Տեղեկատվություն

Կարո՞ղ է արդյոք սպիտակուցի նմուշը պատրաստել 2% Triton X-100 անվճար:

Կարո՞ղ է արդյոք սպիտակուցի նմուշը պատրաստել 2% Triton X-100 անվճար:


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Սպիտակուցը, որը ես մաքրում եմ, կարիք ուներ 2% Triton X-100 լուծույթի բուֆերի: Ես ձևակերպեցի էլյուցիոն բուֆերը՝ հաշվի չառնելով CMC-ն: Իմ նպատակն է իմ սպիտակուցային նմուշի տրիտոնը դարձնել անվճար՝ ստուգելու դրա կայունությունը և քանակականացնելու դրա կոնցենտրացիան: Վերջերս ես իմացա, որ միցելները կարող են քայքայվել նոսրացման ժամանակ: Այսպիսով, ես նոսրացրել եմ իմ սպիտակուցի նմուշը triton-ի CMC-ից ցածր և փորձել եմ այն ​​կենտրոնացնել Sartorius Vivaspin 5K (PES խեժ) օգտագործելով: Ես լցրեցի 500 մլ նոսրացված նմուշ և մնաց 100 մլ կոնցենտրացիայից հետո՝ օգտագործելով vivaspin: Բայց այս նմուշը 3 OD-ից ավելի աննորմալ ցուցանիշ է տվել այն բանից հետո, երբ այն փակվել է բուֆերի վրա, որտեղ գտնվում է: Կարծում եմ, որ տրիտոնի միջամտությունն առաջացնում է այս անհամապատասխան ընթերցումները:


Զիմոգրաֆիա

Անդրե Զյուգ,. Եվգենի Պոնիմասկին, առաջընթաց ուղեղի հետազոտության մեջ, 2014 թ

3.5 Զիմոգրաֆիկ անալիզներ

Զիմոգրաֆիան ցանկացած տեխնիկա է, որը կարող է օգտագործվել ցանկացած կենսաբանական նմուշի վրա գործող հիդրոլազների ազդեցությունը ուսումնասիրելու համար: Այսպիսով, կախված ենթաշերտից, զիմոգրաֆիկ անալիզները կարող են օգտագործել օրգանական մոլեկուլներ, այդ թվում՝ պեպտիդներ, լիպիդներ և նուկլեինաթթուներ՝ հայտնաբերելով, ի թիվս այլոց, պրոտեազներ, լիպազներ և նուկլեազներ: Այս գլուխը կկենտրոնանա զիմոգրաֆիկ անալիզների վրա, որոնք նախատեսված են պրոթեզերոնի հայտնաբերման համար: Այնուամենայնիվ, քանի որ հայտնի է, որ ECM-ը պարունակում է բարձր գլիկոզիլացված սպիտակուցներ, կարելի է պատկերացնել, որ գլիկոզիլազների ակտիվությունը հայտնաբերող զիմոգրաֆիկ մեթոդները կարող են օգտագործվել նաև ECM-ի վերափոխումը ուսումնասիրելու համար:

Կարևոր է նշել, որ հստակ տարբերություն կա զիմոգրաֆիկ անալիզների և նախկինում նկարագրված ECM կտրվածքի վիզուալիզացիայի մեթոդների միջև, ինչը պետք է մշտապես հիշել: Զիմոգրաֆիան, ընդհանուր առմամբ, չի պատկերացնում ECM ճեղքումն ինքնին, այլ հաղորդում է հատուկ պրոթեզերոնի ակտիվության մասին, որոնք գործում են ECM-ի վրա: Այդ գործողությունից կարելի է եզրակացնել ECM-ի վերափոխումը, բայց չի կարող ուղղակիորեն արտացոլվել:

Vandooren et al.-ի վերջին ակնարկը: (2013) առանձնացնում է զիմոգրաֆիայի երեք տեսակ. գելի մեջ զիմոգրաֆիա, ISZ, և in vivo զիմոգրաֆիա (IVZ): Այնուամենայնիվ, մի քանի գենետիկորեն կոդավորված կենսասենսորներ, որոնք հիմնված են լյումինեսցենտային սպիտակուցների վրա, չեն կարող պատշաճ կերպով դասակարգվել Վանդորինի և այլոց կողմից բացահայտված զիմոգրաֆիայի տեսակներից որևէ մեկի մեջ: Գելի մեջ զիմոգրաֆիան դուրս է այս գլխի շրջանակներից: ISZ-ը կարող է օգտագործվել պրոտեոլիտիկ ակտիվությունը պատկերացնելու համար սուր կամ նրբորեն ամրացված հյուսվածքների հատվածների մակերեսին: IVZ-ը հիմնված է, այսպես կոչված, պրոտեոլիտիկ փարոսների (PBs) վրա, որոնք ունեն տարբեր առանձնահատկություններ պրոթեզերոնի նկատմամբ, որոնք ներարկվում են կենդանի կենդանիների մեջ (և այդպիսով պետք է լինեն ոչ թունավոր) և տեսանելի են՝ օգտագործելով ինչ-որ տեսակի in vivo մանրադիտակային համակարգ.

ISZ-ի ամենատարածված ձևը օգտագործում է DQ-ժելատին և այդպիսով հայտնաբերում է MMP-2 և MMP-9 ժելատինոլիտիկ ակտիվությունը: Պետք է զգույշ լինել, որպեսզի պրոտեոլիտիկ ակտիվությունը չքայքայվի նմուշի պատրաստման ժամանակ, բայց նաև, որ ISZ արձանագրության ընթացքում զիմոգենները արհեստականորեն չակտիվանան: Սովորաբար, այս նախազգուշացումները ISZ-ին սահմանափակում էին կա՛մ սուր, կա՛մ սառեցված և չֆիքսված նմուշներով, ինչը խիստ սահմանափակում էր ISZ-ով հասանելի լուծումը: Gawlak et al. (2009) հաղորդում է, սակայն, որ մեղմ ամրացումը էթանոլ-մեթանոլ խառնուրդով և նմուշի հետագա մոմի ներկառուցումը թույլ է տալիս պահպանել նմուշի նուրբ կառուցվածքային մանրամասները ժելատինոլիտիկ ակտիվության հետ մեկտեղ: Ժելատինոլիտիկ ակտիվություն արձանագրվել է բջջային մարմնում (ներառյալ միջուկները) և նեյրոնների գործընթացներում և գլիալ բջիջներում (օլիգոդենդրոցիտներ, աստրոցիտներ և միկրոգլիաներ): Հեղինակները կարողացան նաև հաստատել, որ ժելատինոլիտիկ ակտիվության օջախները համակցված են գրգռիչ գլուտամատերգիկ սինապսների ենթախմբի հետ՝ ապացուցելով, որ հրապարակված ISZ արձանագրությունը պահպանում է բջիջների կառուցվածքի ուլտրակառուցվածքային մանրամասները:

IVZ-ը հնարավորություն է տալիս տեղայնացնել պրոտեոլիտիկ ակտիվությունը կենդանի օրգանիզմում՝ պրոտեոլիտիկ ակտիվացված PB-ների օգտագործման միջոցով: PB-ն բաժանվում է երկու կատեգորիայի՝ մեկը հիմնված է որոշակի ֆտորոֆորների ինքնամարվող հատկությունների վրա, իսկ մյուսը օգտագործում է FRET: Օրինակ, Բոզդագին և այլք. (2007) ներարկեց DQ-ժելատին ուրեթանով անզգայացած առնետների հիպոկամպուսում՝ ուսումնասիրելու MMP-9-ի դերը հասուն հիպոկամպային սինապտիկ ֆիզիոլոգիայում: Այնուամենայնիվ, այս ուսումնասիրությունը տուժել է ֆոնի բարձր ֆլյուորեսցենտից, և այդ ժամանակից ի վեր ստեղծվել են մի քանի ավելի արդյունավետ PB-ներ՝ տարբեր MMP-ների նկատմամբ տարբեր առանձնահատկություններով: Նոր PB-ների ստեղծմանը նպաստել է նաև մի շարք MMP-ների կողմից կիսված որոշակի բնութագրիչ (MT1-MMP, MMP-7 և MMP-9 Roopali Roy et al., 2011 Scherer et al., 2008): Առանձնահատուկ հետաքրքրություն են ներկայացնում մերձ ինֆրակարմիր ֆլուորեսցենտային (NIRF) զոնդերը, քանի որ դրանք թույլ են տալիս վերլուծել հյուսվածքների խորքում տեղայնացված գործընթացները (Akers et al., 2012 Kaijzel et al., 2010 Lee et al., 2012 Scherer et al., 2008 Wallis de Vries et al., 2009 Wang et al., 2009):

Այլ PB-ները օգտագործում են FRET-ի վրա հիմնված մարումը՝ չճեղքված զոնդի ֆլյուորեսցենտությունը սահմանափակելու համար (Fudala et al., 2011, 2012 McIntyre et al., 2004): Վերջերս MT1-MMP-ի դեմ բարձր հարաբերակցությամբ պեպտիդ է մշակվել, որը կարող է օգտագործվել in vivo Հաղորդվել է ուռուցքի պատկերման մասին (Zhu et al., 2011): Այնտեղ նկարագրված պեպտիդը կապվում է MT1-MMP-ի ոչ կատալիտիկ տեղամասի հետ՝ հնարավորություն տալով MT1-MMP-ի ոչ պրոտեոլիտիկ տեղայնացմանը: Սելիվանովան և այլք: (2013) հրապարակել է մի փաստաթուղթ, որը նկարագրում է PB-ի պոզիտրոնային էմիսիոն տոմոգրաֆիան MMP-2-ի և MMP-9-ի համար:


Փորձարարական ընթացակարգեր

Նյութեր

մեթիլ-β-ցիկլոդեքստրանն ու Triton X-100-ը գնվել են Sigma-ից: Օկտիլ գլյուկոպիրանոզիդ (OG) և հակա-α-transducin հակամարմինը գնվել է Calbiochem-ից: Սառեցված խավարին հարմարեցված եղջերավոր ցանցաթաղանթները գնվել են J. Lawson, Inc.-ից (Lincoln, NE): Խոլեստերինը, ֆոսֆատիդիլքոլինը, ֆոսֆատիդիլեթանոլամինը, ֆոսֆատիդիլսերինը և սֆինգոմիելինը ձեռք են բերվել Avanti Polar Lipids-ից (Birmingham, AL): Մոնոկլոնալ հակամարմինները 2B6 (ընդդեմ peripherin/rds), 1D5 (դեմ ROM-1) և 4D2 (ընդդեմ opsin) առատաձեռն նվերներ էին դոկտոր Ռոբերտ Ս. Մոլդեյից (Բրիտանական Կոլումբիայի համալսարան, Վանկուվեր, Բրիտանական Կոլումբիա, Կանադա): Anti-GARP-1 և anti-GARP-2 հակամարմինները առատաձեռն նվերներ էին դոկտոր U. B. Kaupp-ից (Institut für Biologische Informationsverarbeitung, Julich, Գերմանիա): Anti-caveolin-1 հակամարմինը գնվել է BD Biosciences-ից:

ROS սկավառակի մեմբրանների մեկուսացում

ROS սկավառակի մեմբրանները մեկուսացվել են ROS-ի պլազմային մեմբրանի վեզիկուլներից՝ օգտագործելով ռիցին-ագարոզա և դիֆերենցիալ սախարոզա գրադիենտ ցենտրիֆուգացիա, ըստ էության, ինչպես մանրամասն նկարագրված է նախկինում (6): Համառոտ, անձեռնմխելի ROS թաղանթները մեկուսացվել են 1.11𠄱.13 գ/մլ սախարոզայի միջերեսից և մշակվել նեյրամինիդազով և ռիցին-ագարոզով: Ռիցին-ագարոզով կապված ROS-ները գիշերվա ընթացքում լուծվել են սառցե ջրի մեջ: Քանի որ մենք չենք բուժում տրիպսինով, պերիֆերին/rds-GARP փոխազդեցությունը չպետք է խաթարվեր այս պայմանների պատճառով (34): Սկավառակները բաժանվել են պլազմային թաղանթից, որը կապված է ռիցին-ագարոզայի հետ սախարոզայի խտության գրադիենտների վրա: ROS-ի պլազմային թաղանթը կազմում է ROS-ի ընդհանուր թաղանթի միայն 6𠄸%-ը (հղում 6 և հղումներ այնտեղ): Մեկուսացման պայմաններում, ինչպես նկարագրված է (6)

Ընդհանուր թաղանթի 7%-ը ռիցինի հետ կապված պլազմային թաղանթ է, ինչը ենթադրում է նվազագույն (ρ%) պլազմային մեմբրանի կապը սկավառակների հետ: Մեկուսացված ROS սկավառակի թաղանթները գնդիկավորվեցին 17500 պտ/րոպում 25 րոպեի ընթացքում և նորից կասեցվեցին MOPS բուֆերում (10 մ մ MOPS, pH 7.2, 60 մ մ KCl, 30 մ մ NaCl, 5 մ մ MgCl։2, 1 մ մ դիթիոթրեիտոլ, 5 μ մ ապրոտինին, և 1 μ մ լեյպեպտին) և օգտագործվել անմիջապես:

Triton X-100-դիմացկուն թաղանթային լաստանավերի մեկուսացում

Triton X-100-ակայուն թաղանթային լաստանավները պատրաստվել են մեկուսացված սկավառակի թաղանթներից, ըստ էության, ինչպես նկարագրված է Սենոյի կողմից et al. (32): Սկավառակի թաղանթները կասեցվել են MOPS բուֆերում մինչև սպիտակուցի վերջնական կոնցենտրացիան 8� մգ/մլ: Triton X-100 (2%, w/v) ավելացվել է այս կասեցմանը մինչև 1% (w/v) վերջնական կոնցենտրացիան, և կախոցները միատարրացվել են ապակե խրճիթի երեք անցումներով ապակե Tenboeck հյուսվածքների սրածայրով: Հոմոգենատները պատրաստվում էին լույսի կամ մթության մեջ: Միատարրը խառնվել է 1,23 մլ 2,4 մ սախարոզայի հետ, որպեսզի ստացվի 0,9 մ սախարոզայի վերջնական կոնցենտրացիան և տեղափոխվեց SW 41 ցենտրիֆուգային խողովակ: Նմուշը ծածկվել է սախարոզայի լուծույթներով MOPS բուֆերում՝ 0,8, 0,7, 0,6 և 0,5 մ սաքարոզայի կոնցենտրացիաների նվազման դեպքում և ցենտրիֆուգվել 46000 rpm-ով 20 ժամ 4 ଌ ջերմաստիճանում: Ֆրակցիաները հավաքվել և վերլուծվել են խոլեստերինի, ֆոսֆատի և սպիտակուցի համար: Վերահսկիչ փորձերում, նույն ծավալով սկավառակի թաղանթները՝ ֆոսֆատների և սպիտակուցների նույնական պարունակությամբ, մշակվել են 2% OG-ով, ինչպես նկարագրված է նախկինում (35):

Որոշ փորձերում ROS-ի մեկուսացված սկավառակի թաղանթները խոլեստերինից զրկվել են մեթիլ-ով մշակման արդյունքում:β-ցիկլոդեքստրան 30 րոպե 37 ଌ (36): Հետևելով մեթիլ-β- ցիկլոդեքստրանով մշակում, սկավառակի թաղանթները վերականգնվել են ցենտրիֆուգման միջոցով և նորից կասեցվել MOPS բուֆերում՝ նախքան Triton X-100-ով լուծելը: Մեկ ուսումնասիրության համար մեկուսացված ցածր լողացող խտության լաստանավները մշակվել են մեթիլ-β- ցիկլոդեքստրան, ինչպես նկարագրված է վերևում: Ցիկլոդեքստրանով մշակումից հետո լաստանավները ցենտրիֆուգվել են 50,000 ռ/րոպե արագությամբ 30 րոպե, և գնդիկը կրկին կասեցվել է խոլեստերինի, ֆոսֆատի և սպիտակուցի վերլուծության և Western blot վերլուծության համար:

Իմունային տեղումներ և Western Blot վերլուծություն

Իմունային նստվածքների ուսումնասիրություններն իրականացվել են ինչպես նկարագրված է (37): Սախարոզայի խտության գրադիենտներից մեկուսացված ֆրակցիաները վերականգնվել են, և 10 μԱռաջնային հակամարմինի լ (խոզի հակապերիֆերին/rds մոնոկլոնալ հակամարմին (mAb) 2B6 կամ հակա-ROM-1 mAb 1D5) ավելացվել է նմուշներից յուրաքանչյուրին և ինկուբացվել է գիշերվա ընթացքում 4 ଌ ջերմաստիճանում պտտմամբ: 150-ով իմունային տեղումներից հետո μլ սպիտակուց A-Sepharose, կոմպլեքսները հինգ անգամ լվացվեցին Nonidet P-40 բուֆերով և նորից կասեցվեցին 2× SDS-PAGE նմուշի բուֆեր պարունակող β-մերկապտոէթանոլ. 85 ଌ ջերմաստիճանում 10 րոպե տաքացնելուց հետո նմուշները ցենտրիֆուգվեցին 14000 պտ/րոպում 30 վրկ, և իմունային նստվածքային համալիրներն առանձնացվեցին SDS-PAGE-ով և տեղափոխվեցին նիտրոցելյուլոզ՝ Western blot վերլուծության համար (17) կամ արծաթով ներկված (38) . Իմունային ռեակտիվ շերտերը տեսողականացվել են ECL հայտնաբերման համակարգի միջոցով (Amersham Biosciences): Իմունռեակտիվ տեսակների մոլեկուլային զանգվածները հաշվարկվել են՝ օգտագործելով ՌՖ մոլեկուլային զանգվածի մարկերների չափումներ.

Լիպիդային կազմի վերլուծություն

Խոլեստերինը որոշվել է ինչպես նկարագրված է (39): Ֆոսֆատը չափվել է ինչպես նկարագրված է (40) և փոփոխվել (41): Լիպիդները արդյունահանվել են ցածր լողացող խտության ֆրակցիաներից, ինչպես նկարագրված է (42): Նախքան լուծվող թաղանթային ֆրակցիաներից լիպիդների արդյունահանումը, դրանք 48 ժամ դիալիզացվել են 10 մ մ HEPES-ի և 0,5 մ NaCl-ի երկու փոփոխության դեմ՝ մաքրող միջոցի կոնցենտրացիան նվազեցնելու համար: Երկու դեպքում էլ արդյունահանվել է ընդհանուր ֆոսֆոլիպիդի 90 ± 1,2%-ը, ինչը ցույց է տալիս, որ ցանկացած մնացորդային Triton X-100-ի առկայությունը լուծվող ֆրակցիաներում չի խանգարում լիպիդների արդյունահանմանը: Քլորոֆորմային քաղվածքները գոլորշիացվել են Ն2 և կրկին կասեցված է CHCl-ում3/MeOH (2:1). Լիպիդները լուծվել են քլորոֆորմ/մեթանոլ/քացախաթթվի/ջրի մեջ մշակված սիլիկա գել H քրոմատոգրամների վրա հաջորդական միաչափ TLC-ով (25:15:4:2): Թիթեղները մշակվել են նույն լուծիչների համակարգում երեք անգամ հաջորդականությամբ, ինչպես նկարագրված է (43): Բծերը բացահայտվել են՝ համեմատելով հայտնի ստանդարտների (ֆոսֆատիդիլխոլին, ֆոսֆատիդիլեթանոլամին, ֆոսֆատիդիլսերին, սֆինգոմիելին և խոլեստերին) միգրացիայի հետ՝ Dragendorff-ի, նինհիդրինի և ծծմբաթթվի ածխաջրման կիրառմամբ հատուկ գունավորումից հետո: Բծերը քերեցին, և ընդհանուր ֆոսֆատը որոշվեց, ինչպես նկարագրված է վերևում:


Քննարկում

Երբ TX100-ի կոնցենտրացիան CMC միջակայքից ցածր է (այսինքն՝ 0,17 մՄ և ավելի քիչ), մակերևութային ակտիվ նյութը կարող է գործել որպես թափանցող նյութ՝ կախված բջիջների ազդեցության դոզանից և տևողությունից: Սա լավ միջակայք է բջիջը հավելյալ նյութով փոխակերպելու համար, սակայն բջիջների երկարատև ազդեցությունը նույնիսկ այս ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում կարող է հանգեցնել որոշ բջիջների մահվան: Երբ օգտագործվում են TX100-ի կոնցենտրացիաները CMC միջակայքում, > 0,18 մՄ, բջջային թաղանթը քայքայվում է, ինչի հետևանքով բջիջների ամբողջ կառուցվածքը փլուզվում է և բջիջների մահը մի քանի րոպեի ընթացքում:

SECM-ը թույլ է տալիս հետևել մի շարք փոփոխությունների, որոնց բջիջը ենթարկվում է իր չափի, ձևի և թաղանթային թափանցելիության առումով: 0,17 մՄ կամ ավելի ցածր TX100 կոնցենտրացիայի դեպքում բավականաչափ ժամանակ է տրամադրվում բջջի վարքագիծը ուսումնասիրելու համար և թույլ է տալիս մեկնաբանել տվյալները: Երբ բջջին ավելացվում է 0,17 մՄ TX100 լուծույթ, մեմբրանը սկզբում բավականաչափ թափանցելի է դառնում, որպեսզի թույլ տա հիդրոֆիլ մոլեկուլներին, ինչպիսին է ֆերոցիանիդը, ներթափանցել բջջային թաղանթ, մինչդեռ բջջի բարձրությունը մնում է անփոփոխ: Նույնիսկ երկար ժամանակ (≥20 րոպե) ազդեցության դեպքում բջիջները վերականգնվում են մեմբրանի վնասումից հետո, երբ մակերևութային ակտիվ նյութը հեռացվում է: Երբեմն բջիջը ենթարկվում է բարձրության կրճատման՝ թափանցելիության բարձրացման ժամանակաշրջաններից հետո վերականգնման ժամանակ: Երբ ավելացվում է 0,20 մՄ TX100, բջջային թաղանթը դառնում է «գերթափանցելի» 1 րոպեի ընթացքում, երբ մակերեսային ակտիվ նյութից անդառնալի վնաս է տեղի ունենում: Ի վերջո, բջիջը կորցնում է իր ամբողջականությունը և փլուզվում է, ինչը SECM-ի կողմից կարող է դիտվել որպես ավելի բարձր հոսանք x-սկանավորման մեջ կամ մոտեցման կորի մեջ, որը շատ նույնն է, ինչ որ մոտեցումը ափսեի նկատմամբ: Լիպիդային երկշերտի լուծարումը կարող է առաջանալ լիպիդ-լիպիդ փոխազդեցության խախտմամբ՝ լիպիդ-լվացքի միջոց միցելային փոխազդեցությունների ուժեղացված պատճառով: Լվացող միջոցի առանձին մոլեկուլների կամ փոքր ագրեգատների ներդրումը CMC-ից անմիջապես ցածր կոնցենտրացիաներում հանգեցնում է նրան, որ մեմբրանը դառնում է ավելի թափանցելի մոլեկուլների լայն տեսականիով, որոնք այլ կերպ չեն կարող ներթափանցել բջջի ներսում՝ թույլ տալով տրանսֆեկցիա: Այնուամենայնիվ, լվացող միջոցների կոնցենտրացիաների դեպքում, որտեղ ձևավորվում են միցելներ (CMC միջակայքում կամ ավելի բարձր), տեղի է ունենում մեմբրանի արագ քայքայում (11, 28–31):


ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆԻ ՊԱՏՄՈՒԹՅՈՒՆ

Որոշ լուծույթների ներերակային ներարկումից հետո ջերմության առաջացման մասին ուսումնասիրությունները թվագրվում են 19-րդ դարից առաջ: 1894 թվականին Սանարելլին ցույց տվեց, որ հեղուկ մշակույթները Էբերտի բացիլՄիկրոօրգանիզմներից զերծ, կենդանիների մեջ ներարկվելիս կարող է առաջացնել թունավորում, որն ուղեկցվում է ջերմությամբ, երբեմն նույնիսկ մահացու (15): 19-րդ դարի վերջում &ldquoinjection fever&rdquo անվանումը սովորաբար օգտագործվում էր մի քանի լուծույթների ներերակային ներարկումից հետո նկատվող տենդային ռեակցիաները արտահայտելու համար: 20-րդ դարում ներերակային ճանապարհով դեղագործական արտադրանքի կիրառումը մեծացրել է նման պատահարների թիվը, ինչի հետևանքով մի քանի հետազոտողներ մշակել են այս թեմայի վերաբերյալ գնահատող աշխատանքների շարք:

1912 թվականին Հորտը և Պենֆոլդը ստեղծեցին &ldquopyrogenic&rdquo անվանումը՝ նշանակելու &ldquowaters&rdquo, որոնք ներարկվելիս առաջացնում են &ldquohyperthermia&rdquo: Նման անվանումը հետագայում վերստին ընդունվեց 1923թ.-ին Ֆլորանս Զայբերտի կողմից, ով պիրոգեն է անվանել «հիպերջերմացնող» նյութերը, որոնք պարունակում են կամ մեռած բակտերիաներ և անձեռնմխելի կամ քայքայված, պաթոգեն կամ ոչ կամ ավելի հաճախ բակտերիալ նյութափոխանակության արտադրանքներ, ինչպիսիք են ապանատորացված սպիտակուցը, էնդոտոքսինները կամ: էկզոտոքսիններ (16, 17):

Պիրոգեն տերմինը հայտնի դարձավ Զայբերտի կողմից հաճախակի օգտագործելուց հետո, և այդ պատճառով հաճախ նրա ստեղծումը վերագրվում է նրան (17): Զայբերտը և նրա գործընկերները շարունակեցին Հորտի և Պենֆոլդի կողմից սկսված հետազոտությունը՝ թորած ջրից մեկուսացնելով կենդանի գրամ-բացասական միկրոօրգանիզմը, որն ի վիճակի էր արտադրել պիրոգեններ (15): Հեղինակները այս միկրոօրգանիզմը նշանակել են որպես Պիրոգեն բակտերիա, հասկանալով, որ դա նոր բակտերիա չէ, քանի որ միկրոօրգանիզմների մի քանի տեսակներ կարող են պիրոգեններ արտադրել (16):

Պիրոգենների մասին գիտելիքների բարձրացմանը տրված հիմնական ազդակը տեղի է ունեցել 1925-1945 թվականներին: Մասնավորապես, Co-Tui-ն, որն օգնում է Schrift-ին, արժանի է հատուկ գնահատականների՝ ցույց տալու համար, որ գրամ-բացասական բակտերիաները պիրոգենների ամենավտանգավոր արտադրողն են: (18): Դա չի նշանակում, որ Գրամ-դրական բակտերիաները չեն կարող նման մոլեկուլներ առաջացնել, սակայն դրանք ավելի ցածր մակարդակում են: Փաստորեն, գրամ-դրական բակտերիաները, երբ ոչնչացվում են ջերմությունից, գրեթե չեն արտադրում պիրոգեն, քանի որ նման բակտերիաներում հիմնականում ձևավորվում են պրոտեինային ծագման էկզոտոքսիններ, որոնք հեշտությամբ ապաբնականացվում են ջերմության միջոցով: Մյուս կողմից, գրամ-բացասական բակտերիաները սովորաբար առաջացնում են էնդոտոքսիններ, որոնք կազմված են հիմնականում լիպոպոլիսախարիդներից և, հետևաբար, ավելի ջերմակայուն են, քան առաջինները:

Ըստ Վեստֆալի (1945), պիրոգենները, որոնցից իսկապես պետք է վախենալ դեղագործական պատրաստուկներում, համապատասխանում են գրամ-բացասական բակտերիաների էնդոտոքսիններին, և նման լիպոպոլիսախարիդային համալիրներ հայտնաբերված են բակտերիաների բջջային պատի արտաքին շերտում (19): Ըստ էության, պիրոգենները միկրոօրգանիզմներում առաջանում են Enterobactereaceae ընտանիքը և համարվում է առանց ախտահանման և մանրէազերծման պատշաճ գործընթացների պատրաստված ներարկային լուծույթի հիմնական աղտոտիչը: Մոտ երկու տասնամյակ անց ԱՄՆ Առողջապահության ազգային ինստիտուտի և 14 դեղագործական արդյունաբերության համատեղ ուսումնասիրություն է մշակվել՝ ստեղծելու կենդանիների համակարգ, որը համարժեք կլինի լուծումների &ldquopyogenicity&rdquo-ն գնահատելու համար: Նման ուսումնասիրությունը ավարտվեց ճագարների վրա առաջին պաշտոնական պիրոգեն թեստի մշակմամբ, որը ներառված էր USP XII-ում, 1942 թ.-ին: Զուգահեռաբար, էնդոտոքսինները մաքրելու և բնութագրելու այլ ջանքեր են գործադրվել, և մի քանի հետազոտողների կողմից ձեռք են բերվել մեկուսացված պիրոգեններ (17): , 19)

Շիրը և Թերները (1943) առաջին հետազոտողներն էին, ովքեր օգտագործեցին լիպոպոլիսաքարիդ տերմինը էնդոտոքսինի էքստրակտը անվանելու համար, տերմին, որը նկարագրում է էնդոտոքսինի բնույթը և որն ընդունվել է գիտական ​​հանրության կողմից (20): 1954թ.-ին Վեստֆալը և նրա գործընկերները մանրամասնեցին ջրային-ֆենոլային համակարգերի օգտագործումը մի շարք սպիտակուցներից զերծ մաքրված լիպոպոլիսաքարիդների (LPS) արտադրության համար: Enterobacteriaceae: (15, 21, 22): Հետևաբար, վերջին տարիներին մեծ առաջընթաց է գրանցվել էնդոտոքսինների վնասակար և օգտակար գործունեության հիմքում ընկած մոլեկուլային կազմակերպման և մեխանիզմների ըմբռնման հարցում (8, 23):

ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆ. ՔԻՄԻԱԿԱՆ ԵՎ ՖԻԶԻԿԱԿԱՆ ՀԱՏԿՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐԸ

Էնդոտոքսինները, որոնք նաև կոչվում են լիպոպոլիսաքարիդներ (LPS), գրամ-բացասական բակտերիաների արտաքին թաղանթի հիմնական բաղադրիչն են (Նկար 1): Դրանք կազմված են հիդրոֆիլ պոլիսախարիդային մասից, որը կովալենտորեն կապված է հիդրոֆոբ լիպիդային մասի հետ (Lipid A) (Նկար 2) (3, 6, 24): Տեսակների մեծ մասի LPS-ը կազմված է երեք տարբեր շրջաններից՝ O-հակագենի շրջան, միջուկային օլիգոսաքարիդ և լիպիդ A (LipA) (Նկար 2):

Նկար 1Ներքին և արտաքին թաղանթների մոլեկուլային մոդելը E. coli K-12 ըստ Raetz et al., 1991 (24): Երկրաչափական ձևը. օվալները և ուղղանկյունները ներկայացնում են շաքարի մնացորդներ, ինչպես նշված է, մինչդեռ շրջանակները ներկայացնում են տարբեր լիպիդների բևեռային գլուխ խմբեր: Հապավումը՝ PPEtn (էթանոլամին պիրոֆոսֆատ) LPS (լիպոպոլիսաքարիդ) Kdo (2-keto-3-deoxyoctonic թթու):

Նկար 2: Էնդոտոքսինի քիմիական կառուցվածքը E. coli O111:B4 ըստ Ohno-ի և Morrison-ի 1989 թ. (25):(Hep) L-գլիցերին-D-մաննո-հեպտոզա (Gal) գալակտոզա (Glc) գլյուկոզա (KDO) 2-keto-3-deoxyoctonic թթու (NGa) N-ացետիլ-գալակտոզամին (NGc) N-ացետիլ-գլյուկոզամին:

Լիպիդ A-ն էնդոտոքսինի ամենապահպանված մասն է (8, 26) և պատասխանատու է էնդոտոքսինի կենսաբանական գործունեության մեծ մասի, այսինքն՝ դրա թունավորության համար: Էնդոտոքսինը կազմված է b-1,6-կապակցված D-գլյուկոզամինի մնացորդներից, որոնք կովալենտորեն կապված են 3-հիդրօքսի-ացիլ փոխարինիչներին՝ 12-16 ածխածնի ատոմներով ամիդային և էսթերային կապերի միջոցով: Դրանք կարող են հետագայում էսթերֆիկացվել հագեցած ճարպաթթուներով: Էնդոտոքսինի այս հիդրոֆոբ մասը ընդունում է կարգավորված վեցանկյուն դասավորություն, ինչը հանգեցնում է ավելի կոշտ կառուցվածքի՝ համեմատած մնացած մոլեկուլի հետ (8, 9): Լիպիդ A-ի կամ էնդոտոքսինի պակաս ունեցող շտամները հայտնի չեն: Հիմնական օլիգոսաքարիդն ունի պահպանված կառուցվածք՝ ներքին 3‑դեօքսի-D-մաննո-2-օկտուլոսոնաթթուով (KDO)՝ հեպտոզային շրջանով և արտաքին հեքսոզային շրջանով: Մեջ E. coli տեսակներ, հայտնի են հինգ տարբեր միջուկային տեսակներ և Սալմոնելա տեսակները կիսում են միայն մեկ հիմնական կառուցվածքը: Լիպիդ A-ին մոտ գտնվող միջուկի շրջանը և ինքը լիպիդ A-ն մասամբ ֆոսֆորիլացված են (pK1=1.3, pK2 = 8.2 ֆոսֆատային խմբեր A լիպիդում), հետևաբար էնդոտոքսինի մոլեկուլները ցուցադրում են զուտ բացասական լիցք սովորական սպիտակուցային լուծույթներում (8, 27): O-հակագինը սովորաբար կազմված է միանման օլիգոսաքարիդների հաջորդականությունից (յուրաքանչյուրը երեքից ութ մոնոսաքարիդներով), որոնք հատուկ են շտամին և որոշիչ են համապատասխան բակտերիաների սերոլոգիական ինքնության համար (8):

Էնդոտոքսինի մոնոմերի մոլային զանգվածը տատանվում է 10-ից մինչև 20 կԴա, օլիգոսաքարիդային շղթայի փոփոխականության պատճառով կարելի է գտնել նույնիսկ ծայրահեղ զանգվածներ՝ 2,5 (O-հակագին-դեֆիցիտի) և 70 (շատ երկար O-հակիգեն) կԴա: Հայտնի է, որ էնդոտոքսինները ջրային լուծույթներում ձևավորում են տարբեր վերմոլեկուլային ագրեգատներ՝ իրենց ամֆիպաթիկ կառուցվածքի պատճառով: Այս ագրեգատները առաջանում են լիպիդային շղթաների, ինչպես նաև երկվալենտ կատիոնների կողմից ֆոսֆատ խմբերի միջև առաջացած կամուրջների ոչ բևեռային փոխազդեցությունների արդյունքում (1): Ագրեգատային կառուցվածքներն ուսումնասիրվել են բազմաթիվ մեթոդներով, ինչպիսիք են էլեկտրոնային մանրադիտակը, ռենտգենյան ճառագայթների դիֆրակցիան, FT-IR սպեկտրոսկոպիան և NMR: Այս ուսումնասիրությունների արդյունքները ցույց են տվել, որ ջրային լուծույթներում էնդոտոքսինները կարող են ինքնուրույն հավաքվել տարբեր ձևերով, ինչպիսիք են շերտավոր, խորանարդ և վեցանկյուն շրջված դասավորությունները՝ մինչև 0,1 մմ և 1000 կԴա տրամագծերով և բարձր կայունությամբ՝ կախված լուծույթից։ բնութագրերը (pH, իոններ, մակերեսային ակտիվ նյութեր և այլն) (28, 29): Առաջարկվում է, որ սպիտակուցները կարող են նաև փոխել հավասարակշռությունը՝ ազատելով էնդոտոքսին մոնոմերները ագրեգատներից (6, 8): Ըստ մոլեկուլային դինամիկայի, էնդոտոքսինի եռաչափ կառուցվածքը, հատկապես երկար մակերեսային հակագենը, շատ ավելի ճկուն է, քան սպիտակուցների գնդիկ կառուցվածքը (8):

Էնդոտոքսինները մեծ քանակությամբ թափվում են բջիջների մահվան, ինչպես նաև աճի և բաժանման ժամանակ: Նրանք բարձր ջերմակայուն են և չեն քայքայվում կանոնավոր մանրէազերծման պայմաններում: Էնդոտոքսինը կարող է ապաակտիվացվել, երբ ենթարկվում է 250°C ջերմաստիճանում 30 րոպեից ավելի կամ 180°C ջերմաստիճանում 3 ժամից ավելի (28, 30): Առնվազն 0,1 Մ հզորությամբ թթուներ կամ ալկալիներ կարող են օգտագործվել նաև լաբորատոր մասշտաբով էնդոտոքսին ոչնչացնելու համար (17):

ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆՆԵՐԻ ԳՈՐԾՈՂՈՒԹՅԱՆ ՄԵԽԱՆԻԶՄ

Էնդոտոքսինն առաջացնում է պաթոֆիզիոլոգիական էֆեկտների լայն տեսականի, ինչպիսիք են էնդոտոքսինային ցնցումը, հյուսվածքների վնասվածքը և մահը (3): Էնդոտոքսինները ուղղակիորեն չեն գործում բջիջների կամ օրգանների դեմ, այլ իմունային համակարգի, հատկապես մոնոցիտների և մակրոֆագների ակտիվացման միջոցով, դրանով իսկ ուժեղացնելով իմունային պատասխանները: Այս բջիջներն ազատում են միջնորդներ, ինչպիսիք են ուռուցքային նեկրոզի գործոնը, մի քանի ինտերլեյկիններ, պրոստագլանդիններ, գաղութները խթանող գործոն, թրոմբոցիտների ակտիվացնող գործոն և ազատ ռադիկալներ (31, 32): Միջնորդներն ունեն ուժեղ կենսաբանական ակտիվություն և պատասխանատու են էնդոտոքսինի ազդեցության դեպքում կողմնակի ազդեցությունների համար: Դրանք ներառում են օրգանների և բջիջների կառուցվածքի և ֆունկցիայի փոփոխություններ, նյութափոխանակության գործառույթների փոփոխություններ, մարմնի ջերմաստիճանի բարձրացում, կոագուլյացիայի կասկադի ակտիվացում, հեմոդինամիկայի փոփոխություն և շոկի առաջացում: Բազմաթիվ փորձեր են արվել կանխարգելելու կամ բուժելու էնդոտոքսինների վնասակար ազդեցությունը իմունային բջիջների վրա, ինչպիսիք են հակաէնդոտոքսինային հակամարմինների օգտագործումը և էնդոտոքսինի մասնակի կառուցվածքները էնդոտոքսին ընկալիչների հակառակորդներին արգելափակելու համար: Այնուամենայնիվ, իմունային բջիջների հետ էնդոտոքսինների փոխազդեցությունը միայն հատուկ ընկալիչների միջնորդությամբ չէ: Բջջային պրիմինգը կարող է տեղի ունենալ նաև էնդոտոքսինի մոլեկուլների ոչ սպեցիֆիկ միջամտությամբ թիրախային բջիջների թաղանթների մեջ (33):

Ի վերջո, պետք է նշել, որ էնդոտոքսինները նույնպես կարող են օգտակար ազդեցություն ունենալ։ Դրանք օգտագործվել են արհեստական ​​տենդի բուժման մեջ՝ ուռուցքները ոչնչացնելու և, մասնավորապես, իմունային պաշտպանությունը բարելավելու համար։ Մարդու առողջության համար դրա դերի վերաբերյալ անորոշությունը ժամանակին նկարագրել է Բենեթը (34): Մյուս կողմից, ցանկացած ավելորդ էնդոտոքսինի ազդեցությունից պետք է խստորեն խուսափել՝ բարդություններից խուսափելու համար: Սա հատկապես ճիշտ է ներերակային ներարկվող դեղամիջոցների դեպքում:

ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆՆԵՐԻ ՈՐՈՇՈՒՄԻ ՏԵԽՆԻԿԱՆԵՐԸ

Էնդոտոքսինի հայտնաբերման համար FDA-ի կողմից հաստատված սովորաբար օգտագործվող մեթոդներն են նապաստակի պիրոգենի թեստը և Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) վերլուծությունը (35, 36): Նապաստակի պիրոգենի թեստը, որը մշակվել է 1920-ական թվականներին, ներառում է ճագարների ջերմաստիճանի բարձրացման չափում փորձնական լուծույթի ներերակային ներարկումից հետո: Իր բարձր գնի և շրջադարձային երկար ժամանակի պատճառով նապաստակի պիրոգեն թեստի օգտագործումը նվազել է և այժմ կիրառվում է միայն LAL թեստի հետ համատեղ՝ պարենտերալ սարքերի ավելի վաղ զարգացման փուլում կենսաբանական միացությունները վերլուծելու համար: Այսօր ամենահայտնի էնդոտոքսինների հայտնաբերման համակարգերը հիմնված են LAL-ի վրա, որը ստացվում է պայտային խեցգետնի արյունից: Limulus polyphemusև էնդոտոքսինի ներգործության ժամանակ խցանվում են: LAL հետազոտության ամենապարզ ձևը LAL գել-թրոմբի անալիզն է: Երբ LAL վերլուծությունը համակցվում է էնդոտոքսին պարունակող նմուշի նոսրացման հետ, գել կձևավորվի տվյալ վերլուծության էնդոտոքսինի զգայունությանը համամասնորեն: Էնդոտոքսինի կոնցենտրացիան մոտավոր է` շարունակելով օգտագործել ավելի քիչ զգայունության անալիզ, մինչև չստացվի բացասական ռեակցիա (դիտարկվող թրոմբ): Այս ընթացակարգը կարող է պահանջել մի քանի ժամ (5, 36): 0.5 EU/mL կոնցենտրացիան սահմանվել է որպես պիրոգեն և ոչ պիրոգեն նմուշների միջև շեմ (17, 36):

Ի լրումն գել-թրոմբի տեխնիկայի, արտադրողները մշակել են նաև երկու այլ տեխնիկա՝ turbidimetric LAL տեխնիկան և chromogenic LAL տեխնիկան: Այս նոր տեխնիկան հիմնված է կինետիկ վրա, ինչը նշանակում է, որ դրանք կարող են ապահովել էնդոտոքսինի կոնցենտրացիան՝ արդյունահանելով LAL վերլուծության իրական ժամանակի պատասխանները: Պղտորաչափական LAL վերլուծությունը պարունակում է բավականաչափ կոագուլոգեն՝ մակարդման ֆերմենտի կողմից տրոհվելիս պղտորություն առաջացնելու համար, բայց ոչ այնքան, որ թրոմբ առաջանա (37): LAL turbidimetric վերլուծությունը, երբ համեմատվում է LAL գել-թրոմբի հետազոտության հետ, տալիս է էնդոտոքսինի ավելի քանակական չափում կոնցենտրացիաների տիրույթում (0.01 EU/mL-ից մինչև 100.0 EU/mL): Այս վերլուծությունը հիմնված է պղտորության բարձրացման վրա՝ կապված սպիտակուցի կոագուլյացիայի հետ՝ կապված նմուշում էնդոտոքսինի կոնցենտրացիայի հետ: Փորձարկման նմուշների տարբեր նոսրացումների օպտիկական խտությունները չափվում և փոխկապակցվում են էնդոտոքսինի կոնցենտրացիայի հետ, որն օգնում է ստանդարտ կորի միջոցով, որը ստացվել է էնդոտոքսինի հայտնի քանակով նմուշներից (38): Կինետիկ քրոմոգեն սուբստրատի վերլուծությունը տարբերվում է գել-թրոմբի և պղտորման ռեակցիաներից, քանի որ կոագուլոգենը մասամբ կամ ամբողջությամբ փոխարինվում է քրոմոգեն սուբստրատով (39): Երբ հիդրոլիզացվում է նախնական մակարդման ֆերմենտի կողմից, քրոմոգեն սուբստրատն ազատում է դեղին գույնի նյութ, որը հայտնի է որպես. էջ- նիտրոանիլին. Դեղին նյութը ստանալու համար պահանջվող ժամանակը կապված է էնդոտոքսինի կոնցենտրացիայի հետ (40): Այնուամենայնիվ, կինետիկ պղտորման և քրոմոգեն թեստերը, թեև ավելի ճշգրիտ և արագ են, քան գել-թրոմբը, չեն կարող օգտագործվել բնորոշ պղտորությամբ հեղուկների համար, ինչպիսիք են արյունը և դեղնավուն հեղուկները, օրինակ. մեզի, և դրանց կատարումը կարող է վտանգվել լուծույթից առաջացած ցանկացած տեղումների պատճառով (37): Հետևաբար, ուսումնասիրվել են տարբեր նմուշներում էնդոտոքսինի հայտնաբերման տարբեր մեթոդներ (37, 41):

ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆՆԵՐԻ ՆԵՐԴՐՈՒՄՆԵՐ ՍՊԵՏՈՒՆՆԵՐՈՎ

Մի շարք կենսամոլեկուլներ ցույց են տալիս փոխազդեցություն էնդոտոքսինների հետ, ինչպիսիք են լիպոպոլիսախարիդը կապող սպիտակուցը (LBP), մանրէասպան/թափանցելիությունը բարձրացնող սպիտակուցը (BPI), ամիլոիդ P բաղադրիչը, կատիոնային սպիտակուցը (42, 43) կամ կենսաբանական էնդոտոքսինի վերլուծության մեջ օգտագործվող ֆերմենտը: (anti-LPS) գործոնը սկսած Լիմուլուս amebocyte lysate (LAL) (44): Այս սպիտակուցներն ուղղակիորեն մասնակցում են էնդոտոքսինի ընդունման ժամանակ բազմաթիվ տարբեր տեսակների ռեակցիային (45, 46): Մոլեկուլային ճանաչումը կարելի է ենթադրել որպես հակաէնդոտոքսին հակամարմինների և սպիտակուցային էնդոտոքսին ընկալիչների հետ փոխազդեցություն (օրինակ՝ CD14, CD16, CD18) (47): Այլ սպիտակուցներ փոխազդում են էնդոտոքսինների հետ նույնիսկ չունենալով ամուր կապ կենսաբանական մեխանիզմի հետ, ինչպիսիք են լիզոզիմը (25) և լակտոֆերինը (48), որոնք հիմնական սպիտակուցներ են (p.Ի>7), էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները կարելի է համարել որպես հիմնական շարժիչ ուժ։ Անկախ այն մեխանիզմից, որն առավել նշանակալից է, այս փոխազդեցությունները հանգեցնում են էնդոտոքսինի մոլեկուլների թաքցմանը, և, հետևաբար, այդ մոլեկուլները չեն հեռացվում հեռացման գործընթացում: Տիպիկ օրինակ է նկարագրված Karplus et al. (49):

Այնուամենայնիվ, այլ մեխանիզմներ պետք է գոյություն ունենան որպես փոխազդեցություն չեզոք հեմոգլոբինի (50) և նույնիսկ թթվային սպիտակուցների հետ (p.Ի<7) հայտնի են, որոնք տեղի են ունենում նաև ցածր իոնային ուժով: Դեռևս հակասականորեն քննարկվում է, թե ինչպես են տեղի ունենում այդ փոխազդեցությունները: Ընդհանրապես, սպիտակուցների հետ հիդրոֆոբ փոխազդեցությունները հնարավոր են: Այնուամենայնիվ, չկա որևէ ամուր ապացույց, որ այն մղում է փոխազդեցության մեխանիզմը: Ավելի հավանական է, որ սպիտակուցին կապված կարբոքսիլային խմբերի և էնդոտոքսինով կապված ֆոսֆորաթթվի խմբերի մրցակցությունը Ca2+-ի համար կարող է հանգեցնել դինամիկ կայուն կալցիումի կամուրջների սպիտակուցների և էնդոտոքսինների միջև (8):
Այն փաստը, որ LPS-ը ձևավորում է միցելային ագրեգատներ, որոնք համարվում են LPS-ի կենսաբանորեն ակտիվ ձևերը (51), կարող է ցույց տալ, որ բազմաթիվ սպիտակուցներ փոխազդում են LPS մոլեկուլների հետ: Մա et al. (2006) (52) առաջարկել է այլընտրանքային ագրեգացման ձև, որտեղ լիպոֆորինի մասնիկների՝ սպիտակուցի, որը ծառայում է որպես պրոկոագուլանտ (53-55) ինքնահավաքումը գնդային կառուցվածքների, օլիգոմերային փոխազդեցությունների արդյունք է: Սա կարող է ապահովել վանդակի նման կոագուլյացիայի արտադրանք, որտեղ լիպիդային մասը կազմում է պաշտպանիչ շերտ, որը առանձնացնում է թույնը շրջակա միջավայրի հետ փոխազդեցությունից:

Սպիտակուցների և նդաշենդոտոքսինների փոխազդեցությունների շնորհիվ էնդոտոքսինի հեռացումը սպիտակուցային լուծույթներից պահանջում է այնպիսի մեթոդներ, որոնք կարող են ուժեղ փոխազդեցություններ առաջացնել էնդոտոքսինների հետ, ինչպիսին է մերձավորության քրոմատոգրաֆիան: Որպես այլընտրանք, սպիտակուցների և նդաշենդոտոքսինների համալիրների հատուկ տարանջատումը կարող է բարելավել էնդոտոքսինի մոլեկուլների հասանելիությունը հեռացման համար: Հաշվի առնելով ապրանքների մեծ տեսականիը՝ հնարավոր չէ մշակել բոլոր ապրանքներից էնդոտոքսինների հեռացման մեկ ընդհանուր մեթոդ:

ԷՆԴՈՏՈՔՍԻՆՆԵՐԻ ՀԵՌԱՑՄԱՆ ՏԵԽՆԻԿՆԵՐ

Հարցն այն մասին, թե ինչպես էնդոտոքսինի հեռացումը կարող է իրականացվել տնտեսապես, գրավել է բազմաթիվ հետազոտողների ուշադրությունը և եղել &ndash, չնայած չհրապարակված &ndash գործընթացի վերադասավորումների պատճառ շատ դեպքերում: Սակայն այս հարցը դեռ բավարար լուծում չի ստացել։ Կենսաբանական պատրաստուկներից էնդոտոքսինների հեռացման համապատասխան ասպեկտների քննարկումը և առկա մոտեցումների քննադատական ​​վերանայումը պարտադիր են ապագայում ավելի կատարելագործված մեթոդներ մշակելու համար:

Դեղագործական արդյունաբերությունում հայտնի են մի քանի այլընտրանքային ուղիներ, որոնք արտադրում են ցածր էնդոտոքսինի մակարդակով արտադրանք: Այնուամենայնիվ, դրանց բազմազանությունը վկայում է էնդոտոքսինների հեռացման երկընտրանքի մասին: Ֆարմակոպրոտեինների համար մշակվել են մի քանի ընթացակարգեր՝ օգտվելով արտադրական գործընթացի առանձնահատկություններից, որոնք հարմարեցված են արտադրանքի հատուկ պահանջներին համապատասխան: Հետևաբար, յուրաքանչյուր ընթացակարգ խնդրին լուծում է բոլորովին այլ կերպ: Անիոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիան, օրինակ, պոտենցիալ օգտակար է դրական լիցքավորված սպիտակուցների, ինչպիսին ուրոկինազն է (56) ախտահանելու համար: Այնուամենայնիվ, բացասական լիցքավորված սպիտակուցների ախտահանումը կուղեկցվի արտադրանքի զգալի կորստով ադսորբցիայի պատճառով (27, 57): Փոքր սպիտակուցների համար, ինչպիսիք են միոգլոբինը (Մr

18000 Da), ուլտրաֆիլտրացիան կարող է օգտակար լինել էնդոտոքսինների մեծ ագրեգատները հեռացնելու համար: Մեծ սպիտակուցներով, ինչպիսիք են իմունոգլոբուլինները (Մr

150000 Դա) ուլտրաֆիլտրացիան արդյունավետ չի լինի: Ի լրումն, ուլտրաֆիլտրացիան չի հաջողվի, եթե էնդոտոքսինների և սպիտակուցների փոխազդեցությունները պատճառ դառնան, որ էնդոտոքսինների մոնոմերները ներթափանցեն մեմբրանի միջով անցնող սպիտակուցների հետ:

Էնդոտոքսինները կարելի է համարել ջերմաստիճանի և pH-ի կայունությունը՝ դարձնելով դրանց հեռացումը որպես սպիտակուցի մաքրման ընթացքում ներքևում գտնվող գործընթացների ամենադժվար խնդիրներից մեկը (58, 59): Էնդոտոքսինների հեռացումն ավելի դժվար է դառնում, երբ կապված է անկայուն կենսամոլեկուլների հետ, ինչպիսիք են սպիտակուցները (60): Սովորաբար օգտագործվում են մի շարք մոտեցումներ սպիտակուցային պատրաստուկների էնդոտոքսինով աղտոտվածությունը նվազեցնելու համար, ներառյալ իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիան (61, 62), հարաբերական ադսորբենտները, ինչպիսիք են անշարժացված L-հիստիդինը, պոլի-L-լիզինը, պոլի(&գամմա-մեթիլ L-գլուտամատը): ), և պոլիմիքսին B (57, 63, 64), գել ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա, ուլտրաֆիլտրացիա, սախարոզային գրադիենտ ցենտրիֆուգացիա (65) և Triton X-114 փուլային տարանջատում (66, 67): Այս տեխնիկայի հաջողությունը LPS-ը սպիտակուցներից առանձնացնելու հարցում մեծապես կախված է թիրախային սպիտակուցի հատկություններից (9):

Ցանկացած մոտեցման հաջողության վրա ազդող երկու կարևոր գործոն են էնդոտոքսինի և սպիտակուցային անտիգենի մերձեցումը քրոմատոգրաֆիայի աջակցության կամ օգտագործվող միջավայրի նկատմամբ և էնդոտոքսինի մերձեցումը սպիտակուցային հակագենի նկատմամբ: Երրորդ գործոնն այն է, թե ինչպես էնդոտոքսինի կապը սպիտակուցի նկատմամբ կարող է փոփոխվել այնպիսի գործոններով, ինչպիսիք են ջերմաստիճանը, pH-ը, լվացող միջոցները (մակերևութային ակտիվ նյութերը), լուծիչները և դենատուրանտները (4):

Սովորաբար, էնդոտոքսինների հեռացման համար կիրառվող ընթացակարգերը անբավարար են ընտրողականության, կլանման կարողությունների և սպիտակուցի վերականգնման առումով: Էնդոտոքսինի ընտրովի հեռացման ժամանակ առանց սպիտակուցի լուծույթներից հեշտ է հեռացնել էնդոտոքսինները ուլտրաֆիլտրացիայի միջոցով՝ օգտվելով էնդոտոքսինի և ջրի տարբեր չափերից, կամ ոչ ընտրովի կլանմամբ հիդրոֆոբ ադսորբենտով (68) կամ անիոնափոխանակիչով ( 69): Սպիտակուցային լուծույթներից էնդոտոքսինի ընտրովի հեռացման համար անհրաժեշտ է իմանալ, թե ինչ ձևով են էնդոտոքսինները սպիտակուցային լուծույթներում:

Հիրայաման և Սակատան (2002) (6) ենթադրեցին, որ էնդոտոքսինային ագրեգատները ձևավորում են գերմոլեկուլային հավաքներ ֆոսֆատային խմբերով որպես գլխի խումբ և ցուցադրում են բացասական զուտ լիցք՝ իր ֆոսֆատային խմբերի պատճառով, որոնք առաջանում են լիպիդ A-ից (6): Այս բնութագրերը ցույց են տալիս, որ իոնային փոխազդեցությունը կարևոր դեր է խաղում էնդոտոքսինների կատիոնային ներծծող և ֆոսֆատ խմբերի միջև կապի մեջ: Երբ սպիտակուցային լուծույթներում օգտագործվում են հիդրոֆոբ ադսորբենտներ, ենթադրվում է, որ կա նաև հիդրոֆոբ կապակցում ադսորբենտի և էնդոտոքսինների լիպոֆիլ խմբերի միջև: Այս կապակցման գործընթացները կախված են սպիտակուցների հատկություններից (զուտ լիցք, հիդրոֆոբություն) և լուծույթի պայմաններից (pH, իոնային ուժ)։

Էնդոտոքսինային աղտոտիչների հեռացման համար սովորաբար օգտագործվող որոշ մեթոդներ են ուլտրաֆիլտրացիան (70) և իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիան (71): Ուլտրաֆիլտրացիան, թեև արդյունավետ է էնդոտոքսինները ջրից հեռացնելու համար, սակայն անարդյունավետ մեթոդ է սպիտակուցների առկայության դեպքում, որոնք կարող են վնասվել ֆիզիկական ուժերի կողմից (72): Անիոնափոխանակիչները, որոնք օգտվում են էնդոտոքսինների բացասական զուտ լիցքից, լայնորեն օգտագործվում են էնդոտոքսինների կլանման համար: Այնուամենայնիվ, երբ բացասական լիցքավորված սպիտակուցները պետք է ախտահանվեն, դրանք կարող են միաժամանակ ներծծվել մատրիցով և առաջացնել կենսաբանական նյութի զգալի կորուստ: Բացի այդ, զուտ դրական լիցքավորված սպիտակուցները էնդոտոքսինների հետ կազմում են բարդույթներ՝ ստիպելով սպիտակուցները էնդոտոքսինը քաշել սյունակի երկայնքով և, հետևաբար, նվազագույնի հասցնել էնդոտոքսինների հեռացման արդյունավետությունը (57):

Ցույց է տրվել, որ ալկանեդիոլները արդյունավետ միջոցներ են LPS-ի բաժանման համար LPS-սպիտակուցային կոմպլեքսներից իոնային հենարաններով քրոմատագրման ժամանակ: Նրանց արդյունավետությունը LPS-ով սպիտակուցային կոմպլեքսավորումը նվազեցնելու համար կախված է (I) ալկանեդիոլի չափից, (II) ալկանեդիոլի իզոմերային ձևից, (III) ալկանեդիոլի լվացման երկարությունից, (IV) ալկանեդիոլի կոնցենտրացիայից և (V) օգտագործվող իոնային աջակցության տեսակը՝ կատիոնային կամ անիոնային։ Ալկանեդիոլը դյուրավառ չէ և որպես այդպիսին ավելի անվտանգ այլընտրանք է, երբ համեմատվում է սպիրտների (էթանոլ կամ իզոպրոպանոլ) հետ, որոնք նույնպես օգտագործվել են LPS-ը սպիտակուց-LPS համալիրներից հեռացնելու համար (9): LPS-ի հեռացումն ավելի արդյունավետ է կատիոնափոխանակիչների վրա, քան անիոնային:

Էնդոտոքսինը ռեկոմբինանտ սպիտակուցային պատրաստուկներից հեռացնելու համար սպիտակուցի լուծույթը կարող է անցնել սյունակի միջով, որը պարունակում է պոլիմիքսին B անշարժացված Sepharose 4B-ի վրա՝ հույս ունենալով, որ աղտոտող էնդոտոքսինը կապվում է գելի հետ: Նմանապես, Sepharose 4B-ի վրա անշարժացած հիստիդինը նաև ունի սպիտակուցային լուծույթներից էնդոտոքսին բռնելու ունակություն (63): Պոլիմիքսին B-ի մերձեցման քրոմատոգրաֆիան արդյունավետ է լուծույթներում էնդոտոքսինը նվազեցնելու համար (73): Պոլիմիքսին B-ն՝ պեպտիդային հակաբիոտիկ, ունի շատ բարձր կապակցում էնդոտոքսինների մեծ մասի լիպիդ A մասի համար (74): Կարպլուսը և այլք: (1987) (49) զեկուցել է պոլիմիքսին B կապակցման քրոմատոգրաֆիայի բարելավված մեթոդի մասին, որում էնդոտոքսինը կարող է արդյունավետորեն ներծծվել սպիտակուցներից էնդոտոքսինի անջատումից հետո ոչ իոնային լվացող միջոցի՝ օկտիլ-&բետա-D-գլյուկոպիրանոզիդով:

Վերոհիշյալ մեթոդները ողջամտորեն արդյունավետ են սպիտակուցային լուծույթներից էնդոտոքսինների հեռացման համար՝ համեմատաբար բարձր սպիտակուցային վերականգնումներով: Այնուամենայնիվ, այս մերձեցման փուլերը չեն կարող մաքրվել էթանոլում նատրիումի հիդրօքսիդի ուժեղ դեպիրոգենացման ստանդարտ պայմաններով (75): Anspach and Hillbeck (1995) (57) պարզել են, որ այս հենարանները տառապում են սպիտակուցների առկայության արդյունավետության զգալի նվազումից: Հետևաբար, դրանք ընդհանուր առմամբ կիրառելի չեն վերը նշված խնդրի համար (57):

Մեմբրանի վրա հիմնված քրոմատոգրաֆիան հաջողությամբ կիրառվել է նախապատրաստական ​​տարանջատումների համար, հիմնականում սպիտակուցների բաժանման համար (76-83): Այնուամենայնիվ, այս տեխնոլոգիայի համընդհանուր ընդունումը տեղի չի ունեցել, քանի որ թաղանթային քրոմատոգրաֆիան սահմանափակված է կապող հզորությամբ, որը փոքր է, երբ համեմատվում է բշտիկների վրա հիմնված սյուների հետ, թեև թաղանթային կլանիչների բարձր հոսքի առավելությունները կհանգեցնեն ավելի բարձր արտադրողականության ( 78): Թեև բշտիկների վրա հիմնված քրոմատոգրաֆիան դեռևս գերակշռող և արդյունավետ է արտադրանքի մաքրման գործողությունների համար, այն ունի մի քանի բնածին թերություններ՝ հետքի կեղտը հեռացնելու կամ փայլեցնելու համար: Ավելին, այս հավելվածում օգտագործվող ուլունքների վրա հիմնված սյուների ներծծող կապող հզորությունը սովորաբար պահանջվողից 3-4 կարգով մեծ է, քանի որ սյուները սովորաբար չափվում են ցանկալի հոսքի արագության հասնելու համար, այլ ոչ թե հզորության: Քանի որ մեմբրանի վրա հիմնված համակարգերն ունեն հստակ հոսքի արագության առավելություն և բավարար հզորություն՝ կեղտերի և աղտոտիչների հետքի մակարդակները կապելու համար, թաղանթային կլանիչներն իդեալականորեն հարմար են այս կիրառման համար:Վերջերս աշխատանք է կատարվել՝ օգտագործելով թաղանթային քրոմատոգրաֆիան՝ ԴՆԹ-ն, հյուրընկալող բջիջների սպիտակուցը (HCP) և էնդոտոքսինը հեռացնելու համար ողջամիտ հաջողությամբ (8, 84-86):

Jann et al., (1975) (87) հաղորդում են, որ սալաքար-պոլիակրիլամիդ գել էլեկտրոֆորեզը նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատի (SDS-PAGE) առկայության դեպքում կարող է օգտագործվել բակտերիալ LPS-ի տարանջատման համար: Հեղինակները ցույց են տվել, որ LPS-ի մոլեկուլային կառուցվածքները կարող են վերագրվել առանձնացված LPS գոտիներին՝ փոխկապակցելով էլեկտրոֆորետիկ ժապավենի ձևը, ինչպես հայտնաբերված է պարբերական թթու-Շիֆի ներկով, և քրոմատոգրաֆիայի պրոֆիլը, որը առաջացել է LPS-ից ազատված քիմիապես բնութագրված ածխաջրային մասերի գելի ներթափանցմամբ: Մինչդեռ կոպիտ (R) մուտանտ բակտերիայից ստացված LPS-ը, որը պարունակում էր օլիգոսաքարիդների կարճ շղթա, ցուցադրում էր միայն արագ շարժվող ժապավենը, LPS-ը վայրի տիպի հարթ (S) շտամներից, որոնք ունեին միջուկային օլիգոսաքարիդ, որը փոխարինված էր տարբեր չափերի: Օ- հատուկ պոլիսախարիդային շղթա, ցույց տվեց ինչպես արագ, այնպես էլ դանդաղ ներգաղթող շերտեր: Մյուս կողմից, LPS-ը կիսամյակային (SR) տիպի բակտերիայից, որը պարունակում է հիմնական օլիգոսաքարիդ և կտրված Օ- շղթան հայտնաբերվել է որպես արագ շարժվող գոտի, որը մի փոքր ավելի դանդաղ է արտագաղթում, քան R- տիպի LPS ժապավենները: Չնայած անձեռնմխելի LPS-ի տարանջատման և վերլուծության այս մեծ առաջընթացին, հայտնաբերման սահմանափակ զգայունությունը, որը հանգեցրեց մի քանի լայն և ցրված LPS ժապավենների վիզուալացմանը, խոչընդոտեց LPS-ի հետագա մոլեկուլային բարդությունների բացահայտմանը (88): Հարթ և կոպիտ շտամներից LPS-ը կարող է ցրվել մակերևութային ակտիվ նյութերով, ինչպիսիք են նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատը (89, 90), Տրիտոն X-100 (91) և նատրիումի դեզօքսիքոլատը (92-94): Մակերեւութային ակտիվ նյութի ավելցուկը դիալիզի միջոցով հեռացնելուց հետո ձևավորվում է մասնիկների ավելի համասեռ պոպուլյացիա՝ մոտ 5x105-ից մինչև 1x106 Da միջին մոլեկուլային զանգվածով: Նման դիտարկումները ցույց են տալիս, որ LPS-ի ենթամիավորների միջև հիդրոֆոբ փոխազդեցությունները մասնիկների չափի կարևոր որոշիչ են (92):

Օգտագործվել են մի քանի մեթոդներ՝ LPS-ի տարբեր ենթադասերը առանձին շտամներից առանձնացնելու համար, որոնցից ամենահաջողակներից են նատրիումի դոդեցիլ սուլֆատ-պոլիակրիլամիդային գելային էլեկտրոֆորեզը (SDS-PAGE) (87-95) և գելային ֆիլտրացումը (96): Այս մեթոդներին, այնուամենայնիվ, խոչընդոտում է LPS-ի ագրեգացման միտումը և յուրաքանչյուր առանձին ենթադաս հայտնաբերելու և նույնականացնելու դժվարությունը (97): Ագարոզա-գելային էլեկտրոֆորեզը օգտագործվել է տարբեր նպատակներով, օրինակ՝ անողնաշարավորների և ողնաշարավորների հյուսվածքներից, օրգաններից և կենսաբանական հեղուկներից արդյունահանվող պոլիսախարիդների առանձնացման համար (97-100): Ավելին, դենսիոմետրիկ ժապավենի վերլուծությունը թույլ է տալիս ստանալ խառնուրդներում առանձին պոլիսախարիդների տեսակների քանակական գնահատում (97):

Թեև ընդհանուր մաքրման արձանագրությունները կարող են նվազեցնել էնդոտոքսինի պարունակությունը շեմային մակարդակից ցածր, բացարձակ երաշխիք չի կարող տրվել: Կարող է պատահել, որ վերջնական արտադրանքի խմբաքանակը պատահաբար աղտոտված է և ձախողում է որակի վերահսկողությունը: Այս ապրանքը պետք է դեն նետվի, վերամշակումը հատուկ չի բացառվում, բայց թանկարժեք այլընտրանք է:

ԵՐԿՖԱԶ ՄԻՑԵԼԱՐ ՀԱՄԱԿԱՐԳ

Վերջին տարիներին մեծանում է հետաքրքրությունը կենսաբանական մոլեկուլների, ինչպիսիք են սպիտակուցները և վիրուսները մաքրելու կամ կոնցենտրացիայի համար երկփուլ ջրային միցելային համակարգերի օգտագործման նկատմամբ (101-103): Այս համակարգերում մակերևութային ակտիվ նյութի ջրային լուծույթը, համապատասխան լուծույթի պայմաններում, ինքնաբերաբար բաժանվում է երկու հիմնականում ջրային, բայց չխառնվող հեղուկ փուլերի, որոնցից մեկն ունի միցելների ավելի մեծ խտություն, քան մյուսը (101): Միկելներով հարուստ և միցելով աղքատ փուլում ֆիզիկաքիմիական միջավայրերի տարբերությունը արդյունավետ տարանջատման հիմքն է և դարձնում է երկփուլ ջրային միցելային համակարգերը հարմար և պոտենցիալ օգտակար մեթոդ կենսանյութերի տարանջատման, մաքրման և կոնցենտրացիայի համար։ (101):

Իրենց ամենապարզ իրականացման դեպքում այս համակարգերը օգտագործում են բացառված ծավալի փոխազդեցությունները ոչ իոնային մակերևութային ակտիվացնող միցելների և բիոմոլեկուլների միջև: Մասնավորապես, փուլային բաժանված համակարգում գոյություն ունեցող փուլերից մեկը հարուստ է միցելներով, մինչդեռ կարգը աղքատ է միցելներով (Նկար 3) (104, 105): Արդյունքում, ոչ իոնային մակերևութային ակտիվացնող միցելների և միցելներով հարուստ փուլի բիոմոլեկուլների միջև բացառված ծավալի ավելի ուժեղ փոխազդեցությունները բիոմոլեկուլները նախընտրելիորեն մղում են միցելով աղքատ փուլ՝ ելնելով դրանց չափերից (106):

Հատկապես էնդոտոքսինների հեռացման համար, մակերեւութային ակտիվ նյութերի կրիտիկական միցելային կոնցենտրացիան (CMC) վերև, էնդոտոքսինները տեղավորվում են միցելյար կառուցվածքում լիպիդ A-ի ալկիլային շղթաների ոչ բևեռային փոխազդեցությամբ և, հետևաբար, անջատվում են ջրային փուլից (միցել- վատ փուլ): Տրիտոն շարքի մակերևութային ակտիվ նյութերը ջրային լուծույթներում ցույց են տալիս խառնելիության բացը: Կրիտիկական ջերմաստիճանից բարձր, այսպես կոչված, ամպամածության կետից բարձր, միցելները ագրեգացվում են շատ ցածր ջրի պարունակությամբ կաթիլների՝ դրանով իսկ ձևավորելով նոր փուլ: Էնդոտոքսինները մնում են մակերեսային ակտիվ նյութերով հարուստ փուլում: Ցենտրիֆուգման կամ ջերմաստիճանի հետագա բարձրացման միջոցով երկու փուլերն առանձնանում են, իսկ մակերեսային ակտիվ նյութով հարուստ փուլը հանդիսանում է ստորին փուլը (66, 105, 107): Անհրաժեշտության դեպքում այս գործընթացը կրկնվում է այնքան ժամանակ, մինչև մնացած էնդոտոքսինի կոնցենտրացիան ցածր լինի շեմային սահմանից: Triton X-114-ի ամպամածության կետը 22°C է, ինչը ձեռնտու է սպիտակուցները մաքրելիս:

Նկար 3: Տրիտոն X-114 միցելային լուծույթի փուլային տարանջատման սխեմատիկ նկարազարդում, ջերմաստիճանի բարձրացման դեպքում: Ստացված համակեցված փուլերից յուրաքանչյուրը պարունակում է գլանաձև միցելներ, բայց տարբեր միցելային կոնցենտրացիաներով: Նկատի ունեցեք նաև, որ միջինում միցելներով հարուստ (ներքևի) փուլի գլանաձև միցելներն ավելի մեծ են, քան միցելներով աղքատ (վերևի) փուլում:

Օգտագործելով Triton X-114, Adam et al. (1995) (108) ցույց է տվել էնդոտոքսինի 100 անգամ կրճատում երկու քայլով՝ 30 ԵՄ մգ-1 էնդոտոքսինի վերջնական պարունակությամբ և էկզոպոլիսաքարիդի կենսաակտիվության 50% կորստով: Բացի այդ, մոտ 100-ապատիկ էնդոտոքսինի կրճատումը ցույց է տվել Cotten et al. (1994) (109), պլազմիդային ԴՆԹ պատրաստումից 0.1 ԵՄ վերջնական էնդոտոքսինի պարունակությամբ 6 &մուգ ԴՆԹ-ում:

Սրտի տրոպոնին I-ի, միոգլոբինի և կրեատին կինազի իզոֆերմենտների ռեկոմբինանտ սպիտակուցների ախտահանման համար տրիտոն X-114 երկփուլ արդյունահանման համեմատությունը նկարագրված է Լիու և այլոց կողմից: (1997) (67). Նրանք եզրակացրեցին, որ փուլային տարանջատումը ամենաարդյունավետ մեթոդն էր՝ նվազեցնելով էնդոտոքսինի պարունակությունը 98-99%-ով, մնացած 2,5-25 ԵՄ մգ-1 քանակով՝ կախված սպիտակուցից: Այնուամենայնիվ, Cotton et al. (1994) (109) նկատեց մի փոքր ավելի լավ հեռացման արդյունավետություն պոլիմիքսին B սորբենտով:

Aida and Pabst (1990) (66) զեկուցել են մի մեթոդ, որը նվազեցնում է էնդոտոքսինը սպիտակուցային լուծույթներում՝ օգտագործելով Triton X-114, որտեղ մակերևութային ակտիվ նյութը օգնում է էնդոտոքսինի բաժանմանը սպիտակուցից՝ միաժամանակ ապահովելով հարմար փուլային տարանջատման հնարավորություն՝ անջատված էնդոտոքսինը հեռացնելու համար: . Ըստ այս նույն հեղինակների, փուլային տարանջատումը Triton X-114-ի միջոցով արդյունավետ էր երեք տարբեր սպիտակուցների լուծույթներից (ցիտոքրոմ) էնդոտոքսինի նվազեցման համար գալբումին և կատալազ): Ֆազային տարանջատման առաջին ցիկլը 1000 անգամ նվազեցրեց էնդոտոքսիններով աղտոտվածությունը: Ֆազային տարանջատման հետագա ցիկլերը հանգեցրին էնդոտոքսինի ամբողջական հեռացմանը: Էնդոտոքսինը հայտնաբերվել է լվացող միջոցի փուլում, իսկ վերին ջրային փուլը պարունակում է ցանկալի բիոմոլեկուլ: Ի լրումն սպիտակուցային պատրաստուկներից էնդոտոքսինի վարակազերծմանը, ինչպիսիք են ռեկոմբինանտ արտադրանքները կամ մոնոկլոնալ հակամարմինները, Triton X-114-ի միջոցով փուլային բաժանումը պետք է օգտակար լինի ալբումինից կամ լիպոպրոտեիններից լիպիդների հեռացման համար: Հաշվի առնելով, որ որոշակի քանակությամբ մակերեւութային ակտիվ նյութ միշտ մնում է սպիտակուցի լուծույթում, որը պետք է հեռացվի լրացուցիչ կլանման կամ գելի ֆիլտրման գործընթացների միջոցով, այս գործընթացը հանգեցնում է արտադրանքի 10-20% կորստի (66): Առաջարկվել է, որ լվացող միջոցը անջատում է էնդոտոքսինի մոլեկուլը սպիտակուցից և տարանջատում է դիսոցացված մոլեկուլը փուլային տարանջատմամբ՝ օգտագործելով Triton X-114-ի ֆիզիկական բնութագրերը (66): Լյու և այլք: (1997) (67) ցույց տվեց, որ Triton X-114 փուլային տարանջատումը հետագայում կիրառվել է այլ ռեկոմբինանտ սպիտակուցային պատրաստուկների վրա: Կատարելով Triton X-114 փուլային տարանջատման երեք ցիկլ՝ էնդոտոքսինի մակարդակը բոլոր ռեկոմբինանտ սպիտակուցներում ստացված E. coli կրճատվել են սկզբնական գումարի 99%-ով: Ավելին, իմունային ակտիվությունը, ֆիզիկական ամբողջականությունը և սպիտակուցի կենսաբանական ակտիվությունը մնացին անփոփոխ փուլային տարանջատման գործընթացից հետո: Ֆազային բաժանումը կարող է կրկնվել մի քանի անգամ, մինչև էնդոտոքսինը ջրային փուլում հասնի բավարար մակարդակի: Բացի իր պարզությունից, այս ընթացակարգը ծախսարդյունավետ է, հատկապես մեծ մասշտաբով:

Ֆիսկե և այլք: (2001) (4) ուսումնասիրել է էնդոտոքսինի մակարդակը նվազեցնելու մի շարք մոտեցումներ, ինչպիսիք են էնդոտոքսինի տարանջատման համար ցվիտերիոնային մակերևութային ակտիվ նյութերի օգտագործումը Zwittergent 3-12 (Z3-12) և Zwittergent 3-14 (Z3󈚲): մաքրված UspA2 սպիտակուցից և էնդոտոքսինի հետագա բաժանումը UspA2-ից՝ օգտագործելով իոնափոխանակման կամ գել ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա: UspA2 սպիտակուցը պոտենցիալ պատվաստանյութի թեկնածու է միջին ականջի բորբոքման և դրա հետևանքով առաջացած այլ հիվանդությունների կանխարգելման համար Moraxella catarrhalis (110): UspA2-ից էնդոտոքսինի տարանջատման համար հաջողված մոտեցումը Triton X-100-ի փոխարինումն էր zwitterion surfactant-ով: Triton X-100-ի անկարողությունը տարանջատել էնդոտոքսին-UspA2 համալիրը, չնայած Z3-12-ի և Z3-14-ի հաջողությանը, կարող է լինել մակերեսային ակտիվ նյութերի լիցքավորման բնութագրերում: Triton X-100-ը ոչ իոնային մակերևութային ակտիվ նյութ է, որը չի պարունակում լիցքավորված մասեր, մինչդեռ Zwittergents-ը պարունակում է զվիտերիոնային գլխի խմբեր ինչպես բացասական, այնպես էլ դրական լիցքավորված մասերով: Ցվիտերիոնային մակերևութային ակտիվ նյութերից շատերը արդյունավետորեն չեզոք են, սակայն որոշ դեպքերում առկա է ուժեղ բևեռացում (111): Z3󈚰-ի և Z3-14-ի լիցքի բնութագրերը և մակերեւութային ակտիվ նյութի փոխազդեցությունը կամ էնդոտոքսինի և/կամ սպիտակուցի հետ կարող են օգնել էնդոտոքսինի անջատմանը սպիտակուցից (այս դեպքում՝ UspA2): Մակերեւութային ակտիվ նյութերի միջև կառուցվածքային տարբերությունները կարող են նաև դեր խաղալ էնդոտոքսինի և սպիտակուցի արդյունավետ տարանջատման գործում: Անկախ մեխանիզմից, Zwittergent մակերեւութային ակտիվ նյութի օգտագործումը բավականին հարմար է UspA2-ից LPS-ի հեռացման համար՝ առանց սպիտակուցի իմունոգեն հատկությունների խախտման: Նախքան էնդոտոքսինի նվազեցումը, UspA2 պատրաստուկները պարունակում էին մինչև 158 ԵՄ/կգ: Այնուամենայնիվ, հետևելով քրոմատոգրաֆիային Z3-12 Fiske et al-ի առկայության դեպքում: (2001) (4) հասել է մոտավորապես 0,0072 ԵՄ/կգ մակարդակների: Էնդոտոքսինների հեռացման գործընթացը հաջողությամբ իրականացվել է GMP-ից հետո՝ UspA2 ենթամիավորի պատվաստանյութ արտադրելու համար կլինիկական փորձարկումների համար:

Էնդոտոքսինի մակարդակները, ըստ երևույթին, շատ ավելի բարձր են լուծվող կամ ցիտոպլազմատիկ ֆրակցիաներից ստացված ռեկոմբինանտ սպիտակուցներում, քան չլուծվող կամ ներառական մարմիններից ստացված սպիտակուցներում: Սա համահունչ է այն համոզմունքին, որ բջջային պատում առկա լիպոպոլիսախարիդները լուծվում են բջիջների լիզման գործընթացի ընթացքում: Schnaitman (112) ցույց տվեց, որ բուժումը E. coli Triton X-114-ի, EDTA-ի և լիզոզիմի համակցությամբ հանգեցրին բջջային պատից ամբողջ լիպոպոլիսախարիդների լուծարմանը:

Ռայխելտը և այլք։ (2006) (59) փորձարկեց, թե արդյոք էնդոտոքսինի հեռացումը հնարավոր է ձեռք բերել քրոմատոգրաֆիկ մաքրման ժամանակ՝ օգտագործելով Triton X-114 լվացման փուլերում: Լվացքի փուլերում 0,1% Triton X-114-ի կիրառումը հաջողությամբ նվազեցրեց էնդոտոքսինները հիստիդինի և GST (խեժ GST սեֆարոզա) միաձուլված սպիտակուցի մաքրման ժամանակ, մինչդեռ մակերեւութային ակտիվ նյութից զուրկ լվացման քայլերն անարդյունավետ էին էնդոտոքսինները վերացնելու համար: Ի տարբերություն ստանդարտ արձանագրության օգտագործող մաքրված նյութերի, որը պարունակում է 2500-ից մինչև 34000 ԵՄ մգ-1, Triton X-114-ով մշակված մաքրված ռեկոմբինանտ սպիտակուցները պարունակում են 0,2-ից 4 ԵՄ մգ-1 (նախնական էնդոտոքսինի 1%-ից պակաս կոնցենտրացիաներ): ) Լուծվող ներառական մարմիններում մնացորդային էնդոտոքսինները կարող են հասնել 8 x 106 EU mL-1 մակարդակների, չնայած այն հանգամանքին, որ էնդոտոքսինների մակարդակները ավելի բարձր են հայտնաբերվել լուծվող ֆրակցիաներից մեկուսացված ռեկոմբինանտ սպիտակուցներում (113):

Ապացուցված է, որ էնդոտոքսինները տարբեր իզոէլեկտրական կետերի սպիտակուցներով բարդույթներ են կազմում (8), որտեղ էլեկտրաստատիկ փոխազդեցությունները համարվում են հիմնական շարժիչ ուժերը: Արդյունքում, հիմնական սպիտակուցներից էնդոտոքսինների հեռացումը պետք է ավելի դժվար լինի, քան թթվային սպիտակուցներից (114): Ռայխելտը և այլք։ (2006) (59) ուսումնասիրել է, թե արդյոք Triton X-114-ի օգտագործումը լվացման քայլերում կարող է վերացնել էնդոտոքսինները սպիտակուցներից՝ պ.Ի 8.5-ից բարձր: Նրանք պարզել են, որ Triton X-114-ով լվանալը զուգակցված մերձավոր քրոմատոգրաֆիայի հետ արդյունավետորեն հեռացնել է էնդոտոքսինները բացասական լիցքավորված սպիտակուցներից (SyCRP և NdhR): Ձեռք բերված էնդոտոքսինի նվազագույն կոնցենտրացիան ցածր էր, քան 0,2 ԵՄ մգ-1 սպիտակուցի վերականգնումը, և եկամտաբերությունը մոտ 100% էր (59):

Ջերմաստիճանով առաջացած փուլային տարանջատումը Triton X-114-ով նորագույն և հզոր տեխնիկա է, որն արդյունավետ կերպով առանձնացնում է հիդրոֆոբ և հիդրոֆիլ թաղանթային սպիտակուցները սենյակային ջերմաստիճանում, առանց դենատուրացիայի (107, 115): Այս մեթոդը հաջողությամբ կիրառվել է նաև սպիտակուցներից և ֆերմենտներից էնդոտոքսինի հեռացման համար՝ պահպանելով դրանց բնականոն գործառույթները (66): Ամֆիպաթիկ բնույթի պատճառով LPS-ը նույնպես զգալիորեն հեռացվել է Կլեբսիելլա sp I-714 EPS (արտբջջային պոլիսախարիդներ, որոնք կոչվում են էկզոպոլիսաքարիդներ) 2% Triton X-114-ում արդյունահանման երկու փուլից հետո, կենսաակտիվության միայն կրկնակի նվազմամբ (108): Ըստ նույն հեղինակների՝ Triton X-114 բաժանման տեխնիկան արագ է, արդյունավետ, ոչ քայքայվող և թույլ է տալիս դետոքսիկացիայի բարձր մակարդակ։ Կլեբսիելլա sp I-714 EPS. Էնդոտոքսինի և էկզոպոլիսաքարիդների բաժանումը Կլեբսիելլա sp I-714-ին դժվար է հասնել երկփուլ արդյունահանման այլ մեթոդներով: Բացի այդ, այս մեթոդը հաջողությամբ կիրառվել է նաև էնդոտոքսինով աղտոտված բացասական լիցքավորված EPS-ի մաքրման համար. Pseudomonas solanacearum (108).

Լվացող միջոցները, թեև դրանք նաև շատ արդյունավետ էին LPS մակարդակները նվազեցնելու համար, համեմատաբար թանկ են, զգալի ծախսեր կբերեն արտադրական գործընթացին և կարող են ազդել հետաքրքրող սպիտակուցի կենսաակտիվության վրա: Ցանկալի են այլընտրանքային քիմիկատներ, որոնք կարող են անվտանգ և ծախսարդյունավետ օգտագործվել սպիրտների կամ լվացող միջոցների փոխարեն որպես լվացող միջոցներ՝ LPS-ը սպիտակուցներից բաժանելու համար քրոմատոգրաֆիկ միավորի աշխատանքի ընթացքում: Իդեալում, այս քիմիկատները կլինեն համեմատաբար էժան, քիմիապես լավ հստակեցված, կներկայացնեն նվազագույն անվտանգության խնդիրներ և նվազագույն ազդեցություն կունենան խնդրո առարկա սպիտակուցի կենսաակտիվության վրա, երբ ներդրվում են գործընթացում (9):

ՀԵՌԱՆԿԱՐՆԵՐ

Հաշվի առնելով երկփուլ ջրային միցելային համակարգերի հատկությունները՝ բիոմոլեկուլները հեռացնելու համար, այս հետազոտական ​​խումբը որոշ խոստումնալից արդյունքներ ունեցավ՝ օգտագործելով Triton X-114՝ ֆերմենտացված մշակույթում առկա էնդոտոքսինները հեռացնելու համար: E. coli բջիջները սպիտակուցի արտադրության ընթացքում: Ըստ գրականության ([7], [58], [65], [107]), փուլային տարանջատումը Triton X-114-ի միջոցով արդյունավետ է եղել էնդոտոքսինի նվազեցման համար կենսամոլեկուլներ պարունակող լուծույթներից, սակայն օպտիմալացված պայմանները դեռևս անորոշ են և պահանջում են հետագա հետազոտություն։ .

ԻՇԽԱՆՈՒԹՅՈՒՆ

Հեղինակները երախտապարտ են CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico և FAPESP &ndash Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo ֆինանսական աջակցության համար:


Andrizhiyevskaya E, Chojnicka A, Bautista J, Diner B, van Grondelle R, Dekker J (2005) F685 and F695 fluorescence-ի ծագումը ֆոտոհամակարգում II. Photosynth Res 84 (1-3):173-180: doi:http://dx.doi.org/10.1007/s11120-005-0478-7

Arnon DI (1949) Պղնձի ֆերմենտները մեկուսացված քլորոպլաստներում. Պոլիֆենոլօքսիդազը մեջ Beta Vulgaris. Բույսերի ֆիզիոլ 24 (1):1-15. doi:http://dx.doi.org/10.1104/pp.24.1.1

Burke JJ, Ditto CL, Arntzen CJ (1978) Լույսի հավաքման համալիրի ներգրավումը քլորոպլաստներում գրգռման էներգիայի բաշխման կատիոնների կարգավորման մեջ: Արխիվ կենսաքիմիայի և կենսաֆիզիկայի 187 (1):252-263. doi:http://dx.doi.org/10.1016/0003-9861(78)90031-0

Chitnis VP, Chitnis PR (1993) PsaL ստորաբաժանումը անհրաժեշտ է ցիանոբակտերիում Synechocystis sp-ում ֆոտոհամակարգի I տրիմերների ձևավորման համար: PCC 6803. FEBS Letters 336 (2):330-334. doi:http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793(93)80831-E

Collini E, Wong CY, Wilk KE, Curmi PMG, Brumer P, Scholes GD (2010) Համահունչ լարային լույսի հավաքում ֆոտոսինթետիկ ծովային ջրիմուռներում շրջակա միջավայրի ջերմաստիճանում: Բնություն 463 (7281):644-647. doi:http://dx.doi.org/10.1038/nature08811

Fromme P, Witt HT (1998) Կառուցվածքային վերլուծության համար I ֆոտոհամակարգի բարելավված մեկուսացումը և բյուրեղացումը. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1365 (1–2):175-184: doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0005-2728(98)00059-0

Giardi MT, Pace E (2005) Ֆոտոսինթետիկ սպիտակուցներ տեխնոլոգիական կիրառությունների համար. Կենսատեխնոլոգիայի միտումները 23 (5):257-263. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2005.03.003

Grätzel M (2001) Ֆոտոէլեկտրաքիմիական բջիջներ. Բնություն 414 (6861):338-344. doi:http://dx.doi.org/10.1038/35104607

Gunther D, LeBlanc G, Prasai D, Zhang JR, Cliffel DE, Bolotin KI, Jennings GK (2013) Photosystem I գրաֆենի վրա որպես բարձր թափանցիկ, ֆոտոակտիվ էլեկտրոդ: Լանգմյուիր 29 (13): 4177-4180: doi:http://dx.doi.org/10.1021/la305020c

Hui Y, Jie W, Carpentier R (2000) ֆոտոհամակարգի I համալիրի դեգրադացիան ֆոտոինհիբիացիայի ժամանակ: Ֆոտոքիմիա և ֆոտոկենսաբանություն 72 (4):508-512. doi:http://dx.doi.org/10.1562/0031-8655(2000)0720508DOTPIC2.0.CO2

Jordan P, Fromme P, Witt HT, Klukas O, Saenger W, Krauß N (2001) I ցիանոբակտերիալ ֆոտոհամակարգի եռաչափ կառուցվածքը 2,5 Å լուծաչափով: Nature 411 (6840):909-917. doi:http://dx.doi.org/doi:10.1038/35082000

Karapetyan NV, Dorra D, Schweitzer G, Bezsmertnaya IN, Holzwarth AR (1997) Երկարալիքային քլորոֆիլների ֆլյուորեսցենտային սպեկտրոսկոպիա ցիանոբակտերիայից Spirulina platensis-ի տրիմերային և մոնոմերային ֆոտոհամակարգի I միջուկային համալիրներում: Կենսաքիմիա 36 (45):13830-13837. doi:http://dx.doi.org/10.1021/bi970386z

Kargul J, Janna Olmos JD, Krupnik T (2012) I ֆոտոհամակարգի կառուցվածքը և գործառույթը և դրա կիրառումը բիոմիմետիկ արևային-վառելիքի համակարգերում: Բույսերի ֆիզիոլոգիայի ամսագիր 169 (16):1639-1653: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jplph.2012.05.018

Krassen H, Schwarze A, Friedrich Br, Ataka K, Lenz O, Heberle J (2009) Photosynthetic Hydrogen Production by a Hybrid Complex of Photosystem I and [NiFe]-Hydrogenase. ACS Nano 3 (12):4055-4061: doi:http://dx.doi.org/10.1021/nn900748j

Kruip J, Karapetyan NV, Terekhova IV, Rögner M (1999) Մեմբրանային սպիտակուցային համալիրի In vitro օլիգոմերացում. մեկուսացված մոնոմերներից I trimeric photosystem-ի լիպոսոմների վրա հիմնված վերականգնումը. Journal of Biological Chemistry 274 (26):18181-18188. doi:http://dx.doi.org/10.1074/jbc.274.26.18181

Kühlbrandt W, Thaler T, Wehrli E (1983) Լույս հավաքող քլորոֆիլ a/b սպիտակուցային համալիրի թաղանթային բյուրեղների կառուցվածքը. Բջջային կենսաբանության ամսագիր 96 (5): 1414-1424: doi:http://jcb.rupress.org/content/96/5/1414.full.pdf

Lichtenthaler HK, Buschmann C (2001) Քլորոֆիլներ և կարոտինոիդներ. Չափում և բնութագրում UV-VIS սպեկտրոսկոպիայի միջոցով: In: Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley & Sons, Inc. doi:http://dx.doi.org/10.1002/0471142913.faf0403s01

Liu Z, Yan H, Wang K, Kuang T, Zhang J, Gui L, An X, Chang W (2004) Սպանախի հիմնական լույսի հավաքման համալիրի բյուրեղային կառուցվածքը 2.72 Å լուծաչափով: Nature 428 (6980):287-292. doi:http://dx.doi.org/10.1038/nature02373

Liu S, Qiu Y, Yu D (2010) Ամֆիֆիլային պեպտիդային մակերեւութային ակտիվ նյութերի ազդեցությունը լույսի հավաքման համալիրի վրա II. Ֆոտոսինթետիկա 48 (4):610-616. doi:http://dx.doi.org/10.1007/s11099-010-0078-4

Matsumoto K, Vaughn M, Bruce BD, Koutsopoulos S, Zhang S (2009) Designer Peptide Surfactants կայունացնում են ֆունկցիոնալ ֆոտոհամակարգ-I թաղանթային համալիրը ջրային լուծույթում երկար ժամանակով: The Journal of Physical Chemistry B 113 (1): 75-83. doi:http://dx.doi.org/10.1021/jp8021425

Matsumoto K, Zhang S, Koutsopoulos S (2010) Ֆոտոսհամակարգ I-ի էլեկտրոնների փոխանցման ուժեղացված ակտիվությունը ջրային լուծույթում պոլիկացիաներով: Biomacromolecules 11 (11):3152-3157. doi:http://dx.doi.org/10.1021/bm100950g

Mershin A, Matsumoto K, Kaiser L, Yu D, Vaughn M, Nazeeruddin MK, Bruce BD, Graetzel M, Zhang S (2012) Self-assembled photosystem-I biophotovoltaics on nanostructured TiO2 և ZnO. Գիտական ​​ներկայացուցիչ 2. doi:http://dx.doi.org/10.1038/srep00234

Nakamura A, Akai M, Yoshida E, Taki T, Watanabe T (2003) Քլորոֆիլ a'-ի և ֆիլոքինոնի հակադարձ փուլային HPLC որոշումը թթվածնային ֆոտոսինթետիկ օրգանիզմների ֆոտոհամակարգ I-ում: European Journal of Biochemistry 270 (11):2446-2458. doi:http://dx.doi.org/10.1046/j.1432-1033.2003.03616.x

Nelson N, Ben-Shem A (2004) Թթվածնային ֆոտոսինթեզի բարդ ճարտարապետությունը. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (12):971-982: doi:http://dx.doi.org/doi:10.1038/nrm1525

Privé GG (2007) Լվացող միջոցներ մեմբրանի սպիտակուցների կայունացման և բյուրեղացման համար. Մեթոդներ 41 (4):388-397: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.01.007

Reithmeier RAF (2007) Մեմբրանի սպիտակուցների կառուցվածքային կենսաբանություն. Մեթոդներ 41 (4):353-354: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymeth.2007.02.016

Schlodder E, Çetin M, Byrdin M, Terekhova IV, Karapetyan NV (2005) P700 + - and 3 P700-induced of the fluorescence at 760 nm trimeric Photosystem I համալիրներում cyanobacterium Arthrospira platensis-ից: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1706 (1–2):53-67: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.bbabio.2004.08.009

Շուբին Վ.Վ., Բեզսմերթնայա Ի.Ն., Կարապետյան Ն.Վ. (1992) Սպիրուլինայի մեմբրաններից երկու ֆոտոհամակարգի I-տիպի կոմպլեքսների մեկուսացում, որոնցից մեկը պարունակում է քլորոֆիլ, որը պատասխանատու է 760 նմ 77 K ֆլուորեսցենտային գոտու համար. FEBS Letters 309 (3):340-342. doi:http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793(92)80803-O

Shubin VV, Tsuprun VL, Bezsmertnaya IN, Karapetyan NV (1993) Ֆոտոսհամակարգի I ռեակցիայի կենտրոնի համալիրի տրիմերային ձևերը նախապես գոյություն ունեն Spirulina platensis ցիանոբակտերիումի թաղանթներում. FEBS Letters 334 (1):79-82. doi:http://dx.doi.org/10.1016/0014-5793(93)81685-S

Standfuss J, Terwisscha van Scheltinga AC, Lamborghini M, Kühlbrandt W (2005) Ֆոտոպաշտպանության և ոչ ֆոտոքիմիական մարման մեխանիզմները սիսեռի լույսի հավաքման համալիրում 2,5 Å լուծաչափով: EMBO J 24 (5):919-928. doi:http://dx.doi.org/10.1038/sj.emboj.7600585

Terasaki N, Yamamoto N, Hattori M, Tanigaki N, Hiraga T, Ito K, Konno M, Iwai M, Inoue Y, Uno S, Nakazato K (2009) Ֆոտոսենսորը հիմնված է FET-ի վրա, որն օգտագործում է ֆոտոհամակարգ I-ի կենսաբաղադրիչը՝ պատկերում օգտագործելու համար Սարքեր. Langmuir 25 (19): 11969-11974 թթ. doi:http://dx.doi.org/10.1021/la901091e

Yang Z, Su X, Wu F, Gong Y, Kuang T (2005) Ֆոսֆատիդիլգլիցերինի ազդեցությունը ֆոտոհամակարգի մոլեկուլային կազմակերպման վրա I. Biophysical Chemistry 115 (1):19-27: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.bpc.2005.01.004

Yu D, Huang F, Xu H (2012) Սինխրոն ֆլուորեսցենտային սպեկտրոմետրիայի միջոցով կրիտիկական կոնցենտրացիաների որոշում. Վերլուծական մեթոդներ 4 (1):47-49. doi:http://dx.doi.org/10.1039/C1AY05495C

Yu D, Zhu G, Liu S, Ge B, Huang F (2013) Սպանախից և դրա պիգմենտներից մեկուսացված լույսի հավաքման համալիր II-ի ֆոտոհոսանքի ակտիվությունը ներկով զգայուն TiO-ում2 արևային մարտկոց: Ջրածնի էներգիայի միջազգային հանդես 38 (36):16740-16748: doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.ijhydene.2013.02.114


Կարո՞ղ է արդյոք սպիտակուցի նմուշը պատրաստել 2% Triton X-100 անվճար: - Կենսաբանություն

Սպիտակուցների քանակական վերլուծությունների վերանայում և պաշտոնական հրապարակումների վրա հիմնված սպիտակուցային վերլուծությունների վերաբերյալ հարցում:

Սպիտակուցների ճշգրիտ քանակությունը կարևոր է բազմաթիվ հետազոտական ​​թեմաներում սպիտակուցների ուսումնասիրության համար: Մշակվել են տարբեր մեթոդների լայն տեսականի՝ ինչպես սպիտակուցների բարդ խառնուրդների, այնպես էլ մեկ տեսակի սպիտակուցների քանակական գնահատման համար: Ընդհանուր սպիտակուցի քանակական մեթոդները ներառում են ավանդական մեթոդներ, ինչպիսիք են 280 նմ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման ներծծման չափումը, բիցինխոնինաթթվի (BCA) և Բրեդֆորդի վերլուծությունները, ինչպես նաև այլընտրանքային մեթոդները, ինչպիսիք են Lowry-ն կամ առևտրային մատակարարների կողմից մշակված նոր վերլուծությունները, որոնք հաճախ ապահովում են լավ մշակված. հարմար հավաքածու յուրաքանչյուր տեսակի վերլուծության համար: Անհատական ​​սպիտակուցների քանակական մեթոդները ներառում են ֆերմենտային կապակցված իմունոսորբենտ վերլուծություն (ELISA), western blot վերլուծություն և վերջերս՝ զանգվածային սպեկտրոմետրիա, ի թիվս այլոց: Սպիտակուցների ճշգրիտ քանակությունը կարևոր է բազմաթիվ հետազոտական ​​թեմաներով սպիտակուցների ուսումնասիրությունների հետ կապված բոլոր փորձերի համար: Տարբեր Տարբեր մեթոդների լայն զանգված մշակվել է սպիտակուցների բարդ խառնուրդների քանակական գնահատման համար տվյալ վերլուծության մեջ ընդհանուր սպիտակուցի պարունակության և ինչպես նաև մեկ տեսակի սպիտակուցի համար: Ընդհանուր սպիտակուցի քանակական մեթոդները ներառում են ավանդական մեթոդներ, ինչպիսիք են 280 նմ ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման կլանման չափումը, բիցինխոնինաթթվի (BCA) և Բրեդֆորդի վերլուծությունները, ինչպես նաև այլընտրանքային մեթոդները, ինչպիսիք են Lowry-ն կամ նոր վերլուծությունները, որոնք մշակվել են առևտրային մատակարարների կողմից: Սովորաբար առևտրային մատակարարներ, որոնք հաճախ տրամադրում են լավ մշակված, հարմար հավաքածու յուրաքանչյուր տեսակի վերլուծության համար: Անհատական ​​սպիտակուցների քանակական մեթոդները ներառում են ֆերմենտային իմունոսորբենտային վերլուծություն (ELISA), western blot վերլուծություն և վերջերս զանգվածային սպեկտրոմետրիա, ի թիվս այլոց: Որոշ դեպքերում առևտրային խմբերի կանոնակարգերը կամ օրենքները կարող են պահանջել սպիտակուցների քանակական որոշման հատուկ մեթոդներ: Օրինակ, Միջազգային շիճուկների արդյունաբերության ասոցիացիան (www.serumindustry.org), որը շիճուկ մատակարարողների առևտրային խումբ է, առաջարկում է Biuret մեթոդը շիճուկային արտադրանքներում սպիտակուցի պարունակության որոշման համար:

Այստեղ մենք քննարկում ենք որոշ ընդհանուր մեթոդներ, որոնք օգտագործվում են լուծույթում սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշելու համար՝ ընդգծելով դրանց օգտակարությունն ու սահմանափակումները: Կարևոր է նշել, որ այս սպիտակուցային վերլուծություններից և ոչ մեկը հատուկ չէ սպիտակուցներին, ինչը նշանակում է, որ ոչ սպիտակուցային բաղադրիչները կարող են խանգարել, կամ միատեսակ ճշգրիտ և համատեղելի են բոլոր սպիտակուցների հետ: Ավելին, սպիտակուցի փոփոխությունները կարող են խանգարել որոշ վերլուծությունների համար սպիտակուցի կոնցենտրացիայի գնահատմանը, երբ համեմատվում են չփոփոխված սպիտակուցի հետ [3, 4]: Բացի այդ, որոշ անալիզներ, օրինակ՝ 3-(4-կարբոքսիբենզոյլ)խինոլին-2-կարբոքսալդեհիդի (CBQCA) վերլուծությունը նույնպես արդյունավետ են, երբ օգտագործվում են մակերեսին կցված կամ պարկուճված պեպտիդների կամ սպիտակուցների քանակականացման համար [5]:

Աղյուսակ 1-ում ամփոփված են ընդհանուր ընդհանուր սպիտակուցի քանակական վերլուծությունները: Ավելի քիչ տարածվածներ, ինչպիսիք են Pierce 660-ը Thermo-ից (կատալոգ #22660) [6], NanoOrange սպիտակուցի քանակականացումը [7], Qubit ֆտորոմետրը [8], O-proparyl-Puromycin-ի վրա հիմնված Protein Synthesis Assay հավաքածուն նորածին սպիտակուցների համար [9], չեն քննարկվում։ Կարևոր է գնահատել յուրաքանչյուր հետազոտության համատեղելիությունը նմուշների տեսակների, փորձարկման միջակայքի, նմուշի ծավալի և համապատասխան սպեկտրոֆոտոմետրի առկայության, ինչպես նաև ժամանակի և ծախսերի հետ:

փորձարկում կլանում մեխանիզմ հայտնաբերման սահմանը առավելություններ թերություններ
Ուլտրամանուշակագույն կլանումը280 նմթիրոզինի և տրիպտոֆանի կլանումը0,1-100 մգ/մլփոքր նմուշի ծավալ, արագ, ցածր գնովանհամատեղելի է լվացող միջոցների և դենատուրացնող նյութերի հետ, բարձր փոփոխականություն
Բիցինխոնինաթթու562 նմպղնձի վերականգնում (Cu 2+-ից Cu 1+), BCA ռեակցիա Cu 1+-ով 20-2000 մգ/մլհամատեղելի է լվացող միջոցների և denaturating գործակալների հետ, ցածր փոփոխականությունցածր կամ ոչ համատեղելիություն նվազեցնող նյութերի հետ
Bradford կամ Coomassie փայլուն կապույտ470 նմCoomassie փայլուն կապույտ ներկի և սպիտակուցների միջև բարդ ձևավորում20-2000 մգ/մլհամատեղելի է նվազեցնող նյութերի հետ, արագանհամատեղելի է լվացող միջոցների հետ
Լոուրի750 նմպղնձի նվազեցում սպիտակուցներով, Folin-Ciocalteu կրճատում պղինձ-սպիտակուցային համալիրով10-1000 մգ/մլբարձր զգայունություն և ճշգրտությունանհամատեղելի է լվացող միջոցների և նվազեցնող միջոցների հետ, երկար ընթացակարգ

Անուշաբույր ամինաթթուները թիրոզինը և տրիպտոֆանը սպիտակուցներին տալիս են իրենց բնորոշ ուլտրամանուշակագույն (ուլտրամանուշակագույն) կլանումը 280 նմ-ում, որը սովորաբար օգտագործվում է սպիտակուցի կոնցենտրացիան գնահատելու համար: Ֆենիլալանինի և դիսուլֆիդային կապերը նույնպես նպաստում են կլանմանը 280 նմ-ում, թեև աննշան: Այս մեթոդը պարզ է և կարող է իրականացվել չափազանց փոքր նմուշի ծավալով, մինչև 0,5 մլ, քանի որ նոր սպեկտրոֆոտոմետրերը օգտագործում են նմուշի պահպանման համակարգ չափման ընթացքում: Այնուամենայնիվ, սպիտակուցի նմուշը չպետք է պարունակի ոչ սպիտակուցային բաղադրիչ՝ 280 նմ զգալի կլանմամբ, օրինակ՝ նուկլեինաթթուներով աղտոտիչներ [10]: Մաքուր սպիտակուցի նմուշների համար վերլուծված սպիտակուցի ճշգրիտ ամինաթթուների հաջորդականությունը պետք է հայտնի լինի և որոշակի սպիտակուցին հատուկ կլանման գործակիցը պետք է հաշվարկվի մինչև լուծույթի կոնցենտրացիան որոշելը [11, 12]: Այս մեթոդը ամենաարագն է, բայց սխալների հակված և անհամատեղելի է սպիտակուցի արդյունահանման մեթոդների լայն շրջանակի հետ, որոնք հաճախ օգտագործում են լվացող միջոցներ և դենատուրացնող նյութեր:

Բիցինխոնինաթթվի (BCA) անալիզը հայտնագործվել է 1985 թվականին Փոլ Կ. Սմիթի կողմից Pierce Chemical Company-ում, որն այս վերլուծության հիմնական դիստրիբյուտորն է [13]: Երկու BCA և Lowry վերլուծությունները հիմնված են ալկալային պայմաններում Cu 2+-ի Cu 1+-ի փոխակերպման վրա: Այս փոխակերպումը կոչվում է Բիուրետի ռեակցիա (Նկար 1) և ազդում է մի քանի ամինաթթուների մնացորդներից (ցիստեին, ցիստին, թիրոզին և տրիպտոֆան) և պեպտիդային ողնաշարից:

BCA-ն յուրահատուկ քրոմոգեն ռեագենտ է Cu 1+-ի համար և ռեակցիայի երկրորդ փուլում BCA երկու մոլեկուլ փոխազդում է մեկ Cu 1+ իոնի հետ: Կրճատված Cu 2+-ի քանակը սպիտակուցի կոնցենտրացիայի ֆունկցիան է, որը կարող է որոշվել սպեկտրոֆոտոմետրիկ եղանակով՝ նմուշի լուծույթի գույնի փոփոխությամբ կապույտից մանուշակագույնի, որը կլանում է լույսը 562 նմ-ով: Ներծծումն ուղիղ համեմատական ​​է լուծույթում առկա սպիտակուցի քանակին և այն կարելի է գնահատել՝ համեմատելով հայտնի սպիտակուցային ստանդարտի հետ, ինչպիսին է տավարի շիճուկի ալբումինը (BSA) [10, 14, 15]: Քանի որ BSA-ն և չափված սպիտակուցը/պեպտիդը կարող են ունենալ տարբեր քրոմոֆոր զարգացում, սպիտակուցի/պեպտիդների քանակը պետք է ճշգրտվի: Օրինակ, Nortley R-ը և այլոք բազմապատկել են ամիլոիդ-բետա պեպտիդների չափված կոնցենտրացիան Pierce BCA սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուի և BSA-ի հետ որպես ստանդարտ 1,51 գործակցով [16]:

BCA վերլուծությունն ընդհանուր առմամբ հանդուրժում է իոնային և ոչ իոնային լվացող միջոցները, ինչպիսիք են NP-40-ը, Triton X-100-ը և դենատորացնող նյութերը, ինչպիսիք են միզանյութը և գուանիդինիումի քլորիդը, որոնք հակված են խանգարելու այլ գունաչափական սպիտակուցային վերլուծություններին, ինչպիսիք են Lowry-ն (Աղյուսակ 2) [15]: Այնուամենայնիվ, որոշ ռեակտիվներ, ինչպիսիք են էթիլենդիամինետրաքացախաթթուն (EDTA) [17], նվազեցնող շաքարները [18, 19] և լիպիդները [20], կարող են խանգարել BCA վերլուծությանը: Նման միջամտությունների ազդեցությունը կարող է բարելավվել այնպիսի ռազմավարություններով, ինչպիսիք են՝ նվազեցնելով խանգարող նյութերը դիալիզի, գելային ֆիլտրման միջոցով կամ եթե սպիտակուցի կոնցենտրացիան բավականաչափ բարձր է՝ նմուշը նոսրացնելով: Reichelt-ը և այլոք առաջարկել են մեթոդի պարզ ճշգրտումներ, որոնք կարող են հանգեցնել չափումների ճշգրտության տեսանելի բարելավման, հատկապես չմաքրված սպիտակուցի համար բարդ լուծույթներում, ինչպիսիք են կուլտուրայի միջավայրերը [21]: Նրանք օգտագործում են ուղղիչ գործոն, որը տրվում է յուրաքանչյուր նմուշի վրա ավելացված BSA սպիտակուցի ներքին աճի չափման միջոցով: Հիմնվելով նրանց ուսումնասիրությունների վրա՝ BCA սպիտակուցի քանակական հաշվարկի ճշգրտությունը կարող է հինգ անգամ բարելավվել՝ BCA քանակական հաշվարկի ճշգրտությունը համեմատելի դարձնելով ավելի թանկ մոտեցումների հետ [21]:

Մեկ այլ գործոն, որը խանգարում է BCA վերլուծության ճշգրտությանը, սպիտակուցում քիմիական ձևափոխված մնացորդների առկայությունն է: Բրեդին և Մաքնաթանը գնահատեցին լիզիլ մեթիլացման ազդեցությունը Բրեդֆորդի և BCA վերլուծությունների վրա և պարզեցին, որ BCA հետազոտության համար մեթիլացված սպիտակուցի նմուշներում սպիտակուցի կոնցենտրացիաները հետևողականորեն գերագնահատված էին [4]:

NP-40Սախարոզա
ԷմուլգենԳլիցին, pH 2,8
ՀԵՊԵՍԳլյուկոզա
DTTEDTA
Տրիտոն X-100NaCl
ՄիզանյութՆաՕՀ
Գուանիդին HClԱմոնիումի սուլֆատ
Նատրիումի ացետատ, pH 5,5SDS

Thermo Fisher Pierce-ն ունի BCA Protein վերլուծության նոր տարբերակը, որը կոչվում է Pierce™ BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible, որը հանդուրժում է դիթիոթրեիտոլը (DTT), 2-mercaptoethanol (BME), TCEP և այլ դիսուլֆիդը նվազեցնող նյութեր [22]:

BCA վերլուծությունը շատ առավելություններ ունի. Համեմատած այլ մեթոդների հետ՝ BCA վերլուծությունը ամենազգայուններից մեկն է (այն կարող է հայտնաբերել սպիտակուցներ 5 մգ/մլ ցածր կոնցենտրացիաներում): Այն ունի ավելի քիչ փոփոխականություն, քան մյուսները (այսինքն՝ Բրեդֆորդի վերլուծությունը), և այն կարող է օգտագործվել սպիտակուցի կոնցենտրացիայի լայն շրջանակ չափելու համար: Ավելին, դրա զգայունությունը կարող է մեծանալ՝ անալիզը կատարելով պլազմոնային նանոզենսորների առկայության դեպքում, ինչպես SPR-BCA (Մակերևութային պլազմոնային ռեզոնանս–BCA) վերլուծության մեջ, որն առաջարկվել է Լիուի և այլոց կողմից [23]: Այս վերլուծության դեպքում հայտնաբերման սահմանը 3,4 նգ/մլ էր, իսկ ընդհանուր աշխատանքային միջակայքը՝ 0,5-ից մինչև 1000 մկգ/մլ, այդպիսով նվազեցնելով սպիտակուցի կոնցենտրացիաները, որոնք կարելի է չափել ավանդական BCA վերլուծության միջոցով:

Բրեդֆորդի վերլուծությունը, որն ի սկզբանե նկարագրվել է դոկտոր Մարիոն Բրեդֆորդի կողմից 1976 թվականին, սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշելու հանրաճանաչ մեթոդ է: Այն հիմնված է Coomassie փայլուն կապույտ G-250 ներկի և լուծույթի մեջ գտնվող սպիտակուցների միջև համալիրի ձևավորման վրա: Ազատ ներկը գոյություն ունի չորս տարբեր իոնային ձևերով: Ավելի անիոնային կապույտ ձևը կապվում է սպիտակուցների հետ և ունի ներծծում 595 նմ (Նկար 2): Սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշվում է կապույտ իոնային ձևով ներկանյութի քանակով, որը չափվում է լուծույթի ներծծմամբ 595 նմ սպեկտրոֆոտոմետրի միջոցով [24]: Ներկանյութը հիմնականում կապվում է արգինինի, տրիպտոֆանի, թիրոզինի, հիստիդինի և ֆենիլալանինի մնացորդների հետ [10]:

Հետազոտողների մեծամասնությունն օգտագործում է BSA-ն որպես սպիտակուցի ստանդարտ, քանի որ այն էժան է և հեշտ հասանելի, բայց միշտ չէ, որ հարմար է: Իսկապես, BSA-ի օգտագործման թերությունն այն է, որ այն ցուցադրում է ներկանյութի ուժեղ արձագանք և կարող է հանգեցնել նմուշների սպիտակուցի կոնցենտրացիայի թերագնահատմանը: Սա խնդիր չէ, եթե անհրաժեշտ է միայն նմուշների հարաբերական կոնցենտրացիաներ: Այնուամենայնիվ, եթե անհրաժեշտ է սպիտակուցի կոնցենտրացիայի ճշգրիտ չափում, իմունոգլոբուլին G (IgG), լիզոզիմը կամ այլ սպիտակուցային ստանդարտները հաճախ ավելի լավ ընտրություն են՝ կախված նմուշի սպիտակուցից [24]:

Բրեդֆորդի վերլուծության առավելություններից է համատեղելիությունը լուծույթում սպիտակուցները կայունացնելու համար օգտագործվող վերականգնող նյութերի հետ, որոնք համատեղելի չեն Լոուրիի և որոշ չափով համատեղելի չեն BCA վերլուծության հետ: Բացի այդ, քանի որ ներկը չի կապվում ցածր ՄՎտ ունեցող պեպտիդներին, դուք կարող եք չափել բարձր մոլեկուլային քաշի (ՄՎտ) սպիտակուցների կոնցենտրացիաները աղտոտող պեպտիդների առկայության դեպքում [10, 24]:

Բրեդֆորդի հետազոտության հիմնական սահմանափակումը դրա անհամատեղելիությունն է լվացող միջոցների մեծ մասի հետ, որոնք սովորաբար օգտագործվում են թաղանթային սպիտակուցները լուծելու համար: (Հետաքրքիր է, սակայն, որ ոչ իոնային լվացքի շատ ցածր մակարդակները, ինչպիսին Triton X-100-ն է, կարող է բարելավել Բրեդֆորդի վերլուծության զգայունությունն ու փոփոխականությունը [25] ): Լվացող միջոցները կարող են հեռացվել գելային ֆիլտրման կամ դիալիզի միջոցով, կամ կալցիումի ֆոսֆատով [24] կամ ացետոնով տեղումների միջոցով: Այս մեթոդները կարող են հանգեցնել նմուշի նոսրացման կամ նմուշի կորստի՝ սկզբնական սպիտակուցի քանակի 70%-ի կամ պակասի վերականգնմամբ: Չենգը և ուրիշները նկարագրել են սպիտակուցի նստեցում և Բրեդֆորդի վերլուծության վրա հիմնված մեթոդ, որը թույլ է տալիս արագորեն չափել սպիտակուցը, նույնիսկ երբ սպիտակուցի լուծույթը պարունակում է խանգարող նյութեր [26]: Մեթոդը հասնում է սպիտակուցի վերականգնման բարելավված արագության՝ սախարոզայի ավելացումից հետո միայն ացետոնով մեկժամյա տեղումներից հետո, բաղադրիչ, որը չի խանգարում Բրեդֆորդի վերլուծությանը:

Լոուրիի վերլուծությունը, որն առաջարկել է Օլիվեր Հ. Լոուրին 1951 թվականին, հիմնված է երկու քիմիական ռեակցիաների վրա (Նկար 3): Առաջին ռեակցիան ալկալային պայմաններում պղնձի իոնների վերականգնումն է, որը կազմում է պեպտիդային կապերի բարդույթ (վերը քննարկված Բիուրետի ռեակցիան)։ Երկրորդը Folin-Ciocalteu ռեագենտի կրճատումն է պղնձի-պեպտիդային կապի համալիրի կողմից, որը հետագայում առաջացնում է լուծույթի գույնի փոփոխություն դեպի կապույտ՝ սպեկտրոֆոտոմետրով հայտնաբերվող 650-ից 750 նմ ներծծմամբ [10]: Նմուշում սպիտակուցի քանակը կարելի է գնահատել՝ օգտագործելով ընտրված ստանդարտ սպիտակուցային լուծույթի ստանդարտ կորը, ինչպիսին է BSA-ն:

Այս վերլուծության առավելությունները նրա զգայունությունն են և ամենակարևորը՝ ճշգրտությունը: Այնուամենայնիվ, այն պահանջում է ավելի շատ ժամանակ, քան մյուս անալիզները, և շատ միացություններ, որոնք սովորաբար օգտագործվում են սպիտակուցների պատրաստման համար բուֆերներում (օրինակ՝ լվացող միջոցները, ածխաջրերը, գլիցերինը, տրիցինը, EDTA, տրիսը) խանգարում են Lowry-ի վերլուծությանը և ձևավորում նստվածքներ (Աղյուսակ 3) [10] . Այնուամենայնիվ, այս նյութերի ազդեցությունը կարող է կրճատվել նմուշը նոսրացնելով, բայց միայն այն դեպքում, եթե սպիտակուցի կոնցենտրացիան բավականաչափ բարձր է [27]: Ավելին, ցույց է տրվել, որ այս վերլուծության կատարման ժամանակը կարող է կրճատվել ջերմաստիճանի բարձրացման կամ միկրոալիքային վառարան օգտագործելու միջոցով [27]:

Լվացող միջոցներԴիսուլֆիդային միացություն
ԱծխաջրերՖենոլ
ԳլիցերինՈւրիկաթթու
ՏրիցինԳուանին
EDTAՔսանթին
ՏրիսՄագնեզիում կալցիում
Կալիումի միացություններՍուլֆհիդրիլային միացություններ

3-(4-carboxybenzoyl)quinoline-2-carboxaldehyde-ը (CBQCA) զգայուն ֆտորոգեն ռեագենտ է, որն օգտագործվում է սպիտակուցներում ամինների հայտնաբերման համար: Քանի որ այն կարող է հայտնաբերել միայն ստուգված սպիտակուցի հասանելի ամինները, այս մեթոդն ունի սպեկտրոֆոտոմետրիկ մեթոդների նույն սահմանափակումները, որոնց արդյունքը կախված է սպիտակուցի որոշակի ամինաթթուների քանակից: Այնուամենայնիվ, CBQCA-ն շատ զգայուն է և կարող է հայտնաբերել 10 նգ-ից մինչև 150 մգ սպիտակուց 100 մլ ծավալում: Նաև դրական կողմն այն է, որ CBQCA ռեագենտը լավ է գործում այնպիսի նյութերի առկայության դեպքում, ինչպիսիք են լիպիդները, որոնք հայտնի են որպես սպիտակուցների որոշման շատ այլ մեթոդներ [28], կամ երբ օգտագործվում են մակերեսին կցված կամ պարկուճված պեպտիդների կամ սպիտակուցների քանակականացման համար [5] .

Բազմաթիվ կենսաբժշկական լաբորատոր փորձերի որոշիչ քայլը լուծույթում կոնկրետ սպիտակուցի քանակականացումն է: Դա իրագործելու համար կիրառվել են մի քանի տեխնիկա: Այս քանակական մեթոդներից տարածվածներն են ELISA, western blot վերլուծություն և զանգվածային սպեկտրոմետրիա: ELISA-ն և Western blot-ը քննարկվում են Antibody Applications-ում, զանգվածի սպեկտրը քննարկվում է այստեղ հակիրճ և քննարկվում է Labome-ի վերանայման հոդվածում Սպիտակուցների քանակական բիովերլուծություն զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով:

Սպիտակուցների զանգվածային սպեկտրոմետրիան համեմատաբար նոր և զարգացող մեթոդ է սպիտակուցների քանակական չափման համար: Բացի սպիտակուցի բնութագրումից, պրոտեոմիական վերլուծության կարևոր քայլը որոշակի սպիտակուցի քանակականացման հնարավորությունն է: Զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով սպիտակուցների քանակական չափման համար ներդրվել և ներդրվել են բազմաթիվ տեխնիկա:Երբ սպիտակուցի պիտակավորումը հնարավոր է, մեկ սպիտակուցի կամ պեպտիդային նմուշը պիտակավորված է կայուն ավելի ծանր իզոտոպով (օրինակ՝ 13 C կամ 15 N), մինչդեռ երկրորդ նմուշը (ներքին ստանդարտ) պիտակավորված է ավելի թեթև իզոտոպով (օրինակ՝ 12 C կամ 14 N): . Նմուշները խառնվում են, և պիտակների պատճառով զանգվածային տարբերությունները հնարավորություն են տալիս զանգվածային անալիզատորի միջոցով վերլուծել նմուշի երկու գագաթնակետային ինտենսիվության հարաբերակցությունը, որը համապատասխանում է դրանց հարաբերական առատության հարաբերակցությանը: Այլընտրանքային մեթոդները թույլ են տալիս սպիտակուցի քանակական չափումը զանգվածային սպեկտրոմետրիայի միջոցով՝ առանց նմուշների պիտակավորման [29]:

Հատկապես հուզիչ է զանգվածային սպեկտրոմետրիան որպես համընդհանուր մոտեցում՝ մեկ չափման մեջ ինչպես քանակական, այնպես էլ որակական վերլուծություններ իրականացնելու կարողությունը: Օրինակ, վերջերս հրապարակվել են MS-ի վրա հիմնված բազմաթիվ մեթոդներ, որոնք մշակվել են կենսաբանական նմուշներում հատուկ սպիտակուցների քանակականացման համար: Դրանք ներառում են շիճուկում ինսուլինանման աճի գործոնի 1-ի քանակականացման մեթոդը [30], մեզի մեջ ալբումինի քանակականացման մեթոդը [31] և ուբիկինոնի շիճուկում/պլազմայում [32]: Ավելի քիչ հատուկ թիրախային սպիտակուցների քանակականացման մեթոդներ կարելի է գտնել նաև վերջին գրականության մեջ [33-35]: Հրապարակվել են պեպտիդների և սպիտակուցների նպատակային զանգվածային սպեկտրոմետրիայի չափումների ուղեցույցներ [36], որպեսզի փորձեն ապահովել ճշգրիտ և համադրելի մեթոդներ այս արագ զարգացող մոտեցման մեջ: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդը պահանջում է թանկարժեք գործիքներ, որոնք շատ լաբորատորիաներ չեն կարող թույլ տալ, և դա սահմանափակում է այս մոտեցման օգտակարությունը [14, 37]:

Սպիտակուցների զանգվածային սպեկտրաչափական քանակական հաշվարկի համար մի քանի սպիտակուցների համար ներքին պեպտիդային ստանդարտները կարող են միացվել՝ թույլ տալու համար սպիտակուցների մուլտիպլեքսային վերլուծությունը (QCAT սպիտակուցը) [38]: Մշակվել է այս մեթոդի ընդլայնումը, որտեղ այս միացված պեպտիդները ներառում էին բազմաթիվ հակամարմինների հակագենային էպիտոպներ: Համակցված տրամաչափման սպիտակուցները, որոնք կոչվում են DOSCATs (Կրկնակի ստանդարտ conCATamers) կարող են ծառայել ինչպես զանգվածային սպեկտրոմետրիայի, այնպես էլ վեսթերն բլոտի կարիքներին [39]:

Սպիտակուցի արտահայտումը կարող է վերահսկվել կենդանի բջիջներում՝ գենետիկորեն կապելով հետաքրքրող սպիտակուցը ռեպորտաժային սպիտակուցի կամ էպիտոպի հետ, ինչպիսին է կանաչ լյումինեսցենտ սպիտակուցը (GFP): Հետաքրքրող սպիտակուցը զեկուցողին կապելով որոշակի cis-գործող հիդրոլազային տարրի հետ, որը կոչվում է «Սպիտակուցի քանակական հաղորդիչ» (PQR) [1], թույլ է տալիս սպիտակուցը և թղթակիցը տառադարձվել միասին, բայց թարգմանվել որպես առանձին ֆունկցիոնալ սպիտակուցներ: Սա կարող է ապահովել ինչպես սպիտակուցի, այնպես էլ ռեպորտաժի ստոյխիոմետրիկ արտահայտությունը, ուստի սպիտակուցի քանակը կարելի է եզրակացնել լյումինեսցենտային ինտենսիվությունից (Նկար 4):

Վերը քննարկված քանակական մեթոդների սահմանափակումները հանգեցրել են պարզ և բարդ լուծույթներում սպիտակուցի կոնցենտրացիաների որոշման նոր ռազմավարությունների մշակմանը: Ամենահայտնիներից մեկն օգտվում է նանոմասնիկների օպտիկական հատկություններից [40]: Համառոտ, ալիքի երկարությունը, որով որոշ նանոմասնիկներ կլանում են լույսը, փոխվում է այլ մոլեկուլների միացման կամ ագրեգացիայի պատճառով [41]: Քանի որ լույսի կլանման տիրույթը տեսանելի սպեկտրում է, այս տեղաշարժը ընկալվում է որպես գույնի փոփոխություն: Նանոմասնիկները մինչ այժմ օգտագործվել են սպիտակուցը կապող մասնիկների հետ միասին, օրինակ՝ հակամարմիններ, պեպտիդներ կամ ապտամերներ: Ռոգովսկին և այլք առաջարկեցին նանոմասնիկների ցուցիչի նոր տեսակ՝ սպիտակուցների հայտնաբերման և քանակականացման համար, որը նրանք անվանեցին «քիմիական քիթ» [42]: Նրանց սենսորը բաղկացած է տարբեր ձևերով ոսկու նանոմասնիկների խառնուրդից, որը ցույց է տալիս դիֆերենցիալ ագրեգացիա տարբեր սպիտակուցների հետ փոխազդեցության ժամանակ (Նկար 5): Հիմնվելով իրենց լույսի կլանման սպեկտրների վրա՝ մասնիկները թույլ են տալիս հայտնաբերել և քանակականացնել մաքրված սպիտակուցները ջրային լուծույթներում կամ չմաքրված սպիտակուցները բարդ լուծույթներում:

Քոնգը և ուրիշները մշակեցին մեթոդ՝ օգտագործելով երկար ԴՆԹ կրիչի մոլեկուլներ և պինդ վիճակում գտնվող ապակյա նանոծակեր՝ նանոմոլային միջակայքում լուծույթում սպիտակուցների կոնցենտրացիան չափելու համար [2]: Այս մեթոդով ԴՆԹ-ի կրիչի մոլեկուլները, որոնք ի վիճակի են կապել սպիտակուցները որոշակի վայրերում, էլեկտրական հոսանքի օգնությամբ տեղափոխվում են նանոծակեր: Տրանսլոկացիայի ժամանակ ԴՆԹ-ն առաջացնում է ընթացիկ անկման ազդանշան: Լրացուցիչ անկում է գրանցվում, երբ ԴՆԹ-ին միացված է սպիտակուց։ Որքան բարձր է սպիտակուցի կոնցենտրացիան, այնքան ավելի «բեռնված» է կրիչը: Երկրորդային հոսանքի անկման գագաթնակետերի հաճախականությունը նույնպես մեծանում է սպիտակուցի կոնցենտրացիայի աճով (Նկար 6):

Լաբոմը հետազոտել է պատահականորեն ընտրված գրախոսվող հրապարակումները՝ վկայակոչելով ընդհանուր սպիտակուցի վերլուծությունները: Thermo Fisher Pierce և Bio-Rad Laboratories-ը ճանաչվել են որպես ընդհանուր սպիտակուցի վերլուծության հավաքածուների հիմնական մատակարարներ (Աղյուսակ 4): Առավել հաճախ օգտագործվող մեթոդներն են BCA-ն և Bradford-ը:

ՎերլուծությունՄատակարարՀամարՆմուշի տեղեկանք
BCA / պղնձի վրա հիմնված
Թերմո Ֆիշեր13023275 [43], 23225 [44]
MilliporeSigma8
Բեյոթայմ2
GE առողջապահություն12-D քանակություն [45]
Բրեդֆորդ
Բիո-Ռադ57 [46, 47], 5000006 [48]
Թերմո Ֆիշեր Պիրս11 [49], 23200 [50]
MilliporeSigma1
Էքսպեդեոն1 [44]
Կարլ Ռոթ1Roti-Nanoquant [51]
Lowry / փոփոխված DC վերլուծություն
Բիո-Ռադ17 [52]
MilliporeSigma1
Ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման հայտնաբերում 280 նմ-ով
Thermo Scientific (Nanodrop)3

Գրեթե բոլոր BCA սպիտակուցի անալիզները, որոնք մեջբերվել են հետազոտված կոհորտում, տրամադրվել են Pierce-ի կողմից, որտեղ գիտնականներից մեկը շատ տարիներ առաջ հորինել է վերլուծությունը: Thermo Fisher-ը գնել է Pierce-ը մի քանի տարի առաջ: Thermo Fisher Pierce BCA անալիզներն օգտագործվել են, օրինակ, ուսումնասիրելու համար պրոտեազոմների փուլային տարանջատումը [53], սալմոնելլայի աճը [54], Cox-2 և mPGES-1 արտահայտումը մկների ոսկրածուծից ստացված դենդրիտիկ բջիջներում [55], ազդեցությունը: ամիլոիդ բետա օլիգոմերներ պերիցիտների և մազանոթների վրա [16], α-սինուկլեինի պաթոլոգիական նեյրոդեգեներացիա Պարկինսոնի հիվանդության ժամանակ [56] և այլն [57, 58]: Նրա Micro BCA սպիտակուցի փորձարկման փաթեթները օգտագործվել են մաքրված ռեկոմբինանտ մուտանտի տաու չափման համար [59]:

Նշվել են նաև MilliporeSigma BCA ռեագենտը և Bio-Rad BCA սպիտակուցի փորձարկման հավաքածուն:

Thermo Fisher Pierce-ը նաև Բրեդֆորդի վերլուծության փաթեթների հիմնական մատակարարներից է: Kapogiannis D-ը և այլոք չափել են էկզոսոմների և պլազմայի նմուշների սպիտակուցի պարունակությունը մինչև western blot-ը Թերմո Ֆիշերի Բրեդֆորդի վերլուծությամբ (կատալոգ՝ 23200) [50]: Bio-Rad Bradford սպիտակուցի վերլուծության ռեակտիվները օգտագործվել են չմշակված հիստոնային քաղվածքներում (կատալոգ՝ 5000006) [60], կրծքագեղձի քաղցկեղի բջիջների լիզատներում [47] և A549 բջիջների լիզատներում [48] սպիտակուցի պարունակությունը չափելու համար:

Այլ մատակարարներ տրամադրել են նաև Բրեդֆորդի վերլուծության փաթեթները, օրինակ՝ Carl Roth [51] և Expedeon [61]:

Պիրս Լոուրիի անալիզը (կատալոգի համարը 23240) օգտագործվել է [62]-ում, իսկ Bio-Rad Laboratories Lowry-ի անալիզը օգտագործվել է [63] և [64]-ում՝ սպիտակուցների քանակականացման համար: Bio-Rad DC սպիտակուցի վերլուծությունը Lowry հետազոտության փոփոխված տարբերակն է: Այն հանրաճանաչ սպիտակուցային վերլուծություն է՝ շնորհիվ լվացող միջոցների հետ համատեղելիության: Այս վերլուծությունը օգտագործվել է սպիտակուցի կոնցենտրացիան որոշելու համար՝ ուսումնասիրելու մարդու տետրասպանին մեմբրանի CD81 սպիտակուցի կառուցվածքն ու գործառույթը [65], գամմա(ցիտո)-ակտինի կմախքի մկաններին հատուկ աբլյացիայի ազդեցությունը mdx ֆենոտիպի վրա [62], ի թիվս այլոց [66]: , 67]։

Սպիտակուցների քանակի լավագույն ստանդարտը նույն սպիտակուցն է, ինչ հետազոտվողը: Այնուամենայնիվ, դա սովորաբար իրագործելի չէ: BSA (խոզի շիճուկի ալբումին) սպիտակուցի ամենատարածված ստանդարտն է: Այն սահմանափակումներ ունի։ Այն ավելի զգայուն է Բրեդֆորդի վերլուծության մեջ, քան մյուս սպիտակուցները, ուստի սպիտակուցի նմուշի կոնցենտրացիան հավանաբար թերագնահատված է [68]: Բացի այդ, BSA-ն, որպես շիճուկի սպիտակուց, չի կարող պատրաստվել/ձեռք բերել շատ բարձր մաքրությամբ, քանի որ այն կապված է բազմաթիվ այլ գործոնների հետ: Որպես սպիտակուցային ստանդարտներ օգտագործվել են նաև այլ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են իմունոգոլոբուլին G-ն և լիզոզիմը: Տվյալ փորձի լավագույն տարբերակը կարող է տարբեր լինել՝ կախված և՛ ձեր հետաքրքրող սպիտակուցներից, և՛ ձեր ընտրած քանակական մեթոդից:

Ոչ: Շատ կարևոր է, որ նմուշի տվյալների կետերը ընկնեն ստանդարտ կորի միջակայքում, քանի որ կորը կարող է անկանխատեսելիորեն տարբերվել ավելի բարձր կամ ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում: Ձեր նմուշների և/կամ ստանդարտների նոսրացումը պետք է ճշգրտվի՝ ձեր նմուշները ստանդարտ կորի սահմաններում պահելու համար:


3 ԱՐԴՅՈՆՔ

3.1 PD0325901-ը նպաստում է MBP + բջիջների առաջացմանը NPC-ից ստացված OPC-ից in vitro

Թմրամիջոցների նման փոքր մոլեկուլները բացահայտելու համար, որոնք կարող են առաջացնել OPC-ի տարբերակում, մենք մշակել ենք բարձր պարունակության պատկերային վերլուծություն՝ հիմնված MBP արտահայտության վրա (Guo et al., 2018): Համառոտ, մկների E14.5 սաղմերից կեղևային NPC-ները օգտագործվում են in vitro որպես նեյրոսֆերաներ: Այնուհետև NPC-ները տարբերակվեցին OPC-ների՝ բնորոշ երկբևեռ կամ եռաբևեռ ձևաբանությամբ: Այնուհետև OPC-ները հետագայում տարբերակվեցին MBP + հասուն OL-ների՝ 4 օր OL միջավայրում աճեցնելով: Տարբեր միացություններ 20 μM-ով ավելացվել են OPC-ի ընթացքում OL տարբերակման ժամանակ (Օր 0, Նկար 1ա), և MBP + բջիջների տոկոսը 4-րդ օրը օգտագործվել է որպես ընթերցում: Չինական ազգային միացությունների գրադարանի յոթ հազար երեք հարյուր քառասունյոթ միացություններ ստուգվել են, և մի շարք միացություններ, ներառյալ վիտամին C-ն, հայտնաբերվել են, որոնք ուժեղացնում են MBP + բջիջների առաջացումը (Guo et al., 2018):

Այս միացություններից պարզվել է, որ MEK ինհիբիտորը՝ PD0325901, դոզայից կախված մեծացնում է MBP + բջիջների տոկոսը (EC50 ~ 100 nM) (Նկար 1b): Մենք որոշեցինք հետագայում ուսումնասիրել այս միացությունը, քանի որ այն բանավոր հասանելի միացություն է, որը հեշտությամբ անցնում է արյունաուղեղային պատնեշը (Lopez-Juarez et al., 2017): PD0325901-ի ժամանակից կախված էֆեկտը նույնպես ուսումնասիրվել է՝ 10 մկՄ միացություն ավելացնելով OL միջավայրում տարբեր տևողությունների համար (Նկար 1c): Արդյունքները ցույց են տալիս, որ PD0325901-ի վաղ ավելացումը կարևոր էր: Բուժումը PD0325901-ով միայն մեկ օր սկզբնական փուլում հանգեցրել է MBP + բջիջների զգալի աճի (Նկար 1c): Ի հակադրություն, PD0325901 բուժումը 2-րդ օրից հետո շատ սահմանափակ ազդեցություն ունեցավ (Նկար 1գ): QPCR վերլուծությունը նաև ցույց է տվել, որ մի շարք OL մարկերներ, ներառյալ MBP, միելինի հետ կապված գլիկոպրոտեինը (MAG), միելին օլիգոդենդրոգլիալ գլիկոպրոտեինը (MOG), 2',3'-ցիկլային նուկլեոտիդ 3'-ֆոսֆոդիեստերազը (CNPase) և PLP, զգալիորեն աճել են: PD0325901-ով բուժված խմբում (Նկար 1դ): PD0325901 (10 μM) մշակված OPC-ներում բջիջների ավելի քան 20%-ը 4-րդ օրը դարձավ MBP + (Նկար 1e,f): Ինդուկցիայի արդյունավետությունը նույնիսկ մի փոքր ավելի բարձր էր, քան հայտնի OL ինդուկտորը T3 (500 nM) (Նկար 1e,f): Ավելի հետաքրքիր է, որ PD0325901-ը և T3-ը ցույց են տվել հավելումային ազդեցություն MBP + բջիջներ հրահրելու գործում՝ ենթադրելով, որ այս երկու միացությունները կարող են գործել տարբեր մեխանիզմների միջոցով (Նկար 1e,f):

Հասուն OL-ները սովորաբար օժտված են բարդ թաղանթային պրոցեսներով և չափերով ավելի մեծ են, քան ոչ հասուն OL-ները: Մենք մանրակրկիտ դասակարգեցինք MBP + -OL-ները երեք խմբի՝ ըստ բջիջների տարածքի՝ փոքր (600–2000 մկմ 2, դեղին սլաք և շրջան), միջին (2000–4000 մկմ, կարմիր սլաք և շրջան) և մեծ (>4000 մկմ 2։ , սպիտակ սլաք և շրջան) չափի OL-ներ (Նկար 1g): PD0325901-ը նույն չափով ուժեղացրել է փոքր, միջին և մեծ չափերի OL-ների արտադրությունը (Նկար 1h):

PD0325901-ի ազդեցությունը OL-ի առաջացման վրա հետագայում հաստատելու համար ուսումնասիրվել են բազմակի մարկերների աստիճանական արտահայտությունը, որոնք ներկայացնում են OL-ների տարբերակման տարբեր փուլերը: Տարբերակման վաղ փուլում OPC-ները առաջացնում են նախնական ՕԼ-ներ, որոնք արտահայտում են O4 (Barateiro & Fernandes, 2014 Zhang, 2001): PD0325901 բուժումը զգալիորեն ավելացրել է O4 + բջիջների թիվը 1-ին օրվանից (Նկար 2ա, բ): CNPase-ը, որը O4-ից մի փոքր ուշ է արտահայտվել OL հասունացման ժամանակ (Barateiro & Fernandes, 2014 Zhang, 2001), կարող է հայտնաբերվել արդեն 2-րդ օրը PD0325901-ով մշակված բջիջներում (Նկար 2c,d): Մինչդեռ DMSO-ով մշակված բջիջներում CNPase-ի արտահայտումը հետաձգվում էր առնվազն մեկ օրով, իսկ CNPase + բջիջները հստակ թաղանթային պրոցեսներով կարող էին դիտվել միայն 4-րդ օրից հետո (Նկար 2c,d): Իսկ MBP-ի արտահայտությունը՝ հասուն OL-ների մարկեր, կարող է հայտնաբերվել PD0325901-ով բուժված բջիջներում 3-րդ օրվանից՝ մեկ օր շուտ, քան DMSO վերահսկումը: O4 + MBP + OL-ների տոկոսները նույնպես զգալիորեն ավելի բարձր էին PD0325901-ով մշակված բջիջներում՝ համեմատած DMSO հսկողության հետ վերլուծված բոլոր երեք ժամանակային կետերում (Նկար 2ա, ե): Համակցելով Նկար 1c-ի տվյալները՝ այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ PD0325901-ն իր ազդեցությունն է թողնում OL տարբերակման վաղ փուլում: PD0325901-ը նպաստում է OPC-ին OL-ի ճակատագրի որոշմանը, և երբ նոր հասուն OL-ներ ստեղծվեն, ավելի հասուն OL-ներ կստացվեն:

3.2 ERK/MAPK ճանապարհի արգելակումը նպաստում է OL առաջացմանը

PD0325901-ը CI-1040-ի երկրորդ սերնդի հայտնի անալոգն է՝ առաջին MEK (MAPK kinase) ինհիբիտորը, որը մտել է կլինիկական գնահատում (Sebolt-Leopold et al., 2004): Հետևաբար, հաղորդված MEK ինհիբիտորների մի խումբ, ներառյալ AZD8330, AZD6244, U0126 և CI-1040 (Akinleye, Furqan, Mukhi, Ravella, & Liu, 2013 Planz, 2013), նույնպես գնահատվել են OPC-ից OL տարբերակման մեջ: Ինչպես ցույց է տրված Նկար 3a,b-ում, բոլոր ինհիբիտորները կարող են դրդել OPC-ի OL տարբերակումը դոզայից կախված եղանակով՝ տարբեր արդյունավետությամբ: AZD8330-ի լավագույն ազդեցությունը համեմատելի է PD0325901-ի հետ, բջիջների ~25%-ը դարձել է MBP+, երբ մշակվել է այս միացություններով: Այլ միացությունները (AZD6244, U0126 և CI-1040) կարող են առաջացնել միայն 10%-15% MBP + բջիջների տեսք ամենաարդյունավետ չափաբաժիններով (Նկար 3ա,բ): OPC-ների այս միացություններով (ամենաարդյունավետ չափաբաժինով OPC-ից OL տարբերակումը հրահրելու դեպքում) բուժումը 15 րոպե գրեթե ամբողջությամբ արգելակեց ERK1/2-ի ֆոսֆորիլացումը (Նկար 3c): Հետաքրքիր է, որ երբ բարդ բուժումը տևեց 4 օր (միջավայր պարունակող միացությունները թարմացվել են մեկ անգամ 3-րդ օրը), միայն PD0325901-ը և AZD8330-ը ցույց տվեցին ERK1/2 ֆոսֆորիլացման ամբողջական արգելակում, որը լավ փոխկապակցված էր նույն խմբում հայտնաբերված MBP-ի բարձր մակարդակների հետ (Նկար 3d): ) Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ MAPK/ERK ուղու արգելակումը նպաստում է OL-ի առաջացմանը, և MAPK/ERK արգելակման տևողությունը կարող է կարևոր լինել տարբերակման գործընթացն ուժեղացնելու համար:

3.3 PD0325901-ն ուժեղացնում է միելինացումը OPC-DRG նեյրոնների համատեղ մշակույթում in vitro

PD0325901-ի ազդեցությունը OPC-ից OL տարբերակման խթանման գործում հետագայում ուսումնասիրվել է առաջնային OPC-ներում: Պարզվել է, որ PD0325901-ը դոզայով կախված մեծացնում է MBP + -OL-ների տոկոսը, որոնք առաջանում են առաջնային OPC-ներից (Նկար 4ա, բ): Այնուհետև մենք ստեղծեցինք in vitro միելինացման համակարգ՝ առաջնային OPC-ները DRG նեյրոնների հետ համատեղ մշակելով (O'Meara, Ryan, Holly, & Rashmi, 2011), գնահատելու PD0325901-ի ազդեցությունը միելինի ձևավորման վրա: Միելինացված աքսոնները քանակականացվել են որպես MBP + OL գործընթացի և NFH + (նաև կոչվում է NF-200, 200 կԴ նեյրոֆիլամենտ) աքսոնների համատեղ տեղայնացում (Huang et al., 2011): Համեմատած DMSO հսկողության հետ՝ PD0325901-ը առաջացրել է համամշակույթում MBP + NHF + միելինացված աքսոնի երկարության կոնցենտրացիայից կախված աճ (Նկար 4c,d): Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ ERK/MAPK ազդանշանի նվազումը ոչ միայն նպաստում է առաջնային OPC-ներից հասուն OL-ների առաջացմանը, այլ նաև ուժեղացնում է միելինի ձևավորումը in vitro:

3.4 PD0325901-ը նպաստում է ռեմիելիզացմանը EAE մկների մոտ

MS-ը և EAE-ն բնութագրվում են աուտոիմունային միջնորդավորված դեմիելինացիայով և նեյրոդեգեներացիայով: Մենք հաջորդիվ ուսումնասիրեցինք PD0325901-ի ազդեցությունը MOG-ով պայմանավորված EAE մոդելում: PD0325901 (5 մգ/կգ) կիրառվել է պրոֆիլակտիկ կերպով՝ օրական ներպերիտոնեալ (i.p.) ներարկումով 3-րդ օրվանից հետո և պարզվել է, որ զգալիորեն նվազեցնում է հիվանդության միավորները՝ համեմատած փոխադրամիջոցի հսկողության հետ (Նկար 5ա): Զուգահեռ փորձի ընթացքում PD0325901-ով կամ տրանսպորտային միջոցով բուժված մկների ողնուղեղները մեկուսացվեցին 21-րդ օրը հետպատվաստումներից հետո: ՈԼ-ները և OPC-ները ողնուղեղի վնասվածքներում գնահատվել են հակամարմիններով իմուն ներկելու միջոցով, որոնք ճանաչում են հասուն OL-ների (MBP և GST-pi) և OPC-ների (NG2) մարկերները (Նկար 5b-d): EAE մկների ողնուղեղում տեղի է ունեցել ծանր դեմիելինացիա, քանի որ սպիտակ նյութի որոշ հատվածներ կորցրել են MBP ներկումը (Նկար 5b,e) և GST-pi + բջիջների թիվը նույնպես զգալիորեն կրճատվել է (Նկար 5c,f): Իսկ դեմելինացված ողնուղեղում զգալի թվով NG2 + OPC-ներ են դիտվել սպիտակ նյութի տարածքում (Նկար 5d,g): PD0325901-ով բուժված մկների մոտ դեմիելիզացումը զգալիորեն մեղմվել է GST-pi + հասուն OL-ների քանակի ավելացմամբ և NG2 + OPC-ների կրճատմամբ (Նկար 5b–g): Ավելին, ռեմիելինացված ողնուղեղի աքսոնների g հարաբերակցությունները (աքսոնային տրամագիծը դեպի ընդհանուր միելինացված մանրաթելերի տրամագիծը) վերլուծվել են փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակով: Demyelination-ը վկայում էր EAE մկների մոտ g-հարաբերակցության բարձրացմամբ՝ միամիտների համեմատ (Նկար 5h–j): PD0325901 բուժումը զգալիորեն նվազեցրեց g հարաբերակցությունը EAE մկների մոտ, ինչը ցույց է տալիս ավելի լավ վերականգնում (Նկար 5h–j): Այս դիտարկումները ցույց են տալիս, որ MAPK/ERK ազդանշանային արգելակումը կարող է նպաստել EAE մկների ռեմիելինացմանը՝ ուժեղացնելով OPC-ից OL տարբերակումը:

Այնուամենայնիվ, արդյոք PD0325901-ն ազդում է EAE մոդելի իմունային մասի վրա, մնում է անհասկանալի: EAE-ի պաթոգեն բջիջները հիմնականում CD4 + T բջիջներն են, հատկապես Th17 և Th1 ենթախմբերը: Նախորդ ուսումնասիրությունը հայտնել է, որ ERK-ի շրջափակումը թուլացնում է EAE-ն՝ արգելակելով Th1 և Th17 բջիջների ինդուկցիան (Brereton, Sutton, Lalor, Lavelle, & Mills, 2009): Այլ ուսումնասիրություններ ցույց են տվել, որ ERK-ի շրջափակումը նպաստում է Th17 տարբերակմանը (Cui et al., 2009 Tan & Lam, 2010), առանց Th1 ենթաբազմության վրա ազդելու (Cui et al., 2009): Եվ ERK-ի արգելակումը էապես չի ազդում Th17-ի արտադրության վրա, նույնպես հաղորդվել է (Lu et al., 2010): Նախորդ ուսումնասիրությունների եզրակացությունը հակասական էր:

Որպեսզի լրացուցիչ հաստատենք PD0325901-ի կարողությունը in vivo-ում ռեմիելինացումն ուժեղացնելու համար, մենք անցկացրեցինք T-բջիջներից անկախ cuprizone-ով պայմանավորված դեմիելինացման մոդելը (Doan et al., 2013 Matsushima & Morell, 2001):

3.5 PD0325901-ը նպաստում է միելինի վերականգնմանը դեղորայքով պայմանավորված դեմիելինացման մոդելում

Մկներին 5 շաբաթվա ընթացքում կերակրել են 0,2% (ք/վ) կափրիզոն պարունակող սննդակարգով՝ ամբողջական դեմիելինացիա առաջացնելու համար (Նկար 6ա–գ): Cuprizone-ի դուրսբերումից հետո փոխադրամիջոցը կամ PD0325901 (10 մգ/կգ) կիրառվել է ամեն օր i.p. ներարկում 1 կամ 2 շաբաթվա ընթացքում (Նկար 6ա): Մկները էֆթանազիայի ենթարկվեցին, և միելինացումը կորպուսի կոշտուկում գնահատվեց Luxol արագ կապույտ ներկման միջոցով (Berghoff et al., 2017 Deshmukh et al., 2013): Ինքնաբուխ ռեմիելինացիա կարող էր դիտվել փոխադրամիջոցով բուժվող խմբում, և PD0325901 բուժումը հետագայում արագացրեց ռեմիելինացման գործընթացը (Նկար 6b,c): PD0325901-ի ազդեցությունը հետագայում գնահատվել է MBP-ի և MOG-ի միելինային սպիտակուցների և հասուն OL մարկերի GST-pi-ի իմունոֆլուորեսցենտ ներկման միջոցով կորպուսի կոշտուկային շրջանում PD0325901-ով 2-շաբաթյա բուժումից հետո: Համապատասխան Luxol արագ կապույտ ներկման հետ՝ PD0325901 բուժումը զգալիորեն մեծացրել է MBP-ի և MOG-ի ներկումը և GST-pi + OL-ների քանակը (Նկար 6d–f): Ավելին, ավելի քիչ PDGFRα + OPC-ներ են հայտնաբերվել PD0325901-ով բուժված խմբում (Նկար 6d,f), ինչը ենթադրում է, որ PD0325901-ը նպաստում է in vivo ռեմիելինացմանը՝ ուժեղացնելով OPC-ի տարբերակումը:

100 միելինացված աքսոններ՝ հաշվված մեկ մկնիկի համար, երեք մկ յուրաքանչյուր խմբի համար: Քանի որ դեմելինացումը մանրակրկիտ էր, միայն 48 միելինացված աքսոններ են հաշվվել Cuprizone [5 շաբաթ] խմբում), ### էջ < .001 ընդդեմ cuprizone խմբի, ***էջ < .001 ընդդեմ տրանսպորտային միջոցների խմբի (միակողմանի ANOVA, որին հաջորդում է Tukey-ի բազմակի համեմատական ​​թեստը): ժա) Անհատին ցուցադրող ցրման սյուժեն է- հարաբերակցության արժեքները և առանցքային չափերի բաշխումը [Գունավոր պատկերը կարելի է դիտել wileyonlinelibrary.com կայքում]

Միելինի կարգավիճակը հետագայում գնահատվել է փոխանցման էլեկտրոնային մանրադիտակի միջոցով: 5 շաբաթ կուպրիզոնով բուժումից հետո կորպուսի կոշտուկում շատ քիչ աքսոններ մնացին միելինացված (Նկար 6g–i): Կուպրիզոնի դուրսբերումից երկու շաբաթ անց ինքնաբուխ ռեմիելինացիա կարող էր նկատվել, քանի որ միելինացված աքսոնների թիվը զգալիորեն ավելացել էր (Նկար 6g–i):PD0325901-ով բուժված կենդանիներն ունեին ավելի շատ միելինացված աքսոններ (Նկար 6g–i) և ավելի ցածր g հարաբերակցություն (Նկար 6j, k), ինչը ցույց է տալիս նույնիսկ ավելի լավ վերականգնում, քան վերահսկիչ խումբը:


Բջիջների լիզինգ և իմունային նստվածք CHAPS լվացող միջոցով

CHAPS իմունային նստվածքային բուֆերը (CIB-1) ձևավորված է միջմոլեկուլային փոխազդեցությունները պահպանելու համար տրանսմեմբրանային և ցիտոզոլային սպիտակուցների արդյունահանումից հետո: CHAPS բուֆերը իդեալական է համակցված իմունային նստվածքի (այսինքն՝ Co-IP) վերլուծության համար, քանի որ այն պահպանում է սպիտակուցի կոնֆորմացիան, ինչպես նաև սպիտակուցային համալիրի հավաքումը:

Բջիջների լիզից և բջջային սպիտակուցի լուծույթից հետո CHAPS բուֆերում, հավաքված սպիտակուցները կարող են մեկուսացվել միասին՝ օգտագործելով իմունային նստվածքային տեխնիկան: Հավաքված սպիտակուցային թիրախներից մեկին միանալու համար ավելացվում է իմունային նստեցնող հակամարմին: Այնուհետև ավելացվում է ամուր հենարան, ինչպիսին Protein-G Sepharose-ն է, որպեսզի ոչ կովալենտ կապվի և կապվի հակամարմին-սպիտակուցային համալիրին և այն անլուծելի դարձնել: Ցածր արագությամբ ցենտրիֆուգումից, նստվածքից և լվացումից հետո պինդ հենարան-հակամարմին-սպիտակուցային համալիրը մեկուսացվում է միասին:

Սպիտակուցները, որոնք հավաքվում են իմունոպրեցիպիտացնող հակամարմինների կողմից թիրախավորված սպիտակուցի հետ, դառնում են համատեղ իմունային նստվածք: Զարգացնելով Western blots այլ հակամարմիններով, որոնք ուղղված են համատեղ հավաքված սպիտակուցին, հետազոտողը կարող է բնութագրել և քանակականացնել փոխազդեցությունը երկու կամ ավելի սպիտակուցային տեսակների միջև: Ֆունկցիոնալ կենսաքիմիական ակտիվության վերլուծությունները կարող են օգտագործվել նաև համատեղ իմունային նստվածքային և հավաքված կենսամոլեկուլները բնութագրելու համար:

Բաղադրիչներ

  • Միկրոցենտրիֆուգ 4°C-ում
  • Ճոճվող սեղան
  • Սառը սենյակ կամ սառնարանային պատյան
  • Հակամարմինը հարմար է իմունային նստվածքի համար, ինչպես նշված է վաճառողի կողմից: Ընդհանրապես, իմունային նստվածքային հակամարմինը պետք է ճանաչի ՀԱՅԿԱԿԱՆ կոնֆորմացիան:
  • Western blots հավելվածներ. հակամարմիններ, որոնք հարմար են Վեսթերն բլոտի հայտնաբերման համար, ինչպես նշված է վաճառողի կողմից: Այս հակամարմինը պետք է ճանաչի թիրախային սպիտակուցի ԴԵՆԱՏՈՒՐՎԱԾ վիճակը:

Առաջարկվող վերահսկում և նմուշներ համեմատությունների համար

  • Կատարեք իմունային նստվածքների արձանագրություն անտեղի հակամարմիններով՝ կեղծ սպիտակուցային շերտերի տեսքը վերահսկելու համար:
  • Western blots-ում լուծեք սկզբնական չֆրակցիոնացված բջիջների լիզատը, չկապված ֆրակցիան (օրինակ՝ սպիտակուցներ պարունակող ֆրակցիան, որը կապված չէ սպիտակուց-A կամ G պինդ հենակետին) և իմունային նստվածքային նյութերը՝ ֆրակցիոնացումը և հարստացումը հաստատելու համար:
  • Մշակել Western blot, որը հայտնաբերում է իմունային հակամարմինների կողմից ուղղակիորեն թիրախավորված սպիտակուցը: Այս ընթացակարգը հաստատում է, որ իմունային նստվածք է տեղի ունեցել:

A. Արձանագրություն բջջային կուլտուրայի համար

Առաջարկվում է, որ բջիջները մշակվեն մինչև 80-90% միաձուլում մինչև բջիջների լիզը և իմունային նստվածքը կատարելը: Բջիջները պետք է լվացվեն առանց շիճուկի սպիտակուցներից՝ օգտագործելով PBP, նախքան իմունային նստվածք կատարելը, կանխելու համար շիճուկի ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցային շերտերի տեսքը ներքևում գտնվող Western blots-ում:

B. Արձանագրություն CHAPS լվացող միջոցով բջիջների լիզիսի համար

Խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել 300 մլ CHAPS լուծույթ՝ լիզված բջիջների մեկից երեք 10 սմ բջիջների կուլտուրաների համար: Համապատասխանաբար չափեք բջիջների կուլտուրաների այլ թվերի կամ չափերի համար՝ ըստ ճաշատեսակի մակերեսի: Նախքան լիզելը, CHAPS բուֆերը սառը դարձրեք և ավելացրեք պրոթեզերոնի և ֆոսֆատազի ինհիբիտորներ:

Բջիջները պետք է լվացվեն առանց շիճուկի սպիտակուցներից՝ օգտագործելով PBS, նախքան իմունային նստվածքը կատարելը, կանխելու համար շիճուկի ոչ սպեցիֆիկ սպիտակուցային շերտերի տեսքը ներքևում գտնվող Western blots-ում: Հեռացրեք բջիջների կուլտուրայի միջավայրը և նրբորեն լվացեք 10 սմ բջիջների կուլտուրայի սպասքը 5 մլ PBS-ով, երեք անգամ: Օգտագործեք PBS-ի նուրբ հոսք՝ թիթեղից բջիջների ավելորդ կորուստը կանխելու համար: Լվացումներից հետո բջիջների կուլտուրայի ափսեը ծածկեք կափարիչով և դրեք բջիջների կուլտուրայի սպասքը սառցե մահճակալի վրա:

  • Լիզեք բջիջները և ստեղծեք վերին նյութի ֆրակցիան արագորեն հետևյալ կերպ. Բջջային շերտի վրա տարածեք 300 մլ սառցե CHAPS պրոտեազի/ֆոսֆատազի ինհիբիտորներով, ձեռքով պտտեք ափսեը՝ ծածկելու համար բջիջները CHAPS թաղանթով, այնուհետև անմիջապես տեղահանեք բջիջները բջջային քերիչով: . Օգտագործեք լայն բացվածքով փոխանցման խողովակ՝ բջիջները 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ սիֆոնելու համար: 300 uL Chaps լուծույթը կարող է նաև հաջորդաբար փոխանցվել մինչև երեք առանձին 10 սմ երկարությամբ բջիջների թիթեղներին՝ նախքան բջջային կախոցը 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ դնելը:
  • Տեղադրեք 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակը բջջային կախոցով 10 րոպե սառույցի վրա: Այս 10 րոպեի ընթացքում մի քանի անգամ ուժեղ հպեք խողովակին, որպեսզի հեշտացնեք բջջային թաղանթի լուծարումը: Դուք կարող եք նաև օգտագործել ճոճվող սեղան՝ բջջային կախոցը պտտելու համար՝ ավելի հեշտացնելու բջջային թաղանթի տարրալուծումը: Մի պտտեք բջիջների լիզատը, եթե նախատեսվում է իմունային նստվածք:
  • Բջջային լիզատը ցենտրիֆուգեք սառեցված միկրոցենտրիֆուգի մեջ ամբողջ արագությամբ 15 րոպե, որպեսզի բաժանեք գերնույն նյութը և կարկուտը: Հավաքեք վերին նյութի մասնաբաժինը, որը պարունակում է արդյունահանված թաղանթ և ցիտոզոլային սպիտակուցներ և տարածեք այս վերին նյութը մեկ այլ 1,5 մլ միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, որը տեղադրված է սառույցի մեջ: Տեղափոխված այս վերին նյութը համապատասխանում է չֆրակցիոնացված գերնատական ​​ֆրակցիային: Մի փոքր չափաբաժին դրեք իմունային նստվածքային նյութերի համեմատության համար, որոնք առաջանում են արձանագրության մեջ ավելի ուշ: Չֆրակցված գերնույն նյութը կարող է պահվել -20°C կամ -80°C-ում ավելի երկարաժամկետ պահպանման համար:

C. Արձանագրություն CHAPS լվացող միջոցով իմունային նստվածքների համար

  • Ավելացրեք իմունային նստեցնող հակամարմիններ չֆրակցիոնացված գերնատական ​​ֆրակցիային՝ օգտագործելով արտադրողի կողմից առաջարկված հակամարմինների տիտրը: Իմունային նստվածքային ռեակցիայով խողովակը դրեք սառնարանում գտնվող ռոք սեղանի վրա (օրինակ՝ սառը սենյակ կամ սառնարանային պատյան) 15-30 րոպե՝ հակամարմին-վերածանց խառնուրդը խառնելու համար: Դուք կարող եք նախընտրել սկզբում փորձել ավելի կարճ 15 րոպե ժամանակահատվածը իմունային տեղումների համար, ժամանակաշրջան, որն ավելի հարմար է ցածր մերձեցման փոխազդեցությունները պահպանելու համար:
  • Անմիջապես 60 մլ իմունային նստվածքային ուլունքներ (օրինակ՝ Sepharose-G-ի հատիկներ կամ սպիտակուց-A հատիկներ) յուրաքանչյուր 300 uL-ից 2 մլ մասնաբաժնի մեջ իմունային նստվածքային հակամարմիններով չֆրակցված գերնույն նյութի մեջ: Տեղադրեք այս խողովակը ճոճվող սեղանի վրա ևս 30 րոպեից մինչև 1 ժամ սառնարանում՝ չլուծվող պինդ հենարան-հակամարմին-սպիտակուցային համալիր ստեղծելու համար:
  • Օգտագործեք սառնարանային միկրոցենտրիֆուգ 3000 պտ/րոպում 5 րոպե՝ իմունային նստվածքային ուլունքները նստեցնելու համար: Ստացված գերնույն նյութը չկապված ֆրակցիան է: Հավաքեք չկապված ֆրակցիան՝ չխանգարելով իմունային նստվածքային բշտիկի գնդիկին: Պահպանեք չկապված ֆրակցիան -20°C կամ -80°C ջերմաստիճանում:
  • Իմունային նստվածքների ուլունքներին ավելացրեք թարմ 300 մլ սառցե CHAPS-ը` պրոթեզերոնի և ֆոսֆատազի ինհիբիտորներով: Նրբորեն պտտեք խողովակը 180° ձեռքով երեք անգամ և կրկին ցենտրիֆուգեք 3000 պտ/րոպում 5 րոպե: Հեռացրեք և դեն նետեք լվացքի վերին նյութը: Կրկնեք այս լվացման ընթացակարգը ևս երկու անգամ: Վերջին լվացումից հետո օգտագործեք միկրոցենտրիֆուգ՝ 15 րոպե 14000 rpm արագությամբ իմունային նստվածքային ուլունքները նստեցնելու համար: Հեռացրեք լվացքի լուծույթից որքան հնարավոր է շատ՝ օգտագործելով սրածայր պլաստիկ Pasteur pipette: Իմունային նստվածքային ֆրակցիան, որը կապված է ուլունքներին, նստվածք է ստանում խողովակի հատակին:

Դ. Արձանագրություն՝ ուլունքներից և վեստերն բլոտից CHAPS լվացող միջոցով իմունային կուտակված ֆրակցիայի զտման համար

  • Կան մի քանի մեթոդներ՝ իմունային նստվածքային սպիտակուցները պինդ հենարանից մաքրելու համար՝ լուծելի իմունային նստվածքային ֆրակցիան ազատելու համար: Հետագա Western blotting-ի համար կիրառելի ամենապարզ մեթոդը Laemmli Sample Buffer-ի (LSB մերկապտոէթանոլով) կիրառումն է ուղղակիորեն իմունային նստվածքային ուլունքների վրա. Ավելացնել 100լ LSB յուրաքանչյուր 60 uL նստվածքային իմունային նստվածքային բշտիկների վրա: LSB-ը պտտեցրեք՝ ամբողջ արագությամբ իմունային նստվածք լուծեք 30 վայրկյան, այնուհետև տաքացրեք 60°C-ում 10 րոպե: Այժմ նստեցրեք ուլունքները՝ օգտագործելով ցածր արագությամբ ցենտրիֆուգում (3000 rpm) 5 րոպե: Հավաքեք վերին նյութը Իմունային նստվածքային սպիտակուցները (իմունային նստվածքային հակամարմինների հետ միասին) կթողարկվեն վերին նյութի մեջ:
  • Գերազանց նյութը կարող է լուծվել հետագա Western blots-ում: Որպես այլընտրանք, եթե ձեր հետաքրքրող սպիտակուցը հեշտությամբ կուտակվում է LSB-ում բարձր ջերմաստիճանում տաքացնելիս, փոխարենը տաքացրեք 37°C-ում 30 րոպե: և կատարեք նույն վերոհիշյալ քայլերը: Լուծել հաջորդական գելային ուղիներով և Western blots-ով, 1) չֆրակցիոն ֆրակցիան, 2) չկապված ֆրակցիան և 3) իմունային նստվածքային ֆրակցիան: Հաջող իմունոպրեցիպտացիայի դեպքում դուք պետք է դիտարկեք ձեր հետաքրքրող սպիտակուցի հարստացումը, ինչպես նաև իմունոպեկցիոն ֆրակցիայի ցանկացած համակցված սպիտակուցներ:

Ե. Արձանագրություն հյուսվածքների համասեռացման համար CHAPS ախտահանողով իմունային կուտակումից առաջ

Այս գործընթացը պետք է իրականացվի սառույցի վրա:

  • Փոշիացնել մոտավորապես 90 uL հյուսվածք: Հյուսվածքը տեղադրեք 1,5 մլ կլոր հատակով միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ:
  • Ավելացրեք ընդհանուր ֆոսֆատազի և պրոթեզերոնի ինհիբիտորների կոկտեյլներ 500 մլ սառցե CHAPS Lysis և իմունային նստվածքային բուֆերի մեջ:
  • Փոշիացված հյուսվածքին ավելացրեք 500 մլ CHAPS բուֆեր՝ ինհիբիտորներով:
  • Համասեռացրեք հյուսվածքը մինի պեստալ-հոմոգենիզատորով, օգտագործելով 15 հարված, 3 վայրկյան/հարված սառույցի վրա:
  • Ցենտրիֆուգեք 12000 գ 15 րոպե 4°C-ում
  • Հեռացրեք վերին նյութը (առանց լիպիդային շերտի) և տեղափոխեք մեկ այլ 1,5 մլ խողովակի մեջ
  • Կրկին ցենտրիֆուգեք 12000 գ-ում 15 րոպե 4°C-ում
  • Տեղափոխեք սուպերնատենտը մեկ այլ խողովակ: Սուպերնատենտի ֆրակցիան պարունակում է արդյունահանված սպիտակուցներ, որոնք կարող են օգտագործվել իմունային նստվածքի համար:

Անսարքությունների վերացում

  • Իմունային նստվածք չի առաջացել: Լուծում. 1) Հնարավոր է, որ դուք ստիպված լինեք էմպիրիկորեն նույնականացնել իմունային նստվածքի հակամարմինը, որը ճանաչում է էպիտոպի բնիկ կառուցվածքը: 2) Սպիտակուցային համալիրը չի պահպանվում կենդանի անձեռնմխելի բջիջից դուրս: Սպիտակուցների միջև փոխազդեցությունն ու հավաքումը ֆիքսելու համար կարող են պահանջվել խաչաձև կապակցման պրոցեդուրաներ՝ օգտագործելով մեմբրանային թափանցելի խաչաձև կապող ռեակտիվներ և կենդանի բջիջներ:
  • Իմունային նստվածքային հակամարմինի IgG ծանր շղթան (որը տարածվել է իմունային նստվածքի լուծույթում) գաղթում է գելերի մեջ նույն դիրքում, ինչ հետաքրքրող սպիտակուցը, և հետևաբար քողարկում է իր տեսքը Western blot-ով: Լուծում. Western blot-ի զարգացման համար օգտագործեք կենդանական հյուրընկալողից ստացված հակամարմին, որը տարբերվում է իմունային նստվածքային հակամարմիններից: Այս դեպքում, համապատասխան երկրորդային-HRP-ի կոնյուգացված հակամարմինը զգալիորեն չի կապվի իմունոպրեցիպիտացնող հակամարմինին, որը փոխանցվել է Western blot-ին` կանխելով ծածկված Western blot շերտի տեսքը:

RIPA լիզի բուֆերի պահպանում

Պահպանեք RIPA լիզի բուֆերային լուծույթը սառնարանում (+2 o C – 8 o C) համեմատաբար կարճ ժամանակահատվածներով (մի քանի շաբաթ):

Երբեմն RIPA լիզի բուֆերի լվացող միջոցները կարող են ժամանակի ընթացքում նորից նստել: Եթե ​​դա տեղի ունենա, տաքացրեք լուծույթը (37 o C) և խառնեք, որպեսզի բաղադրիչները լուծվեն:

Պահպանման ավելի երկար ժամանակահատվածների համար ալիքոտացիա և RIPA լիզի բուֆեր պահեք սառնարանում (-20 o C): Հալեցրեք մասնիկները մեղմ ջերմությամբ (37 o C) և բաղադրիչները նորից խառնեք լուծույթի մեջ: Հալվելուց հետո նորից մի սառեցրեք:


Դիտեք տեսանյութը: Sve sto trebate znati o dnevnom unosu proteina (Հունվարի 2023).