina- ում մեր նպատակն է գենետիկական տատանումների և գործառույթների վերլուծության մեջ կիրառել նորարարական տեխնոլոգիաներ `հնարավոր դարձնելով ուսումնասիրություններ, որոնք նույնիսկ պատկերացնել հնարավոր չէր ընդամենը մի քանի տարի առաջ: Մեզ համար կարևոր առաքելություն է `մատուցել նորարար, ճկուն և մասշտաբային լուծումներ` մեր հաճախորդների կարիքները բավարարելու համար: Որպես համաշխարհային ընկերություն, որը բարձր է գնահատում համագործակցային փոխազդեցությունները, լուծումների արագ առաքումը և որակի ամենաբարձր մակարդակը, մենք ձգտում ենք դիմակայել այս մարտահրավերին: Illumina- ի հաջորդականացման և զանգվածային տեխնոլոգիաները խթանում են կենսական գիտության հետազոտությունների, թարգմանչական և սպառողական գենոմիկայի և մոլեկուլային ախտորոշման նորարար առաջընթացը:


Extrachromosomal DNA

Although most DNA is contained within a cell’s chromosomes, many cells have additional molecules of DNA outside the chromosomes, called extrachromosomal DNA, that are also part of its genome. The genomes of eukaryotic cells would also include the chromosomes from any organelles such as mitochondria and/or chloroplasts that these cells maintain (Figure 3). The maintenance of circular chromosomes in these organelles is a vestige of their prokaryotic origins and supports the էնդոսիմբիոտիկ տեսություն (see Foundations of Modern Cell Theory). In some cases, genomes of certain DNA viruses can also be maintained independently in host cells during latent viral infection. In these cases, these viruses are another form of extrachromosomal DNA. For example, the human papillomavirus (HPV) may be maintained in infected cells in this way.

Figure 3. The genome of a eukaryotic cell consists of the chromosome housed in the nucleus, and extrachromosomal DNA found in the mitochondria (all cells) and chloroplasts (plants and algae).

Besides chromosomes, some prokaryotes also have smaller loops of DNA called պլազմիդներ that may contain one or a few genes not essential for normal growth (see Figure 1 in Unique Characteristics of Prokaryotic Cells). Bacteria can exchange these plasmids with other bacteria in a process known as հորիզոնական գեների փոխանցում (HGT). The exchange of genetic material on plasmids sometimes provides microbes with new genes beneficial for growth and survival under special conditions. In some cases, genes obtained from plasmids may have clinical implications, encoding virulence factors that give a microbe the ability to cause disease or make a microbe resistant to certain antibiotics. Plasmids are also used heavily in genetic engineering and biotechnology as a way to move genes from one cell to another. The role of plasmids in horizontal gene transfer and biotechnology will be discussed further in Mechanisms of Microbial Genetics and Modern Applications of Microbial Genetics.

Մտածիր այդ մասին

Lethal Plasmids

Maria, a 20-year-old anthropology student from Texas, recently became ill in the African nation of Botswana, where she was conducting research as part of a study-abroad program. Maria’s research was focused on traditional African methods of tanning hides for the production of leather. Over a period of three weeks, she visited a tannery daily for several hours to observe and participate in the tanning process. One day, after returning from the tannery, Maria developed a fever, chills, and a headache, along with chest pain, muscle aches, nausea, and other flu-like symptoms. Initially, she was not concerned, but when her fever spiked and she began to cough up blood, her African host family became alarmed and rushed her to the hospital, where her condition continued to worsen.

After learning about her recent work at the tannery, the physician suspected that Maria had been exposed to սիբիրախտ. He ordered a chest X-ray, a blood sample, and a spinal tap, and immediately started her on a course of intravenous penicillin. Unfortunately, lab tests confirmed the physician’s presumptive diagnosis. Maria’s chest X-ray exhibited pleural effusion, the accumulation of fluid in the space between the pleural membranes, and a Gram stain of her blood revealed the presence of gram-positive, rod-shaped bacteria in short chains, consistent with Bacillus anthracis. Blood and bacteria were also shown to be present in her cerebrospinal fluid, indicating that the infection had progressed to meningitis. Despite supportive treatment and aggressive antibiotic therapy, Maria slipped into an unresponsive state and died three days later.

Anthrax is a disease caused by the introduction of endospores from the gram-positive bacterium B. anthracis into the body. Once infected, patients typically develop meningitis, often with fatal results. In Maria’s case, she inhaled the endospores while handling the hides of animals that had been infected.

-Ի գենոմը B. anthracis illustrates how small structural differences can lead to major differences in virulence. In 2003, the genomes of B. anthracis եւ Bacillus cereus, a similar but less pathogenic bacterium of the same genus, were sequenced and compared. [4] Researchers discovered that the 16S rRNA gene sequences of these bacteria are more than 99% identical, meaning that they are actually members of the same species despite their traditional classification as separate species. Although their chromosomal sequences also revealed a great deal of similarity, several virulence factors of B. anthracis were found to be encoded on two large plasmids not found in B. cereus. The plasmid pX01 encodes a three-part toxin that suppresses the host immune system, whereas the plasmid pX02 encodes a capsular polysaccharide that further protects the bacterium from the host immune system (Figure 4). Քանի որ B. cereus lacks these plasmids, it does not produce these virulence factors, and although it is still pathogenic, it is typically associated with mild cases of diarrhea from which the body can quickly recover. Unfortunately for Maria, the presence of these toxin-encoding plasmids in B. anthracis gives it its lethal virulence.

Figure 4. Genome sequencing of Bacillus anthracis and its close relative B. cereus reveals that the pathogenicity of B. anthracis is due to the maintenance of two plasmids, pX01 and pX02, which encode virulence factors.

  • What do you think would happen to the pathogenicity of B. anthracis if it lost one or both of its plasmids?

Clinical Focus: Aamir, Resolution

Within 24 hours, the results of the diagnostic test analysis of Aamir’s stool sample revealed that it was positive for heat-labile enterotoxin (LT), heat-stabile enterotoxin (ST), և colonization factor (CF), confirming the hospital physician’s suspicion of ETEC. During a follow-up with Aamir’s family physician, this physician noted that Aamir’s symptoms were not resolving quickly and he was experiencing discomfort that was preventing him from returning to classes. The family physician prescribed Aamir a course of ciprofloxacin to resolve his symptoms. Fortunately, the ciprofloxacin resolved Aamir’s symptoms within a few days.

Aamir likely got his infection from ingesting contaminated food or water. Emerging industrialized countries like Mexico are still developing sanitation practices that prevent the contamination of water with fecal material. Travelers in such countries should avoid the ingestion of undercooked foods, especially meats, seafood, vegetables, and unpasteurized dairy products. They should also avoid use of water that has not been treated this includes drinking water, ice cubes, and even water used for brushing teeth. Using bottled water for these purposes is a good alternative. Good hygiene (handwashing) can also aid the prevention of an ETEC infection. Aamir had not been careful about his food or water consumption, which led to his illness.

Aamir’s symptoms were very similar to those of խոլերա, caused by the gram-negative bacterium Vibrio cholerae, which also produces a toxin similar to ST and LT. At some point in the evolutionary history of ETEC, a nonpathogenic strain of E. coli similar to those typically found in the gut may have acquired the genes encoding the ST and LT toxins from V. cholerae. The fact that the genes encoding those toxins are encoded on extrachromosomal plasmids in ETEC supports the idea that these genes were acquired by E. coli and are likely maintained in bacterial populations through horizontal gene transfer.


ՆԵՐԱՈԹՅՈՆ

Երկուսում էլ Դրոզոֆիլա եւ C. elegans, global silencing mechanisms appear to play a crucial role in the specification and maintenance of germ line tissue (Wylie, 1999). Մեջ C. elegans, these silencing mechanisms can be studied using transgene arrays containing a GFP reporter gene under the control of a promoter normally expressed in all cells (Kelly et al., 1997). The transgene arrays are strongly silenced in germ cells but are reactivated in the soma of each generation. Silencing in the germline can be partially prevented by increasing the ‘complexity’ of the transgene arrays formed in vivo through the co-injection of excess amounts of random, linear genomic fragments (Kelly et al., 1997).

Germline silencing of transgene arrays requires the action of the MES proteins (maternal effect sterility), MES-2, -3, -4, and -6 (Kelly and Fire, 1998). Two of the mes genes, mes-2 եւ mes-6, encode worm homologs of the Դրոզոֆիլա Polycomb Group proteins, Enhancer of Zeste and Extra Sex Combs, respectively (Holdeman et al., 1998 Korf et al., 1998). The Polycomb Group proteins maintain transcriptional repression of developmentally regulated genes through their ability to modulate chromatin conformation (Kennison, 1995). In addition, MES-2 and MES-4 each contain a SET domain, a conserved feature of many chromatin-interacting proteins. Defects in the mes factors cause sterility, owing to germ cell degeneration, and alleviate silencing of transgene arrays in the germline. Similar phenotypes can also result from depletion of a histone H1 isoform, H1.1 (Jedrusik and Schulze, 2001). Gene silencing through the regulation of chromatin conformation is therefore likely to be an essential component of germline maintenance, but the endogenous targets of this regulation are poorly understood. Severity of the germ cell degeneration in mes mutant animals increases with X-chromosome dose (Garvin et al., 1998), suggesting that some of the gene targets of MES-induced silencing reside on the X chromosome.

Global gene expression analysis has also suggested that the X chromosome is a possible target of silencing in the C. elegans germline. Microarray analyses have identified 1416 germline-enriched genes in C. elegans, which were classified into three distinct groups: sperm-enriched, oocyte-enriched and germline-intrinsic genes (defined as genes expressed similarly in the germline regardless of the gamete being made) (Reinke et al., 2000). Strikingly, sperm-enriched and germline-intrinsic genes are almost completely absent from the X chromosome. By contrast, oocyte-enriched genes are present on the X chromosome at a similar frequency to those found on autosomes. C. elegans XO males make only sperm and thus would not require expression of oocyte-enriched genes, whereas XX hermaphrodites first produce sperm as L4 larvae and then become strictly oogenic as adults (Schedl, 1997 Hubbard and Greenstein, 2000). The X chromosome in male germlines may therefore be regulated differently from autosomes in a manner that prohibits the presence of the sperm-enriched and germline-intrinsic genes. Another possibility is that these classes of genes are absent from the X chromosome for some unknown reason, but that the X chromosome is otherwise competent for gene expression.

In support of the first possibility, the distinction of the male X chromosome from the autosomes in the germline of C. elegans is reminiscent of sex chromatin formation in other species that bear non-equivalent sex chromosomes (heterogametic: XO or XY). During the pachytene stage of C. elegans meiosis in males, the single (and thus unpaired) X chromosome adopts a highly compact morphology analogous to that seen in mammalian spermatocytes (Goldstein, 1982). In the heterogametic sex of diverse species, the male X chromosome in the pachytene stage of meiotic prophase is found in a visually distinct structure called the XY- or sex-body that is transcriptionally inactive (Handel and Hunt, 1992). McKee and Handel (McKee and Handel, 1993) proposed that the condensation of sex chromatin in XY and XO male germlines, and by consequence the transcriptional inactivation of these chromosomes, prevents harmful recombination events between non-equivalent X and Y chromosomes, and prevents loss of a single chromosome lacking a pairing partner in XO animals. Մեջ C. elegans, both the exclusion of sperm-enriched and germline-intrinsic genes from the X chromosome, and the condensed structure of the X chromosome in the XO male germline suggest that the X chromosome in the male germ line may be targeted for silencing.

If the male X chromosome is silenced in the germline, then one expectation is that it should have a chromatin conformation consistent with decreased transcriptional activity. Chromatin structure can be regulated via differential modification of nucleosomal histone N termini ‘tails’, which includes acetylation, methylation, phosphorylation and ubiquitination (Strahl and Allis, 2000 Turner, 2000). Combinations of these modifications are proposed to comprise a ‘histone code’ that determines regional structural properties of chromatin (Strahl and Allis, 2000). The acetylation of lysine residues in the N termini of histones H3 and H4, as well as methylation of lysine 4 in histone H3, generally correlate with a transcriptionally active state. By contrast, methylation of lysine 9 in histone H3 correlates with transcriptional silencing and constitutive heterochromatin formation, and is required for binding of the heterochromatin protein HP1 (Strahl and Allis, 2000 Jenuwein, 2001). Some proteins containing a SET domain are histone methyltransferases that can methylate lysine 9 in histone H3 (Jenuwein, 2001 Jenuwein and Allis, 2001). The general scheme of a ‘histone code’ has probably undergone specific adaptations in different organisms, but overall remains strongly conserved.

We have used probes specific for histone modifications to study the chromatin organization of the X chromosome in germ cells of C. elegans males and hermaphrodites. Both germline-silenced and germline-expressing transgene arrays were used to monitor how the histone modification patterns on these large, extrachromosomal arrays correlate with expression competence. The spectrum of histone modifications on transgene arrays illustrate a consistent correlation with the expression competence of the array in early meiotic germ cells. Moreover, we present evidence that, relative to autosomes, the histones on the X chromosome in male germ cells show a marked reduction in modifications that correlate with transcriptional activation and are enriched in a modification that is associated with heterochromatin.

Strikingly, the X chromosomes in oogenic hermaphrodite germ cells also appear silenced in early meiotic prophase as assessed by their histone modification pattern. Oocyte-enriched genes on the X chromosomes are, on average, expressed at levels significantly lower than oocyte-enriched genes on autosomes. Transcription of several X-linked oocyte genes was only detected in very late meiotic prophase I in the female germline of hermaphrodites.

We also demonstrate that three types of unpaired autosomal sequences are competent to express genes and display activating chromatin modifications: extrachromosomal transgene arrays containing interspersed genomic DNA, unpaired autosomal duplications and the autosomal portions of X:autosome translocations. Each has histone modification patterns more similar to autosomes than to the X chromosome throughout meiosis. These results show that pairing is probably not required for gene expression during meiosis, and suggest that chromatin on autosomes may be refractory to germline silencing. We also show that silencing of the X chromosome is a conserved feature in nematode species with divergent modes of reproduction, and thus does not appear to be a consequence of hermaphroditism.


What's the difference between a free chromosome fragment and an extrachromosomal array? - Կենսաբանություն

By the end of this section, you will be able to do the following:

  • List the different steps in prokaryotic transcription
  • Discuss the role of promoters in prokaryotic transcription
  • Describe how and when transcription is terminated

The prokaryotes, which include Bacteria and Archaea, are mostly single-celled organisms that, by definition, lack membrane-bound nuclei and other organelles. A bacterial chromosome is a closed circle that, unlike eukaryotic chromosomes, is not organized around histone proteins. The central region of the cell in which prokaryotic DNA resides is called the nucleoid region. In addition, prokaryotes often have abundant plasmids, which are shorter, circular DNA molecules that may only contain one or a few genes. Plasmids can be transferred independently of the bacterial chromosome during cell division and often carry traits such as those involved with antibiotic resistance.

Պրոկարիոտներում (և էուկարիոտներում) տրանսկրիպցիան պահանջում է, որ ԴՆԹ-ի կրկնակի պարույրը մասամբ լուծարվի mRNA-ի սինթեզի շրջանում: Լիցքաթափման շրջանը կոչվում է տառադարձման փուչիկ: Transcription always proceeds from the same DNA strand for each gene, which is called the template strand. The mRNA product is complementary to the template strand and is almost identical to the other DNA strand, called the nontemplate strand, or the coding strand. The only nucleotide difference is that in mRNA, all of the T nucleotides are replaced with U nucleotides ((Figure)). ՌՆԹ կրկնակի պարույրում A- ն կարող է U- ն կապել երկու ջրածնային կապի միջոցով, ինչպես A -T- ի զուգակցումը ԴՆԹ -ի կրկնակի պարույրում:

Նկար 1. Messenger RNA is a copy of protein-coding information in the coding strand of DNA, with the substitution of U in the RNA for T in the coding sequence. However, new RNA nucleotides base pair with the nucleotides of the template strand. RNA is synthesized in its 5′-3′ direction, using the enzyme RNA polymerase. As the template is read, the DNA unwinds ahead of the polymerase and then rewinds behind it.

Նուկլեոտիդային զույգը ԴՆԹ -ի կրկնակի պարույրում, որը համապատասխանում է այն վայրին, որտեղից արտագրվում է առաջին 5 ′ mRNA նուկլեոտիդը, կոչվում է +1 տեղ, կամ սկզբնավորման վայր: Nucleotides preceding the initiation site are denoted with a “-” and are designated upstream nucleotides. Conversely, nucleotides following the initiation site are denoted with “+” numbering and are called downstream nucleotides.

Պրոկարիոտներում տառադարձման սկիզբը

Պրոկարիոտները թաղանթով փակ միջուկներ չունեն։ Հետևաբար, տրանսկրիպցիայի, թարգմանության և mRNA-ի քայքայման գործընթացները կարող են տեղի ունենալ միաժամանակ: The intracellular level of a bacterial protein can quickly be amplified by multiple transcription and translation events that occur concurrently on the same DNA template. Prokaryotic genomes are very compact, and prokaryotic transcripts often cover more than one gene or cistron (a coding sequence for a single protein). Polycistronic mRNAs are then translated to produce more than one kind of protein.

Մեր քննարկումն այստեղ կներկայացնի տառադարձության օրինակ՝ նկարագրելով այս գործընթացը Escherichia coli, a well-studied eubacterial species. Թեև որոշ տարբերություններ կան տառադարձման միջև E. coli և տառադարձություն արխեայում, հասկացություն E. coli տառադարձումը կարող է կիրառվել գործնականում բոլոր բակտերիալ տեսակների նկատմամբ:

Պրոկարիոտիկ ՌՆԹ պոլիմերազա

Պրոկարիոտներն օգտագործում են նույն ՌՆԹ պոլիմերազը՝ իրենց բոլոր գեները տառադարձելու համար։ Մեջ E. coli, պոլիմերազը կազմված է հինգ պոլիպեպտիդային ենթամիավորներից, որոնցից երկուսը նույնական են։ Այս ստորաբաժանումներից չորսը, նշվում են α, α, β, և β‘, comprise the polymerase core enzyme. Այս ենթամիավորները հավաքվում են ամեն անգամ, երբ գենը արտագրվում է, և դրանք ապամոնտաժվում են, երբ տրանսկրիպցիան ավարտվի: Յուրաքանչյուր ստորաբաժանում ունի այս երկուսի յուրահատուկ դերը α-ենթամիավորներն անհրաժեշտ են ԴՆԹ -ի վրա պոլիմերազը հավաքելու համար β-subunit binds to the ribonucleoside triphosphate that will become part of the nascent mRNA molecule and the β‘ subunit binds the DNA template strand. Հինգերորդ ստորաբաժանում, σ, ներգրավված է միայն տառադարձման մեկնարկի մեջ: Այն տալիս է տառադարձման յուրահատկություն այնպես, որ պոլիմերազը սկսում է սինթեզել mRNA- ն համապատասխան սկզբնավորման վայրից: Առանց σ, հիմնական ֆերմենտը կարող էր արտագրել պատահական վայրերից և կարտադրեր mRNA մոլեկուլներ, որոնք սահմանում էին սպիտակուցի խայթոցը: Բոլոր հինգ ստորաբաժանումներից բաղկացած պոլիմերազան կոչվում է հոլոենզիմ:

Պրոկարիոտ խթանողներ

A promoter is a DNA sequence onto which the transcription machinery, including RNA polymerase, binds and initiates transcription. Շատ դեպքերում խթանողները գոյություն ունեն իրենց կարգավորող գեների հոսանքին հակառակ: Պրոմոտորի հատուկ հաջորդականությունը շատ կարևոր է, քանի որ այն որոշում է, թե արդյոք համապատասխան գենը տառադարձվում է անընդհատ, որոշ ժամանակ կամ հազվադեպ: Although promoters vary among prokaryotic genomes, a few elements are evolutionarily conserved in many species. At the -10 and -35 regions upstream of the initiation site, there are two promoter consensus sequences, or regions that are similar across all promoters and across various bacterial species ((Figure)). The -10 sequence, called the -10 region, has the consensus sequence TATAAT. The -35 sequence has the consensus sequence TTGACA. These consensus sequences are recognized and bound by σ. Երբ այս փոխազդեցությունը կատարվի, հիմնական ֆերմենտի ստորաբաժանումները կապվում են տեղանքի հետ: A–T-ով հարուստ -10 շրջանը հեշտացնում է ԴՆԹ-ի կաղապարի լուծարումը, և առաջանում են մի քանի ֆոսֆոդիստերային կապեր: Տառադարձության մեկնարկի փուլն ավարտվում է վիժեցնող սղագրությունների արտադրությամբ, որոնք մոտ 10 նուկլեոտիդների պոլիմերներ են, որոնք պատրաստվում և թողարկվում են:

Figure 2. The σ subunit of prokaryotic RNA polymerase recognizes consensus sequences found in the promoter region upstream of the transcription start site. Ս – ի ստորաբաժանումը բաժանվում է պոլիմերազից ՝ տառադարձման սկսվելուց հետո:

Link to Learning

View this MolecularMovies animation to see the first part of transcription and the base sequence repetition of the TATA box.

Elongation and Termination in Prokaryotes

The transcription elongation phase begins with the release of the σ ենթամիավորը պոլիմերազից: -Ի տարանջատումը σ allows the core enzyme to proceed along the DNA template, synthesizing mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of approximately 40 nucleotides per second. Երկարացման ընթացքում ԴՆԹ-ն շարունակաբար արձակվում է առանցքային ֆերմենտից առաջ և պտտվում դրա հետևում: ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի միջև հիմքերի զուգավորումը բավականաչափ կայուն չէ mRNA սինթեզի բաղադրիչների կայունությունը պահպանելու համար: Փոխարենը, ՌՆԹ պոլիմերազը գործում է որպես կայուն կապող ԴՆԹ ձևանմուշի և նորածին ՌՆԹ թելերի միջև `երաշխավորելու, որ երկարաձգումը ժամանակից շուտ չի ընդհատվում:

Prokaryotic Termination Signals

Once a gene is transcribed, the prokaryotic polymerase needs to be instructed to dissociate from the DNA template and liberate the newly made mRNA. Կախված տառադարձվող գենից, կան երկու տեսակի դադարեցման ազդանշաններ. Մեկը սպիտակուցի վրա հիմնված է, իսկ մյուսը `ՌՆԹ-ի վրա: Rho-dependent termination is controlled by the rho protein, which tracks along behind the polymerase on the growing mRNA chain. Գենի վերջի մոտ պոլիմերազը հանդիպում է G նուկլեոտիդների քանակի ԴՆԹ-ի կաղապարի վրա և այն կանգ է առնում: Արդյունքում, rho սպիտակուցը բախվում է պոլիմերազի հետ: Rho- ի հետ փոխազդեցությունը mRNA- ն ազատում է տառադարձման պղպջակից:

Rho-independent termination is controlled by specific sequences in the DNA template strand. Երբ պոլիմերազը մոտենում է տրանսկրիպվող գենի ավարտին, այն հանդիպում է C–G նուկլեոտիդներով հարուստ շրջանի։ MRNA- ն հետ է ծալվում, իսկ լրացուցիչ C -G նուկլեոտիդները կապվում են միմյանց հետ: The result is a stable hairpin that causes the polymerase to stall as soon as it begins to transcribe a region rich in A–T nucleotides. MRNA տառադարձության լրացուցիչ U -A շրջանը ձևավորում է միայն թույլ փոխազդեցություն կաղապարային ԴՆԹ -ի հետ: Սա, զուգորդված կանգառում գտնվող պոլիմերազի հետ, առաջացնում է բավականաչափ անկայունություն, որպեսզի միջուկային ֆերմենտը պոկվի և ազատի նոր mRNA տառադարձումը:

Upon termination, the process of transcription is complete. By the time termination occurs, the prokaryotic transcript would already have been used to begin synthesis of numerous copies of the encoded protein because these processes can occur concurrently. The unification of transcription, translation, and even mRNA degradation is possible because all of these processes occur in the same 5′ to 3′ direction, and because there is no membranous compartmentalization in the prokaryotic cell ((Figure)). In contrast, the presence of a nucleus in eukaryotic cells precludes simultaneous transcription and translation.

Գծապատկեր 3: Բազմաթիվ պոլիմերազները կարող են տառադարձել մեկ բակտերիալ գեն, մինչդեռ բազմաթիվ ռիբոսոմներ միաժամանակ mRNA տեքստերը թարգմանում են պոլիպեպտիդների: Այս կերպ, կոնկրետ սպիտակուցը կարող է արագ հասնել բարձր կոնցենտրացիայի բակտերիալ բջիջում:

Link to Learning

Visit this BioStudio animation to see the process of prokaryotic transcription.

Section Summary

In prokaryotes, mRNA synthesis is initiated at a promoter sequence on the DNA template comprising two consensus sequences that recruit RNA polymerase. The prokaryotic polymerase consists of a core enzyme of four protein subunits and a σ protein that assists only with initiation. Elongation synthesizes mRNA in the 5′ to 3′ direction at a rate of 40 nucleotides per second. Termination liberates the mRNA and occurs either by rho protein interaction or by the formation of an mRNA hairpin.

Review Questions

Which subunit of the E. coli polymerase confers specificity to transcription?


Repression of HR

Recently, it has become clear that telomeres also need to be protected from inappropriate homologous recombination. There are three types of HR that have detrimental outcomes at chromosome ends. The first is homologous recombination between sister telomeres, referred to as Telomere Sister Chromatid Exchange (T-SCE). T-SCEs could be detrimental to cells if the exchanged sequences are not equal in length. One sister telomere could become lengthened at the expense of the other. The exchange between sister telomeres can be detected by chromosome-orientation fluorescent in situ hybridization (CO-FISH) (for review, see Bailey et al. 2004). In the CO-FISH method, newly synthesized DNA is degraded and the remaining parental strands are detected with single-stranded probes. At telomeres, one parental strand is composed of 5′-TTAGGG-3′ repeats and the other has only 5′-CCCTAA-3′ sequences, allowing the two strands to be distinguished in metaphase chromosomes. After semiconservative replication, each chromatid in a metaphase chromosome will have a G-strand signal at one end and a C-strand signal at the other. A chromatid end displaying both C-strand and G-strand signals indicates that a T-SCE event has occurred at this end. In normal mouse and human cells, T-SCE is not frequent, but ALT cells, which maintain their telomeres by a recombination pathway, have very frequent T-SCE (Bailey et al. 2004 Bechter et al. 2004 Londono-Vallejo et al. 2004). The difference may be that T-SCEs are normally repressed and that ALT cells have loosened their control of HR at telomeres, allowing them to maintain their telomeres and therefore to survive (for review, see Neumann and Reddel 2002).

A second HR reaction that threatens telomeres is referred to as t-loop HR (Wang et al. 2004) (Fig. 5). T-loops are at risk for resolution by Holliday junction (HJ) resolvases because an HJ could be formed if the 5′ end of the telomere base pairs with the displacement loop (D loop). Branch migration in the direction of the centromere could generate a double HJ and resolution of this structure with crossover would delete the whole loop segment, leaving a drastically shortened telomere at the chromosome end. T-loop HR was discovered through a separation of function mutant of TRF2, TRF2 ΔB , which protects telomeres from NHEJ but induces sudden telomere truncations. These deletions are dependent on two proteins implicated in HR, the Mre11 recombination repair complex and XRCC3, a Rad51 paralog associated with HJ resolution activity. Cells expressing TRF2 ΔB also contain extrachromosomal telomeric DNA that is circular. On two-dimensional gels, these circles show a broad size distribution consistent with their representing the loop part of the t-loops. How the N terminus of TRF2 represses t-loop HR has not been established. As unperturbed cells contain small amounts of circular telomeric DNA, suppression of the t-loop HR reaction at telomeres may be incomplete. The control of t-loop HR appears to be further relaxed in ALT cells, which contain abundant telomeric circles (Cesare and Griffith 2004 Wang et al. 2004). As T-SCE and t-loop HR are similar reactions (one taking place in cis, the other in տրանս), their prevalence in ALT cells may be due to loss of a repressor that controls both.

There may be a third type of HR with detrimental outcomes—the recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA. Chromosome internal telomeric DNA is not frequent in human cells, but in many other vertebrates, such sequences are abundant throughout the chromosomes. Recombination between telomeres and these elements could generate terminal deletions, extrachromosomal fragments, inversions, and translocations. This type of recombination appears to take place in mouse cells lacking ERCC1, which generate large extrachromosomal elements that contain a single stretch of telomeric DNA, presumably at a chromosome internal site (Zhu et al. 2003). These elements, referred to as Telomeric DNA-containing Double Minute chromosomes (TDMs) could be formed by recombination between a telomere and interstitial telomeric DNA on the same chromosome. Perhaps shelterin carries ERCC1/XPF is on its “tool-belt” to prevent inappropriate recombination events.


Հեղինակային տեղեկատվություն

Present address: The Institute for Genomic Research, 9712 Medical Center Drive, Rockville, Maryland, 20850, USA

L. Eichinger, J. A. Pachebat, G. Glöckner, M.-A. Rajandream and R. Sucgang: *These authors contributed equally to this work

Պատկանելություններ

Center for Biochemistry and Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, Joseph-Stelzmann-Str. 52, 50931, Cologne, Germany

L. Eichinger, J. A. Pachebat, B. Tunggal, F. Rivero, P. Farbrother & A. A. Noegel

Laboratory of Molecular Biology, MRC Centre, CB2 2QH, Cambridge, UK

J. A. Pachebat, S. Kummerfeld, M. Madera, B. A. Konfortov, A. T. Bankier, M. Madan Babu, A. Wardroper, R. R. Kay & P. H. Dear

Genome Analysis, Institute for Molecular Biotechnology, Beutenbergstr. 11, D-07745, Jena, Germany

G. Glöckner, K. Szafranski, R. Lehmann, M. Felder, A. Rosenthal & M. Platzer

The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK

M.-A. Rajandream, M. Berriman, N. Hamlin, R. Davies, D. Saunders, P. Davis, A. Kerhornou, N. Hall, N. Bason, C. Churcher, J. Cooper, A. Cronin, I. Goodhead, T. Mourier, A. Pain, D. Harper, H. Hauser, K. James, D. Johnson, A. Knights, K. Mungall, K. Oliver, C. Price, M. A. Quail, E. Rabbinowitsch, M. Sanders, S. Sharp, M. Simmonds, S. Spiegler, A. Tivey, B. White, D. Walker, J. Woodward & B. Barrell

Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

R. Sucgang, J. Song, G. Chen, X. Nie, L. Hemphill, B. Desany, M. Lu, R. Lindsay, J. Ma & A. Kuspa

Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Q. Xu, E. Sodergren, N. van Driessche, G. Shaulsky, G. Weinstock, R. Gibbs & A. Kuspa

Graduate Program in Structural and Computational Biology and Molecular Biophysics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

Human Genome Sequencing Center, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, USA

E. Sodergren, D. Muzny, M. Quiles, H. Loulseged, J. Hernandez, D. Steffen, G. Weinstock & R. Gibbs

Section of Cell and Developmental Biology, Division of Biology, University of California, La Jolla, California, 92093, San Diego, USA

R. Olsen, C. Anjard & W. F. Loomis

dictyBase, Center for Genetic Medicine, Northwestern University, 303 E Chicago Ave, Chicago, Illinois, 60611, USA

P. Gaudet, P. Fey, K. Pilcher, E. Just & R. L. Chisholm

Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, 305-8572, Japan

T. Morio, H. Urushihara & Y. Tanaka

Adolf-Butenandt-Institute/Cell Biology, Ludwig-Maximilians-University, 80336, Munich, Germany

Biochemistry Department, University of Cambridge, Cambridge, CB2 1QW, UK

Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Hokkaido University, 060-0810, Sapporo, Japan

Unité de Genomique des Microorganismes Pathogenes, Institut Pasteur, 28 rue du Dr Roux, 75724, Cedex 15, Paris, France

Department of Biology, University of York, York, YO10 5YW, UK

MRC Cancer Cell Unit, Hutchison/MRC Research Centre, Hills Road, CB2 2XZ, Cambridge, UK

Centre for Genetic Resource Information, National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka, 411-8540, Japan

Department of Medical Genome Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, Minato, Tokyo, 108-8639, Japan

Institut für Pharmazeutische Biologie, Universität Frankfurt (Biozentrum), 60439, Frankfurt am Main, Germany

Department of Molecular Biology, Princeton University, Princeton, New Jersey, 08544-1003, USA

School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH, UK


Դիտեք տեսանյութը: Որն է Փաշինյանի տարբերությունը Սերժ Սարգսյանից (Դեկտեմբեր 2021).