Տեղեկատվություն

Ի՞նչ է C-տերմինալ տրիպտիկ պեպտիդը:

Ի՞նչ է C-տերմինալ տրիպտիկ պեպտիդը:


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Մի կենսաբան ինձ գրեց.

… C- կամ N- տերմինալ,… Օրինակ, C-տերմինալ տրիպտիկ պեպտիդը, ինչպիսին AGWRGSDSHSR-ն է, կլինի…

Ես գաղափար չունեմ, թե դա ինչ է: Երբ ես Google-ում փնտրեցի տերմինը («C-terminal tryptic peptide»), ակնհայտ ոչինչ չհայտնվեց: Ինչ է դա? ԻնչուԱԳՎԵԳՍԴՇՍՌարդյոք «C-տերմինալ տրիպտիկ պեպտիդ է»:


Դա բավականին պարզ է, եթե նայեք հիմունքներին: Եկեք նայենք ձեր տված հաջորդականությանը.

ԱԳՎՌԳՍԴՇՍՌ

Գրեք դա 3 տառով1:

Ալա-Գլի-Տրփ-Արգ-Գլի-Սեր-Ասպ-Սեր-Հիս-Սեր-Արգ.

Ուշադրություն դարձրեք C-տերմինալին: Հերթականության վերջին ամինաթթվի մնացորդը Արգինինն է: Այժմ պարզ է, որ տրիպսինը կտրում է պոլիպեպտիդը հետո (այսինքն՝ դեպի C-տերմինալ կողմը) Լիզին և Արգինին2.

Այսպիսով, C-տերմինալ տրիպտիկ պեպտիդն այն պեպտիդն է, որը մնում է պոլիպեպտիդը Տրիպսինով մշակելուց հետո:


Եթե ​​ձեր թղթակիցը անջատված չէ (կամ ես չեմ), սա միանշանակորեն վերաբերում է պեպտիդին, որն ազատվում է պոլիպեպտիդի C-տերմինալ ծայրից տրիպտիկ մարսողության արդյունքում:

Սա նշանակում է, որ ձեր հաջորդականության վերջնական արգինինը կլիներ սկզբնական պոլիպեպտիդի C-վերջը, այլ ոչ թե տրիպսինի տրոհման վայրը: Դա նաև նշանակում է, որ ձեր հաջորդականությանը նախորդել է R կամ K-ն:


Սպիտակուցների փոխազդեցությունները Aβ-պեպտիդի C-վերնամասի և ֆոսֆոլիպազ A2-ի միջև՝ կառուցվածքի կենսաբանության վրա հիմնված մոտեցում՝ բացահայտելու նոր Ալցհեյմերի թերապևտիկ միջոցները

Ամիլոիդ β (Aβ) պոլիպեպտիդը առանցքային դեր է խաղում Ալցհեյմերի հիվանդության դեպքում սպիտակուցի ագրեգացիայի վիճակի որոշման գործում: Aβ պեպտիդի հիդրոֆոբ C-տերմինալ մասը կարևոր է α-պտուտակաձևից β-թերթային կառուցվածքի փոխակերպումը հրահրելու համար: Մենք ենթադրեցինք, որ ֆոսֆոլիպազ A2 (PLA2) կարող է արգելակել Aβ պեպտիդի ագրեգացումը՝ փոխազդելով պեպտիդի հետ և երկու պեպտիդային շղթաները իրարից հեռու պահելով: PLA2-ի և Aβ պեպտիդի միջև փոխազդեցությունների բնույթը ուսումնասիրելու համար մենք պատրաստեցինք և բյուրեղացրինք Naja naja sagittifera PLA2 համալիրը C-տերմինալ հեպտա-պեպտիդ Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-ի հետ: Ռենտգենյան ճառագայթների ինտենսիվության տվյալները հավաքվել են մինչև 2,04 Ա թույլատրելիություն, և կառուցվածքը որոշվել է մոլեկուլային փոխարինմամբ և զտվել մինչև 0,186 բյուրեղագրական R գործոնը: Կառուցվածքային վերլուծությունը ցույց տվեց, որ պեպտիդը կապվում է PLA2-ին հիդրոֆոբ սուբստրատի կապող խոռոչում՝ ձևավորելով առնվազն ութ ջրածնային կապ և մոտավորապես երկու տասնյակ Վան դեր Վաալսի փոխազդեցություն: Փոխազդեցությունների քանակը և բնույթը ցույց են տալիս, որ PLA2-ի և հեպտա-պեպտիդի միջև կապն ավելի մեծ է, քան երկու Aβ պեպտիդային շղթաների միջև կապը: Հետևաբար, PLA2-ն առաջարկվում է որպես հավանական լիգանդ՝ կանխելու Aβ պեպտիդների ագրեգացումը:


Սինթետիկ պեպտիդների կիրառությունները

Հիսունական և վաթսունական թվականներին պեպտիդների սինթեզի գյուտը խթանեց կիրառման տարբեր ոլորտների զարգացումը, որտեղ այժմ օգտագործվում են սինթետիկ պեպտիդներ, ներառյալ պաթոգեն սպիտակուցների դեմ էպիտոպային հատուկ հակամարմինների ստեղծումը, սպիտակուցների գործառույթների ուսումնասիրությունը և սպիտակուցների նույնականացումը և բնութագրումը: Ավելին, սինթետիկ պեպտիդներն օգտագործվում են ֆերմենտ-սուբստրատ փոխազդեցությունները ուսումնասիրելու համար կարևոր ֆերմենտային դասերի մեջ, ինչպիսիք են կինազները և պրոթեզերոնները, որոնք վճռորոշ դեր են խաղում բջիջների ազդանշանման մեջ:

Բջջային կենսաբանության մեջ ընկալիչների կապը կամ նոր հայտնաբերված ֆերմենտների սուբստրատի ճանաչման առանձնահատկությունը հաճախ կարելի է ուսումնասիրել՝ օգտագործելով հոմոլոգ սինթետիկ պեպտիդների հավաքածուներ: Սինթետիկ պեպտիդները կարող են նմանվել բնական պեպտիդներին և հանդես գալ որպես դեղամիջոց քաղցկեղի և այլ հիմնական հիվանդությունների դեմ: Ի վերջո, սինթետիկ պեպտիդները օգտագործվում են որպես չափորոշիչներ և ռեակտիվներ զանգվածային սպեկտրոմետրիայի (MS) վրա հիմնված ծրագրերում: Սինթետիկ պեպտիդները կենտրոնական դեր են խաղում MS-ի վրա հիմնված սպիտակուցների հայտնաբերման, բնութագրման և քանակականացման գործում, հատկապես նրանք, որոնք ծառայում են որպես հիվանդությունների վաղ կենսամարկեր:

Իմացեք ավելին

Ընտրեք ապրանքներ


Պեպտիդներ. սահմանում, կառուցվածք և սինթեզ

Պեպտիդը բաղկացած է երկու կամ ավելի ամինաթթուներից, որոնք կապված են պեպտիդային կապով, որը ձևավորվում է մի ամինաթթվի կարբոքսիլ խմբի և մյուսի ամինաթթվի միջև՝ պեպտիդային կապի ընթացքում մեկ մոլ ջրի հեռացմամբ:

Պոլիպեպտիդները ձևավորվում են երկար պեպտիդային շղթաներով, որոնք պարունակում են մեծ քանակությամբ պեպտիդային կապեր։ Մինչև 100 ամինաթթուների պոլիմերները կոչվում են պոլիպեպտիդներ, իսկ 100-ից ավելին՝ սովորաբար սպիտակուցներ:

2. Պեպտիդների առաջնային կառուցվածքը:

Ամինաթթուների հաջորդականությունը պոլիպեպ և շիտիդում կոչվում է նրա առաջնային կառուցվածք: Առաջնային կառուցվածքը որոշելու համար պահանջվում են քիմիական մեթոդներ:

Ֆիզիկական տեխնիկան, ինչպիսին է ռենտգենյան բյուրեղագրությունը և ամաչկոտությունը, օգտագործվում են սպիտակուցային կառուցվածքի և շերտավորման ավելի բարձր կարգի համար:

N-տերմինալ (ամինո տերմինալ) ամինաթթուն միշտ ցուցադրվում է ձախ կողմում, իսկ C-տերմինալը (ավտոմեքենա և շիբոքսիլ տերմինալ) ամինաթթուն պոլիպեպտիդային շղթայի աջ կողմում:

Նույնիսկ սպիտակուցների առաջնային կառուցվածքի փոքր փոփոխությունները կարող են առաջացնել ուշագրավ ֆիզիոլոգիական ազդեցություն:

100 կամ ավելի ամինաթթուներից բաղկացած հաջորդականությամբ մեկ ամինաթթվի փոխարինումը մեկ այլ ամինաթթվի փոխարեն կարող է վերացնել կենսաբանական ակտիվությունը լուրջ հետևանքներով և հետևանքներով (օրինակ՝ մանգաղ բջջային հիվանդություն):

Բազմաթիվ ժառանգական մետաբոլիկ հիվանդությունների կենսաքիմիական հիմքերը հայտնի են սպիտակուցի կառուցվածքի և խտության որոշման նոր քիմիական և ֆիզիկական մեթոդների ներդրման շնորհիվ:

3. Պեպտիդների առաջնային կառուցվածքի որոշում.

Ա. Պեպտիդները մաքրվում են վերլուծությունից առաջ:

ես Մաքրման դասական պրոցեդուրաները ներառում են տեղումներ աղի տարբեր կոնցենտրացիաներով (ամոնիում կամ նատրիումի սուլֆատ) կամ լուծիչներ (ացետոն կամ էթանոլ), տարբեր և շիտալային ցենտրիֆուգացիա, գելային ֆիլտրացիա և էլեկ&շիտրոֆորեզ:

2. Ցելյուլոզային անիոնափոխանակիչ դիէթիլամինոէթիլ (DEAE) ցելյուլոզից և կատիոնափոխանակիչ կարբոքսիմեթիլ ցել&շիլուլոզից (CMC) պրո&շիտեինների ընտրովի կլանումը և էլյուցիան նույնպես չափազանց հաջող են եղել սպիտակուցի չափից ավելի և արագ մաքրման և շիկացման համար,

Բ. Ամինաթթվի Գ-ի որոշումբաղադրություն:

ես Ամինաթթուների մնացորդները կապող պեպտիդային կապը սկզբում կոտրվում են հիդրոլիզով:

ii. Ազատված ամինաթթուներն այնուհետև տարանջատվում են և հայտնաբերվում HPLC-ով կամ իոնային ex­change քրոմատագրմամբ:

Գ. Պոլիպեպտիդների հաջորդականության որոշումը Սանգերի կողմից:

ես Sanger’-ի մոտեցումն էր նախ առանձնացնել ինսու&շիլինի երկու A և B պոլիպեպտիդային շղթաները, այնուհետև դրանք հատուկ ֆերմենտային կտրվածքով վերածել ավելի փոքր պեպտիդների, որոնք պարունակում էին համընկնող se­quence շրջաններ:

Օգտագործելով 1 ֆտորո-2, 4-դինիտրոբենզոլ, նա այնուհետև հեռացրեց և հայտնաբերեց այս պեպտիդների ամինաթթուների տերմինալային մնացորդները, ուստի նա կարողացավ պարզել առաջնային միանշանակ կառուցվածքը և՛ A, և՛ B շղթաների համար:

Դ. Առաջնային կառուցվածքները որոշվում են ավտոմատացված Էդմանի տեխնիկայով:

ես Քանի որ շատ սպիտակուցներ բաղկացած են մեկից ավելի պոլիպեպտիդային շղթայից՝ կապված ոչ կովալենտային ուժերի կամ դիսուլֆիդային կամուրջների հետ: Առանձին պոլիպեպտիդ շղթաները տարանջատելու և առանձնացնելու առաջին քայլը:

ii. Դենատուրացնող նյութերը (ուրա, գուանիդինի հիդրո&շիքլորիդ) խաթարում են ջրածնային կապերը և անջատում ոչ կովալենտային կապակցված պոլիպեպտիդները:

iii. Օքսիդացնող և վերականգնող նյութերը խախտում են դիսուլֆիդային կամուրջները: Այնուհետև պոլիպեպտիդները բաժանվում են քրոմատագրման միջոցով:

iv Այս ավտոմատացված տեխնիկայում Էդմանի ռեագենտը ֆենիլիզոթիոցիանատ է: Re­action հաջորդականությունը թողարկում է ամինաթթուների և շինալային ամինաթթուները որպես ֆենիլթիոհիդանտոինի ածանցյալ, որն այնուհետև նույնականացվում է HPLC-ով:

v. Հաջորդ ամինաթթուն հաջորդականությամբ այնուհետև ածանցավորվում և հեռացվում է, այնուհետև գործընթացը կրկնվում է:

vi. Էդմանի ռեակցիաները տեղի են ունենում կա՛մ բարակ թաղանթում պտտվող գավաթի ռեակցիայի խցիկի պատի վրա, կա՛մ պինդ մատրիցայի վրա, որին pep­tide-ի կարբոքսիլային տերմինալը կովալենտորեն միացված է:

E. Խոշոր պոլիպեպտիդները մաքրվում են նախքան հաջորդականացումը:

ես Ավտոմատացված հաջորդականության գործիքները ամենաարդյունավետ են գործում 20-60 մնացորդ ունեցող պոլիպեպտիդների վրա: Հետևաբար, ցանկալի է առանձնահատուկ և զգալի ճեղքվածք համեմատաբար հազվադեպ վայրերում:

Հետևյալ ռեակտիվները բավարարում են այս պահանջը.

4. Պեպտիդների սինթեզ.

Պեպտիդները կարող են սինթեզվել ակտիվացված կարբոքսիլ խմբի միջև, ինչպիսին է մեկ ամինաթթվի թթվային քլո և շիրիդը և an­other-ի ամինո խումբը, օրինակ՝ ցիստեին թթվի քլորիդը և լիզինը:

Պեպտիդային կապի ձևավորումից հետո բլոկ և ամաչող խումբը հանվում է՝ թողնելով ցանկալի պեպտիդը:

5. Ֆիզիոլոգիապես ակտիվ պեպտիդներ.

ես Որոշ դեպքերում դրանք հիմք են հանդիսանում սպիտակուցների արդյունահանման համար:

ii. Մյուսներում դրանք կարող են լինել հորմոններ, հակաբիոտիկներ, բակտերիաների բջիջների պատերի պրեկուրսորներ կամ նույնիսկ հզոր թույներ:

iii. Լայնորեն տարածված տրիպեպտիդ գլուտաթ և շիոնը անհրաժեշտ է մի քանի ֆերմենտների, այդ թվում՝ ինսուլինի գործողության համար: Գլուտատիոն ռեդուկտազը գործում է կա՛մ ինսուլինի մակարդակի և շիռադիացիայի կամ դիսուլֆիդային կապերի ձևավորման մեջ:

iv Բնական այլ կարևոր պեպտիդներ են Բրադիկինինը և Կալիդինը, որոնք հարթ մկանների հիպոթենզիվ նյութեր են, որոնք ազատվում են պլազմայի հատուկ սպիտակուցներից՝ օձի թույնով բուժելով:


Բովանդակություն

Հաճախ ցանկալի է իմանալ սպիտակուցի անկանոն ամինաթթուների կազմը նախքան պատվիրված հաջորդականությունը գտնելը, քանի որ այդ գիտելիքը կարող է օգտագործվել հաջորդականության գործընթացում սխալների հայտնաբերումը հեշտացնելու կամ ոչ միանշանակ արդյունքները տարբերելու համար: Որոշ ամինաթթուների հաճախականության մասին գիտելիքները կարող են օգտագործվել նաև՝ ընտրելու համար, թե որ պրոթեզերան օգտագործել սպիտակուցը մարսելու համար: Կարելի է նաև որոշել ոչ ստանդարտ ամինաթթուների (օրինակ՝ նորլեյցին) ցածր մակարդակների սխալ ներածումը սպիտակուցների մեջ: [1] Ընդհանրացված մեթոդ, որը հաճախ կոչվում է ամինաթթուների վերլուծություն [2] ամինաթթուների հաճախականությունը որոշելու համար հետևյալն է.

  1. Հիդրոլիզացրեք սպիտակուցի հայտնի քանակությունը նրա բաղկացուցիչ ամինաթթուների մեջ:
  2. Առանձնացրեք և քանակականորեն որոշեք ամինաթթուները:

Հիդրոլիզ Խմբագրել

Հիդրոլիզը կատարվում է սպիտակուցի նմուշը 6 Մ աղաթթվի մեջ մինչև 100–110 °C տաքացնելով 24 ժամ կամ ավելի երկար։ Շատ մեծածավալ հիդրոֆոբ խմբերով սպիտակուցները կարող են պահանջել ավելի երկար տաքացման ժամանակաշրջաններ: Այնուամենայնիվ, այս պայմաններն այնքան ուժեղ են, որ որոշ ամինաթթուներ (սերին, թրեոնին, թիրոզին, տրիպտոֆան, գլուտամին և ցիստեին) քայքայվում են: Այս խնդիրը շրջանցելու համար Biochemistry Online-ը առաջարկում է տարբեր ժամանակներով տաքացնել առանձին նմուշներ, վերլուծել յուրաքանչյուր ստացված լուծումը և վերադարձնել զրոյական հիդրոլիզի ժամանակ: Ռաստալն առաջարկում է մի շարք ռեակտիվներ՝ կանխելու կամ նվազեցնելու դեգրադացիան, ինչպիսիք են թիոլային ռեակտիվները կամ ֆենոլը, որոնք պաշտպանում են տրիպտոֆանը և թիրոզինը քլորի և նախաօքսիդացող ցիստեինի հարձակումից: Նա նաև առաջարկում է չափել առաջացած ամոնիակի քանակը՝ ամիդային հիդրոլիզի չափը որոշելու համար։

Տարանջատում և քանակականացում Խմբագրել

Ամինաթթուները կարելի է առանձնացնել իոնափոխանակման քրոմատագրման միջոցով, այնուհետև ածանցավորվել՝ դրանց հայտնաբերումը հեշտացնելու համար: Ավելի հաճախ, ամինաթթուները ածանցավորվում են, այնուհետև լուծվում են հակադարձ փուլային HPLC-ով:

Իոնափոխանակման քրոմատագրության օրինակը տրված է NTRC-ի կողմից՝ օգտագործելով սուլֆոնացված պոլիստիրոլը որպես մատրիցա՝ ավելացնելով ամինաթթուները թթվային լուծույթում և սյունակի միջով անցնելով կայուն աճող pH-ի բուֆեր: Ամինաթթուները լուծվում են, երբ pH-ը հասնում է իրենց համապատասխան իզոէլեկտրական կետերին: Երբ ամինաթթուները բաժանվում են, դրանց համապատասխան քանակները որոշվում են՝ ավելացնելով ռեագենտ, որը կձևավորի գունավոր ածանցյալ: Եթե ​​ամինաթթուների քանակը գերազանցում է 10 նմոլը, ապա դրա համար կարելի է օգտագործել նինհիդրին, որը պրոլինի հետ արձագանքելիս տալիս է դեղին գույն, իսկ այլ ամինաթթուների հետ՝ վառ մանուշակագույն: Ամինաթթվի կոնցենտրացիան համաչափ է ստացված լուծույթի կլանմանը: Շատ փոքր քանակությամբ, մինչև 10 pmol, լյումինեսցենտային ածանցյալներ կարող են ձևավորվել ռեակտիվների միջոցով, ինչպիսիք են օրթո-ֆթալդեհիդը (OPA) կամ ֆտորեսկամինը:

Նախասյունակային դերիվատացումը կարող է օգտագործել Էդմանի ռեագենտը՝ ածանցյալ արտադրելու համար, որը հայտնաբերվում է ուլտրամանուշակագույն լույսի միջոցով: Ավելի մեծ զգայունություն է ձեռք բերվում օգտագործելով ռեագենտ, որը առաջացնում է լյումինեսցենտային ածանցյալ: Ածանցյալ ամինաթթուները ենթարկվում են հակադարձ փուլային քրոմատոգրաֆիայի՝ սովորաբար օգտագործելով C8 կամ C18 սիլիցիումի սյունակ և օպտիմիզացված էյուցիոն գրադիենտ: Լվացող ամինաթթուները հայտնաբերվում են ուլտրամանուշակագույն կամ ֆլուորեսցենտային դետեկտորի միջոցով և գագաթնակետային տարածքները համեմատած ածանցյալ ստանդարտների հետ՝ նմուշի յուրաքանչյուր ամինաթթու քանակականացման համար:

Որոշել, թե որ ամինաթթուն է ձևավորում Ն- Պեպտիդային շղթայի վերջնակետը օգտակար է երկու պատճառով՝ օգնելու առանձին պեպտիդային բեկորների հաջորդականությունների դասավորությանը մի ամբողջ շղթայի մեջ, և քանի որ Էդմանի քայքայման առաջին փուլը հաճախ աղտոտված է կեղտերով և, հետևաբար, չի տալիս ճշգրիտ որոշումը: Ն- տերմինալ ամինաթթու. Ընդհանրացված մեթոդ Ն- տերմինալ ամինաթթուների վերլուծությունը հետևյալն է.

  1. Արձագանքեք պեպտիդին ռեագենտով, որն ընտրողաբար կնշի վերջնական ամինաթթուն:
  2. Հիդրոլիզացրեք սպիտակուցը:
  3. Որոշել ամինաթթուները քրոմատագրման միջոցով և համեմատել ստանդարտների հետ:

Կան բազմաթիվ տարբեր ռեագենտներ, որոնք կարող են օգտագործվել վերջնական ամինաթթուները պիտակավորելու համար: Նրանք բոլորն արձագանքում են ամին խմբերի հետ և, հետևաբար, նաև կկապվեն ամինային խմբերի հետ ամինաթթուների կողային շղթաներում, ինչպիսին է լիզինը, այդ իսկ պատճառով անհրաժեշտ է զգույշ լինել քրոմատոգրամների մեկնաբանության մեջ՝ ապահովելու ճիշտ կետի ընտրությունը: Առավել տարածված ռեակտիվներից երկուսն են Սանգերի ռեագենտ (1-fluoro-2,4-dinitrobenzene) և dansyl ածանցյալներ, ինչպիսիք են dansyl քլորիդը: Ֆենիլիսոթիոցիանատը՝ Էդմանի քայքայման ռեագենտը, կարող է օգտագործվել նաև: Այստեղ կիրառվում են նույն հարցերը, ինչ ամինաթթուների բաղադրության որոշման դեպքում, բացառությամբ, որ ոչ մի բիծ չի պահանջվում, քանի որ ռեակտիվները արտադրում են գունավոր ածանցյալներ և պահանջվում է միայն որակական վերլուծություն: Այսպիսով, ամինաթթուն պետք չէ քրոմատոգրաֆիայի սյունակից զտել, պարզապես համեմատած ստանդարտի հետ: Մեկ այլ նկատառում, որը պետք է հաշվի առնել, այն է, որ, քանի որ ցանկացած ամինային խումբ արձագանքել է պիտակավորող ռեագենտին, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիան չի կարող օգտագործվել, փոխարենը պետք է օգտագործվի բարակ շերտով կամ բարձր ճնշման հեղուկ քրոմատոգրաֆիան:

C-տերմինալ ամինաթթուների վերլուծության համար մատչելի մեթոդների թիվը շատ ավելի փոքր է, քան N-տերմինալ վերլուծության առկա մեթոդների թիվը: Ամենատարածված մեթոդը սպիտակուցի լուծույթին կարբոքսիպեպտիդազներ ավելացնելն է, կանոնավոր ընդմիջումներով նմուշներ վերցնելը և վերջնական ամինաթթվի որոշումը՝ ամինաթթուների կոնցենտրացիաների սյուժեն վերլուծելով ժամանակի համեմատ: Այս մեթոդը շատ օգտակար կլինի պոլիպեպտիդների և սպիտակուցներով արգելափակված N վերջնակետերի դեպքում։ C-տերմինալի հաջորդականությունը մեծապես կօգնի ստուգել ԴՆԹ-ի հաջորդականություններից կանխատեսված սպիտակուցների առաջնային կառուցվածքները և հայտնաբերել կոդոնների հայտնի հաջորդականություններից գենային արտադրանքի ցանկացած հետթարգմանական մշակում:

Էդմանի քայքայումը շատ կարևոր ռեակցիա է սպիտակուցների հաջորդականության համար, քանի որ այն թույլ է տալիս հայտնաբերել սպիտակուցի պատվիրված ամինաթթուների կազմը: Էդմանի ավտոմատացված հաջորդականիչներն այժմ լայն տարածում ունեն և ի վիճակի են դասավորել մինչև մոտավորապես 50 ամինաթթու երկարությամբ պեպտիդներ: Էդմանի դեգրադացիայի միջոցով սպիտակուցի հաջորդականացման ռեակցիայի սխեման հետևում է որոշ քայլերի, որոնք հետագայում մշակված են:

  1. Սպիտակուցի բոլոր դիսուլֆիդային կամուրջները կոտրեք այնպիսի վերականգնող նյութով, ինչպիսին 2-մերկապտոէթանոլն է: Պաշտպանիչ խումբ, ինչպիսին է յոդաքացախաթթուն, կարող է անհրաժեշտ լինել կապերի վերակազմավորումը կանխելու համար:
  2. Առանձնացրեք և մաքրեք սպիտակուցային համալիրի առանձին շղթաները, եթե դրանք մեկից ավելի են:
  3. Որոշեք յուրաքանչյուր շղթայի ամինաթթուների բաղադրությունը:
  4. Որոշեք յուրաքանչյուր շղթայի վերջնական ամինաթթուները:
  5. Յուրաքանչյուր շղթա բաժանեք 50 ամինաթթուների երկարությամբ բեկորների:
  6. Առանձնացրեք և մաքրեք բեկորները:
  7. Որոշեք յուրաքանչյուր հատվածի հաջորդականությունը:
  8. Կրկնեք ճեղքվածքի այլ ձևով:
  9. Կառուցեք ընդհանուր սպիտակուցի հաջորդականությունը:

Մարսումը պեպտիդային բեկորների մեջ Խմբագրել

Մոտ 50-70 ամինաթթուներից ավելի երկար պեպտիդները չեն կարող հուսալիորեն հաջորդականացվել Էդմանի քայքայմամբ: Դրա պատճառով երկար սպիտակուցային շղթաները պետք է բաժանվեն փոքր բեկորների, որոնք այնուհետև կարող են առանձին հերթագրվել: Մարսումը կատարվում է կամ էնդոպեպտիդազների միջոցով, ինչպիսիք են տրիպսինը կամ պեպսինը, կամ քիմիական ռեակտիվների միջոցով, ինչպիսին է ցիանոգենի բրոմիդը: Տարբեր ֆերմենտներ տալիս են տարանջատման տարբեր ձևեր, և բեկորների միջև համընկնումը կարող է օգտագործվել ընդհանուր հաջորդականություն կառուցելու համար:

Ռեակցիայի խմբագրում

Պեպտիդը, որը պետք է հաջորդականացվի, ներծծվում է ամուր մակերեսի վրա: Ընդհանուր ենթաշերտը ապակե մանրաթելն է, որը պատված է պոլիբրենով՝ կատիոնային պոլիմերով: Էդմանի ռեագենտը՝ ֆենիլիզոթիոցիանատը (PITC), ավելացվում է կլանված պեպտիդին՝ 12% տրիմեթիլամինի մեղմ հիմնային բուֆերային լուծույթի հետ միասին: Սա արձագանքում է N-տերմինալ ամինաթթվի ամինային խմբի հետ:

Վերջնական ամինաթթուն այնուհետև կարող է ընտրովի անջատվել անջուր թթվի ավելացման միջոցով: Այնուհետև ածանցյալը իզոմերիանում է և տալիս է փոխարինված ֆենիլթիոհիդանտոին, որը կարող է լվանալ և նույնականացնել քրոմատոգրաֆիայի միջոցով, և ցիկլը կարող է կրկնվել: Յուրաքանչյուր քայլի արդյունավետությունը կազմում է մոտ 98%, ինչը թույլ է տալիս հուսալիորեն որոշել մոտ 50 ամինաթթուներ:

Protein sequencer Խմբագրել

Ա սպիտակուցային սեկվենատոր [3] մեքենա է, որն ավտոմատացված եղանակով կատարում է Էդմանի դեգրադացիան։ Սպիտակուցի կամ պեպտիդի նմուշն անշարժացվում է սպիտակուցի սեկվենատորի ռեակցիայի անոթում և կատարվում է Էդմանի դեգրադացիա։ Յուրաքանչյուր ցիկլ սպիտակուցից կամ պեպտիդից ազատում և ածանցավորում է մեկ ամինաթթու Ն- վերջնակետը և ազատված ամինաթթվի ածանցյալը այնուհետև նույնականացվում է HPLC-ով: Հերթականավորման գործընթացը կրկնվում է ամբողջ պոլիպեպտիդի համար, մինչև հաստատվի ամբողջ չափելի հաջորդականությունը կամ նախապես որոշված ​​թվով ցիկլեր:

Սպիտակուցի նույնականացումը հետաքրքրության սպիտակուցին (POI) անուն տալու գործընթաց է՝ հիմնվելով նրա ամինաթթուների հաջորդականության վրա: Սովորաբար, սպիտակուցի հաջորդականության միայն մի մասը պետք է փորձարարական որոշվի՝ սպիտակուցը նույնականացնելու համար՝ հղում անելով նրանց գեների ԴՆԹ-ի հաջորդականություններից ստացված սպիտակուցային հաջորդականությունների տվյալների բազաներին: Սպիտակուցների հետագա բնութագրումը կարող է ներառել POI-ի իրական N- և C-վերջնականների հաստատում, հաջորդականության տարբերակների որոշում և ցանկացած հետթարգմանական փոփոխությունների նույնականացում:

Proteolytic digests Խմբագրել

Նկարագրված է սպիտակուցի նույնականացման ընդհանուր սխեման: [4] [5]

  1. POI-ն մեկուսացված է սովորաբար SDS-PAGE կամ քրոմատագրման միջոցով:
  2. Մեկուսացված POI-ը կարող է քիմիապես ձևափոխվել՝ ցիստեինի մնացորդները կայունացնելու համար (օրինակ՝ S-ամիդոմեթիլացում կամ S-կարբոքսիմեթիլացում):
  3. POI-ը մարսվում է հատուկ պրոթեզերոնով` պեպտիդներ առաջացնելու համար: Տրիպսինը, որն ընտրովիորեն ճեղքվում է լիզինի կամ արգինինի մնացորդների C-տերմինալ կողմում, ամենատարածված պրոթեզերոնն է: Դրա առավելությունները ներառում են i) սպիտակուցներում Lys և Arg մնացորդների հաճախականությունը, ii) ֆերմենտի բարձր սպեցիֆիկությունը, iii) ֆերմենտի կայունությունը և iv) տրիպտիկ պեպտիդների համապատասխանությունը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի համար:
  4. Պեպտիդները կարող են աղազերծվել իոնացնող աղտոտիչները հեռացնելու համար և ենթարկվել MALDI-TOF զանգվածային սպեկտրաչափության: Պեպտիդների զանգվածի ուղղակի չափումը կարող է բավարար տեղեկատվություն տրամադրել սպիտակուցը նույնականացնելու համար (տես Պեպտիդային զանգվածի մատնահետք), սակայն զանգվածային սպեկտրոմետրի ներսում պեպտիդների հետագա մասնատումը հաճախ օգտագործվում է պեպտիդների հաջորդականությունների մասին տեղեկություններ ստանալու համար։ Որպես այլընտրանք, պեպտիդները կարող են աղազերծվել և առանձնացվել հակադարձ փուլային HPLC-ով և ներմուծվել զանգվածային սպեկտրոմետր ESI աղբյուրի միջոցով: LC-ESI-MS-ը կարող է ավելի շատ տեղեկատվություն տրամադրել, քան MALDI-MS-ը սպիտակուցի նույնականացման համար, սակայն օգտագործում է ավելի շատ գործիքային ժամանակ:
  5. Կախված զանգվածային սպեկտրոմետրի տեսակից, պեպտիդային իոնների մասնատումը կարող է տեղի ունենալ մի շարք մեխանիզմների միջոցով, ինչպիսիք են Բախման հետևանքով առաջացած տարանջատումը (CID) կամ Հետաղբյուրի քայքայումը (PSD): Յուրաքանչյուր դեպքում պեպտիդի բեկորային իոնների օրինաչափությունը տեղեկատվություն է տալիս դրա հաջորդականության մասին։
  6. Այնուհետև տեղեկատվությունը, ներառյալ ենթադրյալ պեպտիդային իոնների և դրանց հատվածի իոնների չափված զանգվածը, համընկնում է հաշվարկված զանգվածի արժեքների հետ կոնցեպտուալ (in-silico) պրոտեոլիզից և սպիտակուցային հաջորդականությունների տվյալների բազաների մասնատումից: Հաջող համընկնում կգտնվի, եթե դրա միավորը գերազանցի վերլուծության պարամետրերի վրա հիմնված շեմը: Նույնիսկ եթե իրական սպիտակուցը ներկայացված չէ տվյալների բազայում, սխալների նկատմամբ հանդուրժող համընկնումը թույլ է տալիս ենթադրյալ նույնականացնել սպիտակուցը՝ հիմնված հոմոլոգ սպիտակուցների նմանության վրա: Այս վերլուծությունը կատարելու համար հասանելի են մի շարք ծրագրային փաթեթներ:
  7. Ծրագրային փաթեթները սովորաբար ստեղծում են հաշվետվություն, որը ցույց է տալիս յուրաքանչյուր հայտնաբերված սպիտակուցի ինքնությունը (միացման կոդը), դրա համապատասխանության միավորը և ապահովում է համապատասխանության հարաբերական ուժի չափում, որտեղ մի քանի սպիտակուցներ են նույնականացվում:
  8. Նույնականացված սպիտակուցի հաջորդականության վրա համընկնող պեպտիդների դիագրամը հաճախ օգտագործվում է հաջորդականության ծածկույթը ցույց տալու համար (որպես պեպտիդ հայտնաբերված սպիտակուցի տոկոսը): Այն դեպքում, երբ POI-ն էականորեն փոքր է, քան համապատասխան սպիտակուցը, դիագրամը կարող է ցույց տալ, թե արդյոք POI-ը նույնացված սպիտակուցի N- կամ C-տերմինալ հատված է:

De novo հաջորդականություն Խմբագրել

Պեպտիդի մասնատման օրինաչափությունը թույլ է տալիս ուղղակիորեն որոշել դրա հաջորդականությունը դե նորո հաջորդականություն. Այս հաջորդականությունը կարող է օգտագործվել սպիտակուցային հաջորդականությունների տվյալների բազաներին համապատասխանեցնելու կամ հետթարգմանական կամ քիմիական փոփոխությունները հետաքննելու համար: Այն կարող է լրացուցիչ ապացույցներ տրամադրել սպիտակուցի նույնականացման համար, որոնք կատարվել են վերևում:

N- և C- վերջավորություններ Խմբագրել

Սպիտակուցի նույնականացման ընթացքում համապատասխանեցված պեպտիդները պարտադիր չէ, որ ներառում են համապատասխանող սպիտակուցի համար կանխատեսված N- կամ C-վերջինները: Սա կարող է պայմանավորված լինել այն պատճառով, որ N- կամ C-տերմինալ պեպտիդները դժվար է նույնականացնել MS-ով (օրինակ՝ չափազանց կարճ կամ չափազանց երկար), հետթարգմանական ձևափոխված (օրինակ՝ N-տերմինալ ացետիլացում) կամ իսկապես տարբերվում են կանխատեսումից: Հետթարգմանական փոփոխությունները կամ կտրված վերջավորությունները կարող են բացահայտվել տվյալների ավելի մանրակրկիտ ուսումնասիրությամբ (այսինքն. դե նորո հաջորդականություն): Կրկնվող մարսողությունը՝ օգտագործելով տարբեր առանձնահատկությունների պրոթեզերոն, կարող է նաև օգտակար լինել:

Հետթարգմանական փոփոխություններ Խմբագրել

Մինչդեռ MS տվյալների մանրամասն համեմատությունը սպիտակուցի հայտնի հաջորդականության վրա հիմնված կանխատեսումների հետ կարող է օգտագործվել հետթարգմանական փոփոխությունները սահմանելու համար, կարող են օգտագործվել նաև տվյալների հավաքագրման նպատակային մոտեցումներ: Օրինակ, ֆոսֆոպեպտիդների հատուկ հարստացումը կարող է օգնել սպիտակուցի մեջ ֆոսֆորիլացման վայրերի հայտնաբերմանը: Զանգվածային սպեկտրոմետրում պեպտիդների մասնատման այլընտրանքային մեթոդները, ինչպիսիք են ETD կամ ECD, կարող են տալ լրացուցիչ տեղեկատվություն հաջորդականության մասին:

Ամբողջ զանգվածի որոշում Խմբագրել

Սպիտակուցի ամբողջ զանգվածը նրա ամինաթթուների մնացորդների զանգվածների գումարն է գումարած ջրի մոլեկուլի զանգվածը և ճշգրտված ցանկացած հետթարգմանական փոփոխությունների համար: Թեև սպիտակուցները իոնացվում են ավելի քիչ լավ, քան դրանցից ստացված պեպտիդները, լուծույթում գտնվող սպիտակուցը կարող է ենթարկվել ESI-MS-ի և դրա զանգվածը չափվել 20,000-ից 1 մաս կամ ավելի ճշգրտությամբ: Սա հաճախ բավարար է վերջնակետերը հաստատելու համար (հետևաբար, սպիտակուցի չափված զանգվածը համընկնում է դրա հաջորդականությունից կանխատեսվածին) և եզրակացնելու բազմաթիվ հետթարգմանական փոփոխությունների առկայությունը կամ բացակայությունը:

Սահմանափակումներ Խմբագրել

Պրոտեոլիզը միշտ չէ, որ տալիս է հեշտությամբ վերլուծվող պեպտիդների մի շարք, որոնք ընդգրկում են POI-ի ամբողջ հաջորդականությունը: Պեպտիդների մասնատումը զանգվածային սպեկտրոմետրում հաճախ չի տալիս իոններ, որոնք համապատասխանում են ճեղքմանը յուրաքանչյուր պեպտիդային կապում: Այսպիսով, յուրաքանչյուր պեպտիդի համար ստացված հաջորդականությունը պարտադիր չէ, որ ամբողջական լինի: Ֆրագմենտացիայի ստանդարտ մեթոդները չեն տարբերում լեյցինի և իզոլեյցինի մնացորդները, քանի որ դրանք իզոմեր են:

Քանի որ Էդմանի դեգրադացիան առաջանում է սպիտակուցի N-վերջնամասից, այն չի աշխատի, եթե N-վերջը քիմիական ձևափոխված է (օրինակ՝ ացետիլացմամբ կամ պիրոգլուտամիկ թթվի ձևավորմամբ): Էդմանի դեգրադացիան հիմնականում օգտակար չէ դիսուլֆիդային կամուրջների դիրքերը որոշելու համար: Այն նաև պահանջում է 1 պիկոմոլի կամ ավելի պեպտիդների քանակություն տեսանելի արդյունքների համար, ինչը այն դարձնում է ավելի քիչ զգայուն, քան զանգվածային սպեկտրոմետրիան:

Կենսաբանության մեջ սպիտակուցներն արտադրվում են սուրհանդակային ՌՆԹ-ի (mRNA) թարգմանությամբ՝ սպիտակուցային հաջորդականությամբ, որը բխում է mRNA-ի կոդոնների հաջորդականությունից: mRNA-ն ինքնին ձևավորվում է գեների տրանսկրիպցիայի արդյունքում և կարող է հետագայում փոփոխվել: Այս գործընթացները բավականաչափ հասկացված են համակարգչային ալգորիթմների օգտագործման համար՝ ավտոմատացնելու սպիտակուցային հաջորդականությունների կանխատեսումները ԴՆԹ-ի հաջորդականություններից, օրինակ՝ ամբողջ գենոմի ԴՆԹ-ի հաջորդականության նախագծերից, և հանգեցրել են սպիտակուցային հաջորդականությունների մեծ տվյալների բազաների ստեղծմանը, ինչպիսին է UniProt-ը: Կանխատեսված սպիտակուցային հաջորդականությունները զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով սպիտակուցների նույնականացման կարևոր ռեսուրս են:

Պատմականորեն, Էդմանի դեգրադացիայի միջոցով որոշված ​​կարճ սպիտակուցային հաջորդականությունները (10-ից 15 մնացորդներ) հետադարձաբար թարգմանվել են ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների, որոնք կարող են օգտագործվել որպես զոնդեր կամ պրայմերներ՝ համապատասխան գենի կամ լրացուցիչ ԴՆԹ-ի մոլեկուլային կլոնները մեկուսացնելու համար: Այնուհետև որոշվեց կլոնավորված ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը և օգտագործվեց սպիտակուցի ամբողջական ամինաթթուների հաջորդականությունը պարզելու համար:

Կենսաինֆորմատիկական գործիքներ կան՝ օգնելու զանգվածային սպեկտրների մեկնաբանմանը (տես De novo պեպտիդների հաջորդականությունը), համեմատելու կամ վերլուծելու սպիտակուցային հաջորդականությունները (տես Հերթականության վերլուծություն), կամ տվյալների բազաները որոնելու համար՝ օգտագործելով պեպտիդ կամ սպիտակուցային հաջորդականություն (տես BLAST):


Բովանդակություն

Յուրաքանչյուր ամինաթթու ունի կարբոքսիլ խումբ և ամին խումբ: Ամինաթթուները միմյանց հետ կապվում են ջրազրկման ռեակցիայի միջոցով շղթա կազմելու համար, որը միացնում է մեկ ամինաթթվի ամինային խումբը հաջորդի կարբոքսիլ խմբին: Այսպիսով, պոլիպեպտիդային շղթաներն ունեն ծայր՝ չկապված կարբոքսիլային խմբով՝ C- վերջնամասով, և վերջ՝ չկապված ամինային խմբով՝ N- վերջնամասով: Բնականաբար, սպիտակուցները սինթեզվում են՝ սկսած N-վերջից և ավարտվում C-վերջին:

C-տերմինալի պահպանման ազդանշաններ Խմբագրել

Թեև սպիտակուցի N-վերջնամասը հաճախ պարունակում է թիրախային ազդանշաններ, C-տերմինալը կարող է պարունակել սպիտակուցների տեսակավորման պահպանման ազդանշաններ: ER-ի պահպանման ամենատարածված ազդանշանը ամինաթթուների հաջորդականությունն է՝ -KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) կամ -HDEL (His-Asp-Glu-Leu) C-վերջում: Սա պահպանում է սպիտակուցը էնդոպլազմիկ ցանցում և թույլ չի տալիս այն մտնել արտազատման ուղի:

C-տերմինալի փոփոխություններ Խմբագրել

Սպիտակուցների C-վերջը կարող է փոփոխվել հետթարգմանական եղանակով, ամենից հաճախ՝ C-վերջին լիպիդային խարիսխի ավելացմամբ, որը թույլ է տալիս սպիտակուցը մտցնել մեմբրանի մեջ՝ առանց տրանսմեմբրանային տիրույթ ունենալու:

Prenylation Խմբագրել

C-տերմինալի փոփոխության ձևերից մեկը պրենիլացումն է: Պրենիլացման ժամանակ ֆարնեսիլ- կամ գերանիլգերանիլ-իզոպրեոիդային թաղանթային խարիսխը ավելացվում է ցիստեինի մնացորդին C-վերնամասի մոտ: Փոքր, թաղանթով կապված G սպիտակուցները հաճախ փոփոխվում են այս կերպ:

GPI խարիսխներ Խմբագրել

C-տերմինալի փոփոխության մեկ այլ ձև է ֆոսֆոգլիկանի՝ գլիկոզիլֆոսֆատիդիլինոզիտոլի (GPI) ավելացումը՝ որպես թաղանթային խարիսխ: GPI խարիսխը կցվում է C-տերմինալին C-տերմինալ պրոպեպտիդի պրոտեոլիտիկ կտրվածքից հետո: Այս տեսակի փոփոխության ամենաակնառու օրինակը պրիոն սպիտակուցն է:

C-տերմինալ տիրույթ Խմբագրել

Որոշ սպիտակուցների C-տերմինալ տիրույթն ունի մասնագիտացված գործառույթներ։ Մարդկանց մոտ ՌՆԹ պոլիմերազ II-ի CTD-ն սովորաբար բաղկացած է Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser հաջորդականության մինչև 52 կրկնություններից: [1] Սա թույլ է տալիս այլ սպիտակուցներին միանալ ՌՆԹ պոլիմերազի C-տերմինալ տիրույթին, որպեսզի ակտիվացնեն պոլիմերազային ակտիվությունը։ Այս տիրույթներն այնուհետև ներգրավված են ԴՆԹ-ի տրանսկրիպցիայի մեկնարկին, ՌՆԹ-ի տրանսկրիպտի փակմանը և ՌՆԹ-ի միացման համար սպլայսոզոմին միանալուն: [2]


Լրացուցիչ Նկար 1 LysargiNase-ի, տրիփսինի և LysN բաց թողնված ճեղքերի բնութագրում:

(ա) LysargiNase-ում և տրիպսինով հայտնաբերված պեպտիդների համամասնությունը MDA-MB-231 բջիջների լիզատներում, որոնք կրում են 0, 1, 2 կամ 3 բաց թողնված տրոհման տեղամասեր՝ օգտագործելով ֆերմենտային հատուկ կարգավորումները պեպտիդ-հաջորդականության համապատասխանության համար: Ցույց են տալիս IceLogos (բ) եզակի տրոհման տեղամասեր, որոնք ենթադրվում են LysargiNase-ում կամ տրիպսինով մարսված MDA-MB-231 պրոտեոմներում (այս ուսումնասիրություն) կամ Lys-N մարսված HEK293 բջիջների լիզատներում հայտնաբերված պեպտիդներից, որոնք հայտնաբերված են Raijmakers et al. 12 և (գ, դ) հաջորդականության համատեքստը, որը շրջապատում է բաց թողնված LysargiNase-ի կամ տրիպսինի տրոհման վայրերը Arg-ում կամ Lys-ում և բաց թողնված Lys-N-ի ճեղքման վայրերը Lys-ում: Ցուցադրված են առաջացման զգալի տարբերություններ (Պ < 0.05) համեմատ (բ,գ) բնական ամինաթթուների առատությունը մարդու պրոտեոմում և (դ) յուրաքանչյուր ֆերմենտի համար հայտնաբերված հատուկ ճեղքման վայրեր:

Լրացուցիչ Նկար 2 LysargiNase-ի ակտիվությունը սովորական պրոտեոմիկայի պայմաններում և լուծույթներում և տարբեր ջերմաստիճաններում:

LysargiNase-ի ակտիվությունը որոշվել է 30 րոպե ինկուբացիայից հետո ռեզորուֆինի պիտակավորված կազեինով (ֆերմենտ:սուբստրատի հարաբերակցությունը 1:400 w/w) 37 °C-ում 50 մՄ HEPES, 10 մՄ CaCl-ում:2, pH 7,5 ավելացված նշված կոնցենտրացիաներով (ա) NaCl և նվազեցնող նյութեր DTT և TCEP, (բ) օրգանական լուծիչներ մեթանոլ (MeOH) և ացետոնիտրիլ (ACN), (գ) մաքրող միջոց RapiGest TM և միզանյութի դենատուրացնող կոնցենտրացիաները և (դ) դենատորացնող քաոտրոպիկ նյութերի միզանյութը միայն թիուրիայով և գուանիդինով: Վերահսկիչ պայմաններում ինկուբացիայի միջև տարբերության նշանակությունը փորձարկվել է երկկողմանի Student's t-թեստով (n = 3, * էջ < 0.05): (ե) Մարդու MDA-MB-231 բջիջների լիզատի անավարտ LysargiNase մարսումը 37 °C ջերմաստիճանում ֆերմենտներով սահմանափակ պայմաններում (ֆերմենտ:proteome 1:100 w/w), որպեսզի մաքրող միջոցների առկայության դեպքում պրոտեոմի մարսման տարբերությունները կիսաքանակական կերպով վերահսկվեն, օրգանական լուծիչներ և վերականգնող նյութեր: Նկատի ունեցեք, որ վերականգնող նյութերի առկայության դեպքում ֆերմենտային ակտիվությունը վերականգնվում է հանգցնելով ալկիլացնող ռեագենտ յոդոացետամիդով (IAM), որը ավելացվում է կրճատումից հետո: (է) LysargiNase-ի ակտիվությունը գնահատվել է 30 րոպե ինկուբացիայից հետո ռեզորուֆինի պիտակավորված կազեինի սուբստրատով (ֆերմենտ:սուբստրատ հարաբերակցությունը 1:400 w/w) 50 մՄ Hepes, 10 մՄ CaCl-ում:2, pH 7,5 նշված ջերմաստիճաններում։ 25 °C-ում ինկուբացիայի միջև տարբերության նշանակությունը փորձարկվել է երկկողմանի ուսանողական t-թեստի միջոցով (n = 6, * էջ < 0.05): (ժ) Մարդու MDA-MB-231 բջիջների լիզատների համեմատությունը LysargiNase-ի հետ տարբեր ֆերմենտ:պրոտեոմ հարաբերակցությամբ 37 °C և 50 °C ջերմաստիճանում:

Լրացուցիչ Նկար 3 MALDI-TOF-ի վրա հիմնված էկզոպեպտիդազի ակտիվության վերլուծություն սինթետիկ պեպտիդներով:

Սինթետիկ պեպտիդներ (ա) RGPANL↓KGR, (բ) RGISEVNLDAEF↓RH, և (գ) RGPANLIG↓R-ն օգտագործվել է LysargiNase-ի տրի-, դի- և մոնո-կարբոքսիպեպտիդազային ակտիվությունը համապատասխանաբար գնահատելու համար: Պեպտիդները վերլուծվել են MALDI-TOF զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով գիշերային ինկուբացիայից հետո (w/w 50:1 աջ վահանակներով) և առանց (ձախ վահանակներ) LysargiNase: RGPANLIG↓R-ի տրոհման արդյունքը հետագայում վերլուծվել է MALDI TOF/TOF տանդեմ զանգվածային սպեկտրոմետրի միջոցով՝ բացահայտելով մասնատման սպեկտրը, որտեղ գերակշռում են b-շարքի իոնները՝ նշանավոր արգինին b1 իոնով (m/z 157) և առանց արգինինի y1 իոն (m/): z 175), բացառելով ամինոպեպտիդազային ակտիվությունը (ցուցադրված չէ):

Լրացուցիչ Նկար 4 MALDI-TOF-ի վրա հիմնված էկզոպեպտիդազի ակտիվության վերլուծություն:

(ա) Օգտագործվել է տրիպտիկ BSA մարսողություն (բ) վերլուծություն LysargiNase ամինո- և կարբոքսիպեպտիդազային գործունեության համար: Ամինոպեպտիդազային ակտիվություն չի նկատվել, սակայն երկու պեպտիդներ (m/z 689.3260 և 1439.8773, նշված են կապույտով) 10 տրիպտիկ BSA պեպտիդներից C-տերմինալ մշակվել են՝ ցույց տալով արգինիլ-կարբոքսիպեպտիդազի փոքր ակտիվությունը: Դիտարկվել է LysargiNase աուտոլիտիկ պեպտիդ (REMPMPR, m/z 916.3680 նշված է սևով):

Լրացուցիչ Նկար 5 Խոզի β-կազեինի և BSA-ի գելային մարսումները:

Պեպտիդները, որոնք բացահայտվել են LC-MS/MS-ով, օգտագործելով ճառագայթային տիպի CID, տավարի բետա-կազեինի գելային մարսումից հետո (ա) LysargiNase կամ (բ) տրիպսին և տավարի շիճուկի ալբումին (գ) LysargiNase կամ (դ) տրիպսին. Peptides identified by Mascot database searches are highlighted in red, Mascot protein identification score and sequence coverage are indicated.

Supplementary Figure 6 Complementarity of LysargiNase and trypsin in shotgun proteomics.

(ա) Box plots of the ratios of b-type to y-type fragment ions observed in 8,463 ion trap CID peptide spectrum matches for trypsin and 5,474 for LysargiNase (FDR < 0.01). The centerlines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend to the 5th and 95th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference was tested using the two-tailed Student’s t-test (*** Պ & lt 0.001): (բ) Overlap of peptide sequences identified after trypsin or LysargiNase cleavage of proteomes. For comparison, N- or C-terminal basic residues were removed from the peptide sequences identified from LysargiNase and trypsin datasets, respectively.

Supplementary Figure 7 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of identical basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 8 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of varying basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 9 Effect of a-ion fragments on spectral quality and Comet XCORR scores.

(ա) Beam-type CID MS/MS spectra of the LysargiNase peptide RLLVDCYSPVE (top panel) and corresponding tryptic peptide LLVDCYSPVER (bottom panel). The tryptic peptide exhibits strong and extensive y-type fragment ions whereas the LysargiNase-derived peptide exhibits strong b-type and a-type fragment ions. (բ) Increase in Comet XCORR score by inclusion of a-type fragment ions during peptide-to-sequence matching of beam-type CID fragmentation spectra, plotted as % increase. Inclusion of a-type fragment ions increased scores for LysargiNase-derived peptides by 33% (left panel), significantly stronger than for tryptic peptides (right panel), where scores increased only by 15% (Պ < 0.0001, two sided Student’s տ-test, one of two replicates shown). Notably, inclusion of a-type fragment ions did not affect the number of identifications, solely their confidence.

Supplementary Figure 10 Protein C-terminal peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

(a-f) Selected exemplary ion trap CID peptide fragmentation spectra matched to protein C-terminal peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 11 LysargiNase and trypsin facilitate identification of different phosphorylation motifs in phosphoproteomics.

(ա) Phosphorylation motifs identified by motif-x and their prevalence among high confidence phosphopeptides, with a localization probability > 0.75 identified by MaxQuant at an FDR < 0.01 from trypsin and LysargiNase-digested human MDA-MB-231 cell lysates (*Պ & lt 0.05, **Պ & lt 0.01, ***Պ < 0.001, two-tailed Student’s t-test). (բ) Match of kinase specificity with identified phosphorylation motifs as extracted from the human protein reference database (HRDB). (գ) Relative change in abundance of phosphorylation motifs following stimulation by 12-Օ-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA) for 5 and 20 min.

Supplementary Figure 12 Examples of corresponding phosphosites identified both in LysargiNase and tryptic digests of MDA-MB-231 cell lysates.

(a-e) Selected ion-trap CID spectra from LysargiNase generated peptides (left panels) show stronger b-type fragment ions series and generated higher Andromeda scores and higher phosphosite localization probabilities than corresponding spectra from tryptic peptides (right panels). Within each peptide sequence phosphosite localization probabilities are enclosed within brackets to the right of each modified residue. Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 13 Monomethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (ա-գ) mono-methylated Lys or (d-f) mono-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 14 Dimethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (a, b) di-methylated Lys or (c-f) di-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 15 LysargiNase facilitates identification of peptides with methylated and dimethylated arginine and lysine residues.

(ա) Structural model depicting a possible interaction between a dimethylated lysine side chain and the LysargiNase S1' pocket. This model is based on the experimental crystal structure of the enzyme with an arginine-valine dipeptide occupying the S1‘ and S2‘ positions (pdb access code 2CKI 13 ). (բ) Peptides with methylated or dimethylated arginine and lysine as a proportion of all peptides identified in shotgun proteomics analysis of human MDA-MB-231 cell lysates using ion trap CID fragmentation (n = 4): White, tryptic digests grey, LysargiNase digests. Center lines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference between LysargiNase and trypsin datasets was tested with two-tailed Student’s t-test (* էջ & lt 0.05, *** էջ & lt 0.001):


Type or paste the sequence of a peptide and click “Analyze”. The tool can auto-detect most formats of single-letter and three-letter amino acid sequences (e.g., EQKLISEEDL, Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu), or you can specify which format you input. Multiple sequences can be analyzed at a time by entering or pasting each sequence on a separate line. Multiple sequences must be in the same format.

Sequence 0

Analyzed sequence

Sequence length
Հիդրոֆոբություն
GRAVY
MW average
MW monoisotopic
Տեսական pI

Some amino acids(Q, E(N-term), C, M, W, N, P, D) are less stable than others and are prone to side reactions. These reactions may occur even under our stringent production conditions. The final peptide yield is the sum of the product and the peptide that has undergone side reactions. Once the sum of the corresponding peaks in analytical HPLC reaches the requested purity, the peptide is shipped. While the total purity stays constant, the ratio of product and byproduct may change over time.

Synthesis/Purification

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Duis non venenatis ipsum. Aliquam in justo pretium, finibus nibh non, laoreet sem. Integer consequat et magna at vestibulum. Quisque eget tempus risus. Quisque efficitur velit nisl, condimentum blandit neque elementum eget.

SRM/MRM Compatibility

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Duis non venenatis ipsum. Aliquam in justo pretium, finibus nibh non, laoreet sem. Integer consequat et magna at vestibulum. Quisque eget tempus risus. Quisque efficitur velit nisl, condimentum blandit neque elementum eget.

Note: This analysis tool does not support any peptide modifications and sequences shorter than 4 amino acids. The quality of this analysis may be significantly affected if the input sequence is longer than 25 amino acids. To assess and optimize peptides for antigenicity and other properties relating to antibody production, use the Antigen Profiler Peptide Tool.


Supplementary files

C-Terminal lactamization of peptides

N. H. Fischer, D. S. Nielsen, D. Palmer, M. Meldal and F. Diness, Քիմ. կոմուն., 2021, 57, 895 DOI: 10.1039/D0CC06018F

To request permission to reproduce material from this article, please go to the Copyright Clearance Center request page.

Եթե ​​դու ես an author contributing to an RSC publication, you do not need to request permission provided correct acknowledgement is given.

Եթե ​​դու ես the author of this article, you do not need to request permission to reproduce figures and diagrams provided correct acknowledgement is given. If you want to reproduce the whole article in a third-party publication (excluding your thesis/dissertation for which permission is not required) please go to the Copyright Clearance Center request page.


Supplementary Figure 1 Characterization of LysargiNase, trypsin and LysN missed cleavages.

(ա) Proportion of peptides identified in LysargiNase and trypsin digests of MDA-MB-231 cell lysates carrying 0, 1, 2 or 3 missed cleavage sites using enzyme-specific settings for peptide-to-sequence matching. IceLogos showing (բ) unique cleavage sites, inferred from both ends of peptides identified in LysargiNase or trypsin-digested MDA-MB-231 proteomes (this study) or from peptides identified in Lys-N digested HEK293 cell lysates reported by Raijmakers et al. 12 and (գ, դ) the sequence context surrounding missed LysargiNase or trypsin cleavage sites at Arg or Lys and missed Lys-N cleavages sites at Lys. Shown are significant differences in occurrence (Պ < 0.05) as compared to (բ,գ) the natural amino acid abundance in the human proteome and (դ) specific cleavage sites identified for each enzyme.

Supplementary Figure 2 LysargiNase activity in common proteomics conditions and solutions and at different temperatures.

LysargiNase activity was assayed after 30 min incubation with resorufin-labeled casein (enzyme:substrate ratio 1:400 w/w) at 37 °C in 50 mM HEPES, 10 mM CaCl2, pH 7.5 with added indicated concentrations of (ա) NaCl and reducing agents DTT and TCEP, (բ) organic solvents methanol (MeOH) and acetonitrile (ACN), (գ) the detergent RapiGest TM and denaturing concentrations of urea and (դ) denaturing chaotropic agents urea with thiourea and guanidine alone. Significance of difference to incubation at control conditions was tested with two-tailed Student’s t-test (n = 3, * էջ < 0.05): (ե) Incomplete LysargiNase digestion of human MDA-MB-231 cell lysate at 37 °C under enzyme-limited conditions (enzyme:proteome 1:100 w/w) so as to semi-quantitatively monitor differences in proteome digest in the presence of detergents, organic solvents and reducing agents. Note that enzymatic activity in the presence of reducing agents is restored by quenching with the alkylating reagent iodoacetamide (IAM) added after reduction. (է) LysargiNase activity assayed after 30 min incubation with resorufin-labeled casein substrate (enzyme:substrate ratio 1:400 w/w) in 50 mM Hepes, 10 mM CaCl2, pH 7.5 at the indicated temperatures. Significance of difference to incubation at 25 °C was tested with two-tailed Student’s t-test (n = 6, * էջ < 0.05): (ժ) Comparison of human MDA-MB-231 cell lysates digestion with LysargiNase at different enzyme:proteome ratios at 37 °C and 50 °C.

Supplementary Figure 3 MALDI-TOF–based exopeptidase activity assay with synthetic peptides.

The synthetic peptides (ա) RGPANL↓KGR, (բ) RGISEVNLDAEF↓RH, and (գ) RGPANLIG↓R were used to assay tri-, di- and mono-carboxypeptidase activities of LysargiNase, respectively. Peptides were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry after over-night incubation with (w/w 50:1 right panels) and without (left panels) LysargiNase. The cleavage product of RGPANLIG↓R was subsequently analyzed using a MALDI TOF/TOF tandem mass spectrometer, revealing a fragmentation spectrum dominated by b-series ions with a prominent arginine b1 ion (m/z 157) and no arginine y1 ion (m/z 175), ruling out aminopeptidase activity (not shown).

Supplementary Figure 4 MALDI-TOF–based exopeptidase activity assay.

(ա) A tryptic BSA digest was used to (բ) assay LysargiNase for amino- and carboxypeptidase activities. No aminopeptidase activity was observed, but two peptides (m/z 689.3260 and 1439.8773, indicated in blue) out of 10 tryptic BSA peptides were C-terminally processed indicating minor arginyl-carboxypeptidase activity. A LysargiNase autolytic peptide was observed (REMPMPR, m/z 916.3680 indicated in black).

Supplementary Figure 5 In-gel digests of bovine β-casein and BSA.

Peptides identified by LC-MS/MS using beam-type CID after in-gel digestion of bovine beta-casein with (ա) LysargiNase or (բ) trypsin and bovine serum albumin with (գ) LysargiNase or (դ) trypsin. Peptides identified by Mascot database searches are highlighted in red, Mascot protein identification score and sequence coverage are indicated.

Supplementary Figure 6 Complementarity of LysargiNase and trypsin in shotgun proteomics.

(ա) Box plots of the ratios of b-type to y-type fragment ions observed in 8,463 ion trap CID peptide spectrum matches for trypsin and 5,474 for LysargiNase (FDR < 0.01). The centerlines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend to the 5th and 95th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference was tested using the two-tailed Student’s t-test (*** Պ & lt 0.001): (բ) Overlap of peptide sequences identified after trypsin or LysargiNase cleavage of proteomes. For comparison, N- or C-terminal basic residues were removed from the peptide sequences identified from LysargiNase and trypsin datasets, respectively.

Supplementary Figure 7 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of identical basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 8 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of varying basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 9 Effect of a-ion fragments on spectral quality and Comet XCORR scores.

(ա) Beam-type CID MS/MS spectra of the LysargiNase peptide RLLVDCYSPVE (top panel) and corresponding tryptic peptide LLVDCYSPVER (bottom panel). The tryptic peptide exhibits strong and extensive y-type fragment ions whereas the LysargiNase-derived peptide exhibits strong b-type and a-type fragment ions. (բ) Increase in Comet XCORR score by inclusion of a-type fragment ions during peptide-to-sequence matching of beam-type CID fragmentation spectra, plotted as % increase. Inclusion of a-type fragment ions increased scores for LysargiNase-derived peptides by 33% (left panel), significantly stronger than for tryptic peptides (right panel), where scores increased only by 15% (Պ < 0.0001, two sided Student’s տ-test, one of two replicates shown). Notably, inclusion of a-type fragment ions did not affect the number of identifications, solely their confidence.

Supplementary Figure 10 Protein C-terminal peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

(a-f) Selected exemplary ion trap CID peptide fragmentation spectra matched to protein C-terminal peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 11 LysargiNase and trypsin facilitate identification of different phosphorylation motifs in phosphoproteomics.

(ա) Phosphorylation motifs identified by motif-x and their prevalence among high confidence phosphopeptides, with a localization probability > 0.75 identified by MaxQuant at an FDR < 0.01 from trypsin and LysargiNase-digested human MDA-MB-231 cell lysates (*Պ & lt 0.05, **Պ & lt 0.01, ***Պ < 0.001, two-tailed Student’s t-test). (բ) Match of kinase specificity with identified phosphorylation motifs as extracted from the human protein reference database (HRDB). (գ) Relative change in abundance of phosphorylation motifs following stimulation by 12-Օ-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA) for 5 and 20 min.

Supplementary Figure 12 Examples of corresponding phosphosites identified both in LysargiNase and tryptic digests of MDA-MB-231 cell lysates.

(a-e) Selected ion-trap CID spectra from LysargiNase generated peptides (left panels) show stronger b-type fragment ions series and generated higher Andromeda scores and higher phosphosite localization probabilities than corresponding spectra from tryptic peptides (right panels). Within each peptide sequence phosphosite localization probabilities are enclosed within brackets to the right of each modified residue. Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 13 Monomethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (ա-գ) mono-methylated Lys or (d-f) mono-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 14 Dimethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (a, b) di-methylated Lys or (c-f) di-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 15 LysargiNase facilitates identification of peptides with methylated and dimethylated arginine and lysine residues.

(ա) Structural model depicting a possible interaction between a dimethylated lysine side chain and the LysargiNase S1' pocket. This model is based on the experimental crystal structure of the enzyme with an arginine-valine dipeptide occupying the S1‘ and S2‘ positions (pdb access code 2CKI 13 ). (բ) Peptides with methylated or dimethylated arginine and lysine as a proportion of all peptides identified in shotgun proteomics analysis of human MDA-MB-231 cell lysates using ion trap CID fragmentation (n = 4): White, tryptic digests grey, LysargiNase digests. Center lines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference between LysargiNase and trypsin datasets was tested with two-tailed Student’s t-test (* էջ & lt 0.05, *** էջ & lt 0.001):