Տեղեկատվություն

Ե՞րբ պետք է օգտագործել խիստ պլազմիդ:

Ե՞րբ պետք է օգտագործել խիստ պլազմիդ:


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ինձ հետաքրքրում էր, թե արդյոք որևէ մեկը լավ օրինակներ ուներ, երբ դուք կցանկանայիք օգտագործել խիստ պլազմիդ ընդդեմ հանգիստ պլազմիդի հետազոտական ​​միջավայրում:


Երեք ընդհանուր առավելություններն են.

  • Ստորին արտահայտություն. Եթե ​​ձեր պլազմիդը ինչ-որ թունավոր բան է արտահայտում բջիջների համար բարձր մակարդակներում, ԴՆԹ-ի քանակի կրճատումը կարող է նվազեցնել արտահայտվածությունը:
  • Ավելի ցածր պլազմիդային բեռ: Եթե ​​դուք մտահոգված եք պլազմիդի բազմաթիվ կրկնօրինակների պահպանման արդյունքում առաջացած սթրեսով, ապա ցածր օրինակով պլազմիդները օգտակար են:
  • Բնակչության միատարրություն. Հանգիստ պլազմիդները հակված են կրկնօրինակվելու այնպես, որ կլինի # պլազմիդի պատճենների/բջջի լայն բաշխում: Միևնույն ժամանակ, խիստ պլազմիդային վերարտադրությունը սերտորեն կապված է բջջի ցիկլի հետ, ուստի դրանց թիվը ավելի քիչ է տատանվում: Որոշ դեպքերում կարող է ցանկալի լինել վերահսկել պլազմիդների քանակը մեկ բջջում:

Ինչ իրավասու բջիջներ պետք է օգտագործեմ մեծ չափի ԴՆԹ-ի կլոնավորման համար - (Jan/17/2006)

Ես ուզում եմ կլոնավորել 3,8 կբ գենը 4,1 կբ վեկտորի մեջ: Ո՞ր իրավասու բջիջներն են ավելի լավ մեծ չափերի կլոնավորման համար:

Բարև Ստորմլինա:
3,8 Կբ ներդիրը 4,1 Կբ չափով վեկտորի մեջ դնելը չի ​​դարձնում այն ​​այնքան մեծ պլազմիդ, որը կարիք կունենա որևէ հատուկ տեսակի բակտերիաների:
Պարզապես օգտագործեք սովորական իրավասու բջիջները, ինչպիսիք են DH5 ալֆա կամ XL-1 կապույտ, և ամեն ինչ պետք է լավ լինի:

Շնորհակալություն պատասխանի համար: Բայց ես բազմիցս փորձել եմ, երբեք չի ստացվել:
Ես միշտ տարօրինակ փոքրիկ ժապավեն եմ ստանում, երբ կտրում եմ կլոնները հաստատելու համար: այնպես որ, ես վստահ չեմ, արդյոք իրավասու բջիջներն իրենք պատահաբար կկտրեն ներդիրը:

Եթե ​​վախենում եք, որ ձեր բջիջները կտրում են ներդիրը, ապա ինչպիսի՞ն է ձեր ներդիրը: Արդյո՞ք դա տարօրինակ կառուցվածքային կարողություններով ԴՆԹ է, թե՞ բազմաթիվ կրկնվող հաջորդականություններ: Այդ դեպքում ես առաջարկում եմ օգտագործել SURE կամ Stbl բջիջները:

Բացի դրանից, վստա՞հ եք ձեր վեկտորի և
քո ներդիրը?

Կարո՞ղ եք նաև որոշակի լույս սփռել ձեր կլոնավորման ռազմավարության վրա, միգուցե դա ոչ թե բջիջներն են, այլ ինչ-որ այլ քայլ, որը սխալ է ընթանում (դա կարող է լինել ձեր բջիջները, բայց այն տեղեկատվությունից, որը մենք ստանում ենք այստեղ, ոչ ոք չի կարող ասել):

Ես համաձայն եմ pBluescript-ի հետ. 3,8 Կբ ներդիրի կլոնավորումը 4,1 Կբ վեկտորի մեջ սովորական է և չպետք է պահանջի որևէ հատուկ իրավասու բջիջ: Որպես օրինակ՝ ես մի անգամ կլոնավորեցի 17 Կբ ներդիրը (առանց կատակելու!) pBluescript-ում և փոխակերպեցի DH5alpha-ն առանց խնդիրների:

Այսպիսով, ես կասկածում եմ, որ ձեր դժվարությունները ծագում են դրանից չափը կլոնի: Այն բովանդակությունը կլոնի մասին, սակայն, այլ հարց է:

Տրամադրեք մեզ ավելի շատ տեղեկություններ (ինչպես առաջարկում է vairus-ը), և մենք'կտեսնենք, թե արդյոք կարող ենք դուրս հանել որոշ գաղափարներ:

Շատ շնորհակալ եմ ձեր առաջարկի համար: Իրականում ես նախկինում տվել եմ հարցը, և խնդիրն այսպիսին է.
Ես փորձել եմ կլոնավորել 3,8 կբ ներդիրը (pcr) 4,1 կբ և ևս 5,1 կբ վեկտորի մեջ: Առաջին վեկտորի համար ես օգտագործում եմ Sal I-ը մեկ կտրվածք կատարելու համար, երկրորդի համար՝ XbaI: իհարկե, ես ներդիրի հետ նույն կերպ եմ վարվում։
իմ քայլերն են.
1. կտրում եմ և՛ վեկտորը, և՛ ներդիրը, սովորաբար ես կտրում եմ վեկտորը մեկ ժամով և հետո ավելացնում եմ CIP ևս մեկ ժամ, երբեմն փորձում էի ավելի երկար ժամանակ մարսել:
2. Գործարկել գել և կատարել գելի արդյունահանում Qiagen-ի միջոցով:
3. Կատարեք կապում T4 լիգազի հետ, ներդիր/վեկտոր հարաբերակցությունը սովորաբար 10 է: (Ես սովորաբար օգտագործում եմ 15 նգ վեկտոր): երբեմն ես կապում եմ կես ժամ սենյակային ջերմաստիճանում, երբեմն 14 աստիճան գիշերում:
Ես օգտագործում եմ կտրված վեկտորը միայն որպես վերահսկողություն:
4. Փոխակերպում DH5a տնական կոմպետենտ բջիջների
ամեն անգամ ես կարող եմ շատ կլոններ ստանալ՝ համեմատած հսկողության հետ: Խնդիրն այն է, երբ ես անում եմ մինի-պատրաստում և կտրում եմ պլազմիդները ստուգելու համար, դրանք ճիշտ չեն! Ես փորձեցի տարբեր ֆերմենտներ ստուգելու համար: և ես սովորաբար վերցնում եմ 10 կլոն յուրաքանչյուր ափսեից և մեկը՝ կառավարման ափսեից:

Ես համաձայն եմ pBluescript-ի հետ. 3,8 Կբ ներդիրի կլոնավորումը 4,1 Կբ վեկտորի մեջ սովորական է և չպետք է պահանջի որևէ հատուկ իրավասու բջիջ: Որպես օրինակ, ես մի անգամ կլոնավորեցի 17 Կբ ներդիրը (առանց կատակելու!) pBluescript-ում և փոխակերպեցի DH5alpha-ն առանց խնդիրների:

Այսպիսով, ես կասկածում եմ, որ ձեր անախորժությունները ծագում են դրանից չափը կլոնի: Այն բովանդակությունը կլոնի մասին, սակայն, այլ հարց է:

Տրամադրեք մեզ ավելի շատ տեղեկություններ (ինչպես առաջարկում է vairus-ը), և մենք'կտեսնենք, թե արդյոք կարող ենք դուրս հանել որոշ գաղափարներ:

Միգուցե սա չէ խնդիրը, բայց ամեն դեպքում դա է:
Դուք ստուգե՞լ եք, արդյոք ձեր օգտագործած պլազմիդային ԴՆԹ-ն պատրաստված է E.coli շտամից, որն ունի Dam գենը: Եթե ​​այս գենը չջնջվի բակտերիաների գենոմից, դուք խնդիր կունենաք, քանի որ պլազմիդը մեթիլացվելու է, իսկ XbaI սահմանափակող էնդոնուկլեազ ֆերմենտը զգայուն է Dam մեթիլացման նկատմամբ:
Բայց դուք կարող եք ստուգել դա փորձարարական եղանակով՝ գելի վրա գործարկելով ձեր վեկտորը, որը մարսվում է xbaI-ով:

PCR արտադրանքը կտրելու խնդիր չպետք է լինի, քանի որ այն մեթիլացված չէ:

Մեկ այլ հնարավորություն է ուլտրամանուշակագույն լույսը.
Նախքան ներդիրի ժապավենը գելից կտրելը, դուք չպետք է այն ենթարկեք ուլտրամանուշակագույն լույսի վրա՝ նկարելու համար:
Տեղադրեք գելը ապակե ափսեի վրա՝ այն ուղղակիորեն ուլտրամանուշակագույն էկրանի վրա դնելու փոխարեն:
Երբեմն ուլտրամանուշակագույն լույսը չափազանց ուժեղ է, վնասում է ԴՆԹ-ն և ազդում հետագա կլոնավորման վրա:

նկարեք գել առանց ապակու միայն ժապավենը կտրելուց հետո: Այլևս խումբ չկա, բայց նկարը պարզապես հղում կլինի՝ հաստատելու, որ դուք ճիշտ ժապավեն եք կտրել:

IMHO, առանց դրա կրկնօրինակման ապացույցների, միայն շարունակական անձնական և բիոֆորումի դիտարկումների, Xba-ն խնդիրն է:

Կներեք, չեմ կարող ավելի կոնկրետ լինել:

Բացի այդ, դուք ունե՞ք որևէ միջոց երաշխավորելու ձեր PCR-արտադրանքի կտրումը: Քանի՞ լրացուցիչ հիմք եք մտցրել ձեր այբբենարանների մեջ՝ սահմանափակման վայրերի կողքին: (Թե՞ դուք առաջին անգամ կլոնավորե՞լ եք տոպո):
Btw. Դուք նաև գել եք մաքրում ձեր PCR արտադրանքը: Եթե ​​ձեր PCR-ն տալիս է մեկ կոնկրետ գոտի, ես չեմ հասկանում, թե ինչու եք դա անում (գիտեմ, որ դուք կարող եք հեշտությամբ կապել ուլտրամանուշակագույն լույսով ներդիրը և վեկտորը, բայց եթե անհրաժեշտ չէ, մի արեք դա, հնարավորության դեպքում օգտագործեք սյունակի մաքրում):


Կենսաբանության լաբորատորիաներ

Պլազմիդները կտրելու համար օգտագործվում են սահմանափակող ֆերմենտներ։ Մենք անդրադարձել ենք պլազմիդներին նախորդ դասախոսության ժամանակ: Այստեղ կարող եք ամբողջական նկարագրություն ունենալ սահմանափակող ֆերմենտների մասին:

Որպես ամենահիմնական ներածություն, ես կասեի, որ սահմանափակող ֆերմենտները բակտերիաների ֆերմենտներ են, որոնք ներկայացնում են բակտերիաների մի տեսակ իմունային ֆունկցիա: Նրանք զույգերով առկա են բակտերիաներում՝ ԴՆԹ մեթիլազ և սահմանափակող ֆերմենտ: Նրանք երկուսն էլ ճանաչում են նույն հաջորդականությունը: Բակտերիաները մեթիլացնում են սեփական ԴՆԹ-ն հատուկ հաջորդականությամբ: Դրանով սեփական ԴՆԹ-ն պաշտպանված է ցանկացած օտար ԴՆԹ-ից: Քանի որ հորիզոնական գեների փոխանցումը բավականին տարածված է բակտերիաների մեջ, բակտերիալ բջիջը կարող է պաշտպանել իր սեփական գենետիկական նյութը սահմանափակող ֆերմենտների օգնությամբ: Բջիջ մտնող օտար ԴՆԹ-ն կներկայացնի ԴՆԹ-ի մեթիլացման այլ օրինաչափություն: Չմեթիլացված ճանաչման վայրերը կկտրվեն սահմանափակող ֆերմենտներով և դրանով կկործանվեն:

Տարբեր բակտերիաների տեսակներ ունեն տարբեր սահմանափակող ֆերմենտներ՝ տարբեր ճանաչման վայրերով (անշուշտ, յուրաքանչյուրն ունի նաև ԴՆԹ մեթիլտրանսֆերազ): Սահմանափակող ֆերմենտի անվանացանկը արտացոլում է դրանց ծագումը: Ամենակորևոր դեպքում Eco RI ֆերմենտի անունը մեզ տեղեկացնում է, որ այն առանձնացվել է Escherichia coli R շտամից և առաջինն է եղել, որ մեկուսացվել է այս շտամից:

Մոլեկուլային կենսաբանության լաբորատորիայում մենք դրանք օգտագործում ենք պլազմիդները կտրելու և շահարկելու համար: Նրանք նման են մկրատի, որը կարող է ուղղվել պլազմիդի հատուկ վայրեր՝ այն ճեղքելու համար: Կայքի հատուկ կտրող ֆերմենտների համապատասխան հավաքածուով մենք կարող ենք մտնել գենետիկական ճարտարագիտության շատ հետաքրքիր ոլորտ:

Եկեք նայենք սահմանափակող ֆերմենտների մի քանի հիմնական օգտագործմանը.

Դուք կարող եք ստուգել լավ ներածական տեսանյութը այստեղ:

Ամեն դեպքում, ֆերմենտների հետ աշխատելիս, խնդրում ենք օգտագործել լատեքսային ձեռնոցներ, իսկ ֆերմենտները պահել սառույցի վրա:

Սահմանափակող ֆերմենտի միավորը “U” նշանակում է ֆերմենտի այն քանակությունը, որն անհրաժեշտ է 1 մկգրամ պլազմիդի մեկ հատման վայրով մեկ ժամվա ընթացքում իդեալական միջավայրում կտրելու համար:

Ռեակցիայի միջավայրն ապահովվում է բուֆերներով։ Ֆերմենտները սովորաբար տրամադրվում են 10 U/ul կոնցենտրացիայով (10 միավոր մեկ միկրոլիտրում): Ֆերմենտները մատակարարվում են գլիցերինի լուծույթով և միշտ պահվում են -20 C ջերմաստիճանում: Բուֆերը կարող է նաև հայտնվել 10 անգամ խտացված լուծույթում (10X), և այն պետք է նաև սառեցված պահվի:

Տիպիկ սահմանափակող ֆերմենտային ռեակցիան ստեղծվում է հետևյալ կերպ.

1. Ստուգեք քարտեզը պլազմիդի կտրման վայրերի բաշխման համար:

2. Չափել կոնցենտրացիան պլազմիդի լուծույթը սպեկտրոֆոտոմետրով: Ձեր պլազմիդի կոնցենտրացիան պետք է լինի 1 մկգ/միկրոլիտրի սահմաններում:

3. Հաշվե՛ք պլազմիդի անհրաժեշտ ծավալը վերջում ունենալ անհրաժեշտ քանակությամբ ապրանք. Ռեակցիայի ծավալը պետք է հնարավորինս ցածր լինի և չպետք է գերազանցի 100 մլ/ռեակցիոն խողովակը: Օգտագործեք ստերիլ, առանց ԴՆԹ-ի միկրոցենտրիֆուգ (այսպես կոչված) “Eppendorf” խողովակներ:

4. Պլանավորեք ռեակցիան: Պլազմիդի մեկ միկրոգրամում դուք պետք է ունենաք մոտավորապես 1-ից 10 U ֆերմենտ: Ռեակցիայի վերջնական ծավալում ֆերմենտի ընդհանուր ծավալը պետք է լինի 1/10-ից պակաս, քանի որ գլիցերինի ավելի բարձր կոնցենտրացիան կարող է փոխել ռեակցիայի առանձնահատկությունը: Բուֆերը կկազմի վերջնական ծավալի 1/10-ը: Պահպանեք վերջնական ծավալը ցածր (100 միկրոլիտրից պակաս): Անհրաժեշտության դեպքում, նուկլեազազերծ ջրով հարմարեցրեք ռեակցիայի ծավալը պլանավորված վերջնական ծավալին: Ստուգեք ռեակցիայի օպտիմալ ջերմաստիճանը: Այն սովորաբար 37C է, բայց կարող է տարբերվել: Ստուգեք ֆերմենտի հնարավոր աստղային ակտիվությունը իր տվյալների թերթիկում:

Խառնեք հետևյալ բաղադրիչները (ul-ն նշանակում է միկրոլիտր).

16ուլ Nuclease Free Water+

1ուլ Պլազմիդի լուծույթ (կոնցենտրացիան 1մգ/ուլ)+

2ուլ 10X Բուֆեր+

1 ուլ սահմանափակող ֆերմենտ (10 U/ul)

5.Արձագանքը պլանավորելուց հետո, սկսել դա անելու համար բերեք սառույց, պատրաստեք խողովակներ, հալեցրեք բուֆերը ձեր ձեռքերում:

6. Պիպետտ ջրի, պլազմիդի և բուֆերի պահանջվող ծավալները խողովակի մեջ:

7. Ավելացնել ֆերմենտը դեպի խողովակ և նրբորեն խառնել: Մի հորձանուտ!

8. Ռեակցիան դրեք թերմոստատի մեջ սահմանել անհրաժեշտ ջերմաստիճանը:

9. Վերադարձեք ֆերմենտը և բուֆերը -20C և մաքրիր քո նստարանը:

10. Հատկացված ժամանակն անցնելուց հետո, դադարեցնել ռեակցիան. Մենք սովորաբար ռեակցիան պահում ենք թերմոստատում 4 ժամ։ Դուք կարող եք դադարեցնել ռեակցիան մի քանի եղանակներով՝ ավելացնելով EDTA՝ ջերմացնելով ֆերմենտը 85C ջերմաստիճանում 10 րոպեի ընթացքում, կամ պարզապես խողովակը սառեցնելով և պահելով սառեցված՝ մինչև այն մաքրվի:


Արդյունքներ

Պլազմիդների պահպանման չափանիշ՝ կոնյուգացիայի միջոցով

Մենք օգտագործեցինք պարզ կինետիկ մոդել՝ ուսումնասիրելու, թե որքանով է HGT-ն նպաստում պլազմիդի պահպանմանը: Մոդելը նկարագրում է մեկ պոպուլյացիա (Ս), որը կամ կրում է պլազմիդը (Ս 1) կամ պլազմիդից զերծ է (Ս 0 ) (նկ. 1բ, Լրացուցիչ մեթոդներ, Լրացուցիչ հավասարումներ (3)–(4)): Մասնավորապես, մենք որոշեցինք այն պայմանները, որտեղ պլազմիդ կրող պոպուլյացիան գերիշխող է` կրիտիկական խոնարհման արդյունավետության պահպանողական գնահատական ​​տալու համար: Այն սահմանափակող դեպքի համար, որտեղ պլազմիդի կորստի արագությունը համեմատաբար փոքր է (տես Լրացուցիչ մեթոդներ, «Կայունության չափանիշի ստացում»), մենք ստացանք կրիտիկական խոնարհման արդյունավետությունը ( (>), հավասարում. (1)), որը մոտավոր է գերիշխող պլազմիդի կայունության վերին սահմանին.

որտեղ α ցույց է տալիս հարաբերական արժեքը (α > 1) կամ օգուտը (α < 1) պլազմիդի, կ պլազմիդի կորստի արագության հաստատունն է, և Դ երկու պոպուլյացիաների նոսրացման արագությունն է: Այսպիսով, մենք օգտագործում ենք «տեսակ» տերմինը՝ եզակիորեն սահմանված (>) ունեցող ցանկացած երկու պոպուլյացիաների միջև տարբերակելու համար, որը նվազագույն չափով պահանջում է տարբեր բակտերիաների կլոններ՝ գենետիկորեն տարբեր նախադրյալներով (օրինակ՝ շտամներ կամ տաքսոնոմիկ եղանակով։ բազմազան տեսակներ):

Համաձայն հավասար. (1), պլազմիդը կպահպանվի այնքան ժամանակ, քանի դեռ զուգավորման արդյունավետությունը բավականաչափ արագ է` համեմատած պլազմիդի կորստի արագության և ֆիթնես բեռի հետ (նկ. 1c, d): Բավականաչափ արագ խոնարհման արդյունավետությունը անհրաժեշտ է, որպեսզի պլազմիդ կրող պոպուլյացիան գերիշխող լինի (Ս 1 > Ս 0, Նկար 1c), նույնիսկ երբ պլազմիդը փոքր-ինչ օգտակար է (α թեթևակի է <1): Մեր չափանիշը նման է Ստյուարտի և Լևինի կողմից ստացված չափանիշին 17, բայց ավելի խիստ է նրանով, որ այն հետագայում պահանջում է պլազմիդ կրող պոպուլյացիայի գերակայություն: Այն նաև խուսափում է փորձարարական մարտահրավերներից, որոնք կապված են պլազմիդի կորստի չափումները ֆիթնեսի արժեքից անջատելու հետ 42: Փորձնականորեն նկատվել է պլազմիդի կորուստ (կ obs) կարող է որոշվել՝ չափելով քայքայման ժամանակի հաստատունը չփոխանցվող պլազմիդի համար, որը ներկայացնում է ճշմարիտի համակցված ազդեցությունը. կ և α (Լրացուցիչ նկ. 1Ա) 43: Իրոք, վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ (kappa _> մոտ kappa) նվազագույն ֆիթնես էֆեկտներով պլազմիդների համար (α ≈ 1). Քանի որ այս երկու պարամետրերը դժվար է տարանջատել, մեր չափանիշը միավորում է դրա ազդեցությունը α և կ միասին. Որոշելու համար կ obs, մենք ընտրեցինք օգտագործել էժան պլազմիդ (α = 1.02) ծախսերի շփոթեցնող ազդեցությունները նվազագույնի հասցնելու համար: Ելնելով մեր փորձարարորեն որոշված ​​պարամետրերից՝ վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ պլազմիդի կորստի արագության տեղադրման հետ կապված ստանդարտ սխալը (≈ 0,0022) ավելի մեծ է, քան տարբերությունը: կ obs և կ (Տե՛ս Լրացուցիչ մեթոդներ, «Պլազմիդի կորստի հաշվարկներ», ամբողջական ածանցման համար):

Կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունություն սինթետիկ համակարգում

Ստուգելու համար, թե արդյոք սովորական ամուսնական պլազմիդների զուգակցման արդյունավետությունը բավականաչափ արագ է ծախսերը փոխհատուցելու համար, մենք նախ ընդունեցինք F պլազմիդից ստացված սինթետիկ խոնարհման համակարգ: Այս համակարգում կոնյուգացիոն մեխանիզմը կոդավորված է օգնական պլազմիդի F-ի վրաHR, որը ինքնափոխանցելի չէ 44 . Երկրորդ պլազմիդը կարող է մոբիլիզացվել կոնյուգացիայի միջոցով, երբ այն կրում է փոխանցման հաջորդականության F սկզբնաղբյուրը orT. Այստեղ մենք օգտագործում ենք մոբիլիզացվող պլազմիդ, որը նշվում է K, որն արտահայտում է YFP-ն ուժեղ բաղադրատար պրոմոտոր P-ի հսկողության ներքո:ՌԿանամիցինի (Կան) դիմադրության գեն (կ ա n Ռ ) 44 , և orT. Խոնարհման ազդեցությունը քանակականացնելու համար մենք ներդրեցինք K-ին նույնական պլազմիդ, բացառությամբ, որ այն չի կրում orT (K − ), և, հետևաբար, չի կարող փոխանցվել խոնարհմամբ: Սինթետիկ համակարգը ներդրվել է ինժեներական ածանցյալի մեջ Էշերիխիա կոլի MG1655, որն արտահայտում է կազմավոր կապույտ լյումինեսցենտ սպիտակուց (BFP) քրոմոսոմային և կարբենիցիլինի (Carb) դիմադրություն (Amp R) 45, որը նշվում է B (նկ. 2ա): Պլազմիդ կրող պոպուլյացիաները (B K, B K−) կարելի է տարբերել պլազմիդից զերծ պոպուլյացիայից (B 0) ընտրովի ծածկույթով (օգտագործելով Carb+Kan) կամ հոսքի ցիտոմետրիա (օգտագործելով YFP) (Լրացուցիչ նկար 2A): Այս նշումը կօգտագործվի տեքստում բոլոր տեսակների և պլազմիդների համակցությունները նկարագրելու համար (տես Լրացուցիչ մեթոդներ, «Անվանակատուրա»):

Այս համակարգը ապահովում է մաքուր փորձարարական կոնֆիգուրացիա՝ պարզաբանելու կոնյուգացիայի ներդրումը պլազմիդի պահպանման գործում: K-ն հնարավորություն է տալիս ավելի ճշգրիտ պարամետրերի գնահատումներ կատարել՝ համեմատած բնական ինքնահաղորդվող պլազմիդների հետ: Բնական պլազմիդները հաճախ կոդավորում են լրացուցիչ գործառույթներ, որոնք բարդացնում են չափումները, ինչպիսիք են կախվածության մոդուլները, որոնք կարող են հանգեցնել դուստր բջիջների հետսեգրացիոն սպանություններին46: Կարևոր է, որ առանց չփոխանցվող հսկիչ պլազմիդի, դժվար է HGT-ի ազդեցությունը անջատել այլ գործընթացներից: Փոխարենը, պլազմիդի կորուստը և ֆիթնեսի ծանրաբեռնվածությունը կարելի է ճշգրիտ չափել K−ի միջոցով, որը վերացնում է խոնարհման շփոթեցնող ազդեցությունը: Քանի որ orT էականորեն չի ազդել K-ի ծանրաբեռնվածության վրա՝ համեմատած K-ի հետ (Լրացուցիչ Նկ. 1B, Պ > 0.5, երկկողմանի տ-թեստ), տարբերությունները, որոնք առաջանում են ընդհանուր դինամիկայի մեջ, կարող են վերագրվել խոնարհմանը:

K-ի մեր չափումներից մենք ակնկալում ենք, որ խոնարհումը բավական արագ կլինի, որպեսզի հնարավոր լինի պահպանել հակաբիոտիկների ընտրության բացակայության դեպքում: Մասնավորապես, մեր չափումները կ = 0,001 h −1 (Լրացուցիչ Նկար 1A), α = 1.02 (Լրացուցիչ նկ. 1C), և ենթադրելով Դ ≈ 0,05 h −1 , մենք գնահատում ենք կրիտիկական արդյունավետությունը (> = 0,002) h −1, որ շատ ցածր լինի խոնարհման արդյունավետության գնահատականից էքսպոնենցիալ փուլային աճից (> մոտ 0.01) h −1 34 (տես Մեթոդներ, «Գնահատում (>)»): Իրոք, բջջային ֆիզիոլոգիան կարող է կտրուկ փոխել խոնարհման արդյունավետությունը 34 , քանի որ այս արժեքը գրեթե չորս կարգով մեծ է, քան անշարժ փուլից հավաքված բջիջներից չափված արդյունավետությունը (Լրացուցիչ Աղյուսակ 3):

Կոնյուգացիայի միջնորդությամբ պլազմիդի պահպանումը փորձարկելու համար մենք B K և B 0-ը խառնել ենք հավասար ֆրակցիաների և մշակել դրանք միասին: Հզոր նոսրացում (10000×) կատարվում էր յուրաքանչյուր 24 ժամը մեկ՝ աճը պահպանելու համար: Կանի տարբեր կոնցենտրացիաներ (0, 0.5 և 2 μg/mL) օգտագործվել են տարբերվելու համար α (1.02, 0.97, 0.42, համապատասխանաբար) (Լրացուցիչ նկ. 1C): Մի քանի օրը մեկ մենք քանակականացնում էինք պլազմիդ կրող բջիջների ֆրակցիաները (արտահայտող BFP և YFP) և պլազմիդից զերծ բջիջները (միայն BFP արտահայտող)՝ օգտագործելով հոսքի ցիտոմետրիա (տես Լրացուցիչ Նկ. 2Ա և Մեթոդներ բաժինը «Հոսքի ցիտոմետրիայի չափորոշում» բաժինը՝ տրամաչափման մանրամասների համար): .

Կոնյուգացիայի բացակայության դեպքում, երբ պլազմիդն ունի ծախսեր (օրինակ՝ Kan = 0 և α > 1) պլազմիդ կրող պոպուլյացիան վերացվել է 2 շաբաթ հետո (նկ. 2b, ձախ մոդելավորում և աջ փորձ): Այսպիսով, չփոխանցելի թանկարժեք պլազմիդի համար հակաբիոտիկների վերացումը հանգեցնում է դիմադրության հակադարձմանը: Եթե ​​պլազմիդը բավականաչափ օգտակար էր, ապա պլազմիդ կրող պոպուլյացիան կարող էր գոյակցել պլազմիդից զերծ պոպուլյացիայի հետ (նկ. 2b, ձախ մոդելավորում և աջ փորձ): Պլազմիդ կրող բջիջների մասնաբաժինը կախված էր աճի առավելությունների հարաբերական մեծությունից՝ համեմատած պլազմիդի կորստի հետ: Ի հակադրություն, եթե պլազմիդը փոխանցելի է կոնյուգացիայի միջոցով, նույնիսկ այն դեպքում, երբ պլազմիդը կրում է ծախսեր, կարճ ժամանակահատվածում պլազմիդ կրող բջիջները գերակշռում են պոպուլյացիայի վրա (նկ. 2c, ձախ մոդելավորում և աջ փորձ): Ինտուիտիվ կերպով, ծախսերի նվազում կամ օգուտի ավելացում (այսինքն՝ նվազում α) հեշտացնում է կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունությունը, և, հետևաբար, պլազմիդի կայունությունը տեղի է ունենում ավելի արագ ժամանակային մասշտաբով (նկ. 2c): Երբ պլազմիդի օգուտը բավականաչափ բարձր է (նկ. 2գ), պլազմիդը պահպանվում է անկախ նրանից, թե արդյոք այն կարող է զուգակցվել, թե ոչ, ինչը ցույց է տալիս, որ դիմադրությունը պահպանելու համար այլևս չի պահանջվում կոնյուգացիա:

Թանկարժեք պլազմիդների կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունություն: Բոլոր մոդելավորման և փորձարարական արդյունքների համար, x-առանցքը օրեր են և y- առանցքը բջիջների մասն է: ա Ինժեներական կոնյուգացիա: Ֆոնային շտամը, B, արտահայտում է BFP-ն և Amp R-ը 45: B-ն կրում է օգնական պլազմիդ FHR (B 0), որը ինքնահաղորդիչ չէ, բայց կարող է մոբիլիզացնել պլազմիդները տրանս. Շարժական պլազմիդ K կրում է փոխանցման սկզբնաղբյուրը (orT), կանամիցին դիմացկուն գեն (Kan R) և yfp ուժեղ կոնստիտուցիոնալ պրոմոութեր ՊՌ 44 . Երբ B-ն կրում է K, այն նշվում է B K: K առանց փոխանցման (այսինքն, առանց orT) նշանակվում է K − , իսկ երբ իրականացվում է B-ով, B K− ։ բ Երկարաժամկետ դինամիկա առանց խոնարհման: Կապույտը ներկայացնում է պլազմիդից զերծ և նարնջագույն պլազմիդ կրող բջիջները: Ստվերավորված գծերը ցույց են տալիս փորձնականորեն ուժեղ նոսրացման արդյունքում առաջացած տարբեր սկզբնական պայմաններ (

80 բջիջ/հոր, 16 հորատանցք) կամ պատահականորեն ընտրված միատեսակ բաշխումից (ընդհանուր սկզբնական խտությունը պահպանվում է 1 × 10 -6, 20 կրկնություն): Թավ գծերը միջինն են համապատասխան գույնի բոլոր սկզբնական պայմաններում: Մոդելավորում (ձախ). i–iii է α = 1.02, 0.97 և 0.42, համապատասխանաբար, գնահատված փորձարարական չափումներից (Լրացուցիչ նկ. 1C): Փորձ (աջից). i–iii-ն է Kan = 0, 0.5 և 2 μg/mL: Քանակականացումն իրականացվում է հոսքի ցիտոմետրիայի միջոցով, որտեղ նարնջագույն գծերը բջիջներ են, որոնք արտահայտում են և՛ BFP, և՛ YFP (B K− ), իսկ կապույտ գիծը՝ միայն BFP (B 0 ) արտահայտող բջիջներ: գ Երկարաժամկետ դինամիկա խոնարհմամբ: Փորձերն արվել են նույն կերպ, ինչ (B), B K-ի փոխարեն B K-ի փոխարեն: Առանց հակաբիոտիկների, պլազմիդ կրող պոպուլյացիան գերակշռում էր, չնայած պլազմիդի արժեքին, դրսևորելով կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունություն: Մոդելավորման բոլոր պարամետրերը նույնական են, բացառությամբ (> = 0,025) h −1: դ Ինը կոնյուգացիոն պլազմիդներ, որոնք կրում են R տեսակը (բացի C-ով B 0-ով, որն իրեն նման է պահում, Լրացուցիչ Նկ. 3D) ցուցաբերում են խոնարհման օգնությամբ կայունություն: R0-ը խառնվում է հավասար մասի մեջ R P-ի հետ (P պլազմիդի ընդհանուրության համար) և նոսրացվում է 10000× օրական: Չորսից վեց կրկնակի ընտրության թիթեղներից CFU-ն բաժանվել է գաղութների ընդհանուր թվի վրա, որոնք միջինացված են չորսից վեց սմ սալերի վրա՝ քանակականացման համար: Փորձերը կրկնվում են առնվազն երկու անգամ: Սխալների գծերը ներկայացնում են չորսից վեց չափումների ստանդարտ շեղումը: Օգտագործված պլազմիդներն են (i) #168, (ii) #193, (iii) R388, (iv) C, (v) #41, (vi) RP4, (vii) K, (viii) PCU1 և (ix) ) R6K (տես Լրացուցիչ աղյուսակներ 1 և 3)

Ավելին, վերլուծությունը ցույց է տալիս, որ փոխհատուցող մուտացիաները, նույնիսկ մուտացիայի բարձր արագությամբ, էականորեն չեն նպաստել ընդհանուր դինամիկային (Լրացուցիչ նկար 2B): Մենք նշում ենք, որ մեր մոդելը ենթադրում է մշտական ​​նոսրացման արագության հաստատուն (Դ), որը ներկայացնում է մեր փորձերի դիսկրետ, պարբերական նոսրացումների մոտավորությունը: Դիսկրետ նոսրացումներ իրականացնող մոդելի սիմուլյացիան որակապես նույն արդյունքներն է տվել (Լրացուցիչ Նկ. 1D): Վերջապես, մենք ներկայացրեցինք աղմուկը զուգավորման արագության մեջ սկզբնական պայմանների յուրաքանչյուր հավաքածուի համար, այնպես որ (>) կարող է փոքր քանակությամբ տարբերվել բազալ արժեքից՝ միջինի 10%-ի սահմաններում, որը համապատասխանում է կլոնայինին: փոփոխականություն 34. Այս փոփոխականությունը չի փոխում որակական արդյունքները (Լրացուցիչ Նկ. 2C):

Տարբեր պլազմիդների համար կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունություն

Մենք նախկինում ցույց տվեցինք, որ սինթետիկ համակարգի խոնարհման արդյունավետությունը համեմատելի է բնական F պլազմիդների և մի քանի այլ բնական խոնարհման պլազմիդների հետ 34: Հետևաբար, մենք ակնկալում ենք, որ այս պլազմիդները նույնպես կցուցաբերեն խոնարհման օգնությամբ կայունություն: Այդ նպատակով մենք քանակականացրել ենք ութ հավելյալ կոնյուգատիվ պլազմիդների դինամիկան՝ ընդգրկելով անհամատեղելիության վեց խմբեր (incF, incN, incI, incX, incW և incP), որոնք ներառում են >70% ամենատարածված խոշոր պլազմիդներից մեկուսացված: Enterobacteriacea (335 պլազմիդներ, որոնք >20 կԲ են GenBank-ից) 47, ընդգրկում են կոնյուգացիայի արդյունավետության և ֆիթնեսի էֆեկտների լայն շրջանակ (Լրացուցիչ Նկ. 3A, B) և ներառում են երեք կլինիկական մեկուսացված կոնյուգատիվ պլազմիդներ, որոնք կոդավորում են ընդլայնված սպեկտրի β-լակտամազները (ESBLs): ESBL արտադրող պաթոգենները հայտնի են պլազմիդի միջնորդությամբ 48,49,50 կոնյուգացիայով և հանդիսանում են գլոբալ առողջության առաջնային մտահոգություն 51, 52: Մենք յուրաքանչյուր առանձին պլազմիդ տեղափոխեցինք ընդհանուր ֆոնային շտամ (E. coli MG1655 քրոմոսոմային ինտեգրված dTomato-ով և քլորամֆենիկոլով (Cm) դիմադրությամբ (Cm R), որը նշվում է R), և քանակականացրել է համապատասխան պարամետրերը՝ (>) գնահատելու համար, C պլազմիդը քանակականացվել է ֆոնային լարվածությամբ: B, քանի որ և՛ պլազմիդ C-ն, և՛ R շտամը արտահայտում են Cm R-ն, և B-ն իրենց որակապես նման են R-ին (Լրացուցիչ նկ. 3D):

Մեր գնահատականները ցույց են տալիս կայունության մեծ հավանականություն (left( <>n = > - > >0> ight) ) ինը պլազմիդներից յուրաքանչյուրի համար (Լրացուցիչ Նկ. 3C, ներառյալ RK-ն վերահսկման համար), կամ այն ​​պատճառով, որ դրանք բավականաչափ օգտակար են և/կամ փոխանցվում են բավական արագ: Սա փորձարկելու համար մենք իրականացրեցինք նույն մրցակցային փորձերը, ինչպես նախկինում նկարագրված էր, և քանակականացրեցինք պլազմիդ կրող բջիջների մասնաբաժինը, օգտագործելով գաղութներ ձևավորող միավորներ (CFU) կրկնակի հակաբիոտիկ թիթեղների վրա (տես Մեթոդներ): Ամենօրյա նոսրացումները կատարվել են 14-20 օրվա ընթացքում: Իրոք, յուրաքանչյուր պլազմիդ պահպանվել է փորձի ողջ ընթացքում (նկ. 2դ): Մի քանի պլազմիդների (#168, #193, RP4, R6K և R388) պահպանումը կամ գերակայությունը, ամենայն հավանականությամբ, պայմանավորված էր նրանց չեզոք կամ աննշան օգուտով (Լրացուցիչ Նկ. 3C), ի լրումն արագ փոխանցման: Ի հակադրություն, PCU1-ը պահպանվեց՝ չնայած դրա շատ բարձր արժեքին (գնահատված α ≈ 3, նկ. 2d տես Լրացուցիչ Նկար 3E լոգարիթմականության համար):

Կոնյուգացիայի օգնությամբ համառություն ավելի մեծ բարդության կոնսորցիումներում

Բնական միջավայրերը սովորաբար շատ ավելի բարդ են՝ բաղկացած տարբեր տեսակներից, որոնք փոխկապակցված են գեների փոխանակման բարդ ցանցի միջոցով 6, 53: Նման ցանցերը կարող են ծառայել որպես հակաբիոտիկների դիմադրության ջրամբարներ այսպես կոչված HGT «թեժ կետերում»՝ հնարավորություն տալով տարածել դիմադրողականությունը տարբեր պաթոգենների կամ համընդհանուր միկրոբների նկատմամբ 54,55,56: Հետևաբար, մենք հետաքրքրվեցինք, թե արդյոք զուգակցման օգնությամբ համառությունը կարող է առաջանալ բազմատեսակ համայնքում: Այս հարցը նախկինում երբեք վերջնականապես չի ուսումնասիրվել:

Մոդելավորումն առաջարկում է, որ քանի դեռ կայունության չափանիշը բավարարված է, մեկ պլազմիդը կարող է պահպանվել խոնարհման միջոցով՝ անկախ առկա տեսակների քանակից (նկ. 3ա, Լրացուցիչ մեթոդներ, Լրացուցիչ հավասարումներ (7)–(10)): Սա փորձարկելու համար մենք ներկայացրեցինք երկրորդը E. coli լարում R-ով կամ առանց դրա orT (R K կամ R K− ) (Լրացուցիչ նկ. 4A): Պլազմիդի ընդհանուր պարունակությունը քանակական է որպես պլազմիդ կրող բոլոր տեսակների գումար (R K +B K ): Մեր կանխատեսումներին համահունչ արդյունքները ցույց են տալիս, որ խոնարհումը թույլ է տալիս պլազմիդի կայունությունը՝ համեմատած չկոնյուգացիոն հսկողության հետ (նկ. 3ա):

Կոնյուգացիայի օգնությամբ կայունություն բազմաթիվ տեսակների և/կամ պլազմիդների հետ: ագ x-առանցքը օրեր են և y- առանցքը բջիջների մասն է: Թավ և ստվերավորված գծերը համապատասխանաբար ներկայացնում են միջին կամ անհատական ​​նախնական պայմանները: Գույնը ցույց է տալիս կապույտ՝ առանց պլազմիդի (Ս 0) և նարնջագույն կամ կարմիր՝ պլազմիդ կրող բջիջների համար (Ս 1) K կամ C, համապատասխանաբար. ա Երկու տեսակ, մեկ պլազմիդային համայնք։ Ձախ երկու վահանակ. ոչ մի խոնարհում աջ երկու վահանակ՝ խոնարհմամբ: Ս 0 = B 0 + R 0 և Ս 1 = B K + R K. Մոդելավորում՝ ներքևից (i) վերև (iii) α 1 = α = 1.02, 0.97 և 0.42 համապատասխանաբար և α 2 = 1.03, 1.02 և 0.9 (տես Լրացուցիչ հավասարումներ (7)–(10), Լրացուցիչ Նկ. 4A): Փորձ ներքևից (i)-ից մինչև վերև (iii)՝ Kan = 0, 0.5 և 2 μg/mL, համապատասխանաբար: բ Պլազմիդների ավելի բարձր արժեքի դինամիկա: Մոդելավորում (ձախ սյունակ). Ներքևից (i) վերև (iii) α = 1.13, 1.03 և 0.3 համապատասխանաբար (տես Լրացուցիչ հավասարումներ (3)–(4), Լրացուցիչ Նկ. 4B): Փորձ (աջ սյունակ). Ներքևից (i) վերև (iii)՝ Cm = 0, 0.5 և 2 μg/mL: գ Մեկ տեսակ, երկու պլազմիդային համայնք։ Յուրաքանչյուր տող ներկայացնում է տարբեր համակցություններ α, մոդուլացված առանց հակաբիոտիկի (i), Kan (ii–iii) կամ Cm (iv–v): Տեսակը կարող է կրել երկու (Ս 11), մեկ (Ս 10 , Ս 01), կամ առանց պլազմիդների (Ս 00): Մոդելավորում (առաջին և երրորդ սյունակներ). Ներքևից (i) վերև (v) α 3 = 1.3, 1.2, 0.42, 1.01, 0.35 (տես Լրացուցիչ հավասարումներ (11)–(14), Լրացուցիչ Նկ. 4B): Փորձ. (երկրորդ և չորրորդ սյունակ, որպեսզի Ս 1 = B K + B CK կամ Ս 1 = B C + B CK համապատասխանաբար K-ի կամ C-ի համար): B C-ն հավասարապես խառնվում է B K-ի հետ: դ, ե Եռատեսակ, երեք պլազմիդային համայնք։ Տեսակները (R, Y և B) եզակի լյումինեսցենտ են (արտահայտում են համապատասխանաբար dTomato, YFP կամ BFP) և պլազմիդները (R6K, RP4 և R388, ադամանդի, քառակուսի և շրջանագծի մարկերներ, համապատասխանաբար) ունեն հստակ դիմադրության մարկերներ (Strp R): , Kan R և Tm R, համապատասխանաբար): Ստվերավորման գույնը համապատասխանում է բնակչության համապատասխան մասին (ձախ y-առանցք), իսկ մարկերները ցույց են տալիս յուրաքանչյուր պլազմիդի մասնաբաժինը (աջ y- առանցք): Սկզբնական փորձնական կազմը բաղկացած է R 0, R R6K, Y 0, Y R388, B 0 և B RP4: Մոդելավորում (ձախ). Պատահական սկզբնական պայմաններ, այնպես որ պլազմիդից զերծ ընդհանուր պոպուլյացիաները պահպանվում են 1 × 10 -4 , և պլազմիդի պոպուլյացիան կամայականորեն ընտրվել է 1 × 10 –5 և 1 × 10 6 միջակայքում, տվյալներին համահունչ (Լրացուցիչ Աղյուսակ 2 պարամետրերի գնահատումների համար): Փորձ (աջ). Սխալների գծերը ցույց են տալիս միջինը չորսից վեց ափսե կրկնվողների միջև և կրկնվում հինգ անգամ

Ավելին, մոդելավորումը կանխատեսում է կոնյուգացիայի օգնությամբ համառություն, որը տեղի կունենա մեկ տեսակի համար, որը կրում է բազմաթիվ խոնարհման պլազմիդներ: Սա պայմանավորված է պլազմիդների՝ միմյանցից անկախ գոյատևելու ունակությամբ (օրինակ՝ տարբեր անհամատեղելիության խմբեր՝ ապահովելու համատեղելի վերարտադրող մեխանիզմներ և մակերևույթի բացառման բացակայություն, որը կանխում է պլազմիդներից մեկի մուտքը), և այն փաստը, որ այլ համապատասխան պլազմիդային պարամետրեր ( այսինքն, (>) , α, կամ կ) կտրուկ չեն փոխվում մեկ այլ պլազմիդի առկայությամբ (Լրացուցիչ մեթոդներ, լրացուցիչ հավասարումներ (11)–(14)): Այս գաղափարը ստուգելու համար մենք իրականացրեցինք երկկողմանի զուգակցվող պոպուլյացիա՝ խառնելով B-ը, որը կրում է կամ K կամ մեկ այլ մոբիլիզացվող պլազմիդ C: C-ն արտահայտում է mCherry, Cm R և համատեղելի է K-ի հետ (p15A և pSC101 վերարտադրության սկզբնաղբյուրները, համապատասխանաբար): Անկախորեն, քանի որ C-ն ավելի մեծ արժեք ունի K-ի համեմատ (Լրացուցիչ նկ. 3B), խոնարհումը պահանջեց ավելի երկար ժամանակային սանդղակ մրցակցությունը հաղթահարելու և կայուն պահպանելու համար (նկ. 3b): Միասին յուրաքանչյուր պլազմիդի դինամիկան առանձին-առանձին նույնական էր մեկ պլազմիդի պոպուլյացիայի դինամիկան, անկախ նրանից, թե ինչպես ենք մենք մոդուլավորում α (Նկար 3c, հակաբիոտիկ չկա, Kan, և Cm տես Լրացուցիչ Նկ. 4A, B համար α գնահատականներ):

Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ, չնայած ակնհայտ բարդությանը, պլազմիդի ճակատագիրը մի համայնքում, որը բաղկացած է բազմաթիվ (n) տեսակներ և (էջ) պլազմիդներ (հանգեցնելով դեպի n2 էջ պոպուլյացիաներ) կարելի է եզրակացնել առանձին պլազմիդային դինամիկայից, եթե այդ պլազմիդները չեն խանգարում միմյանց: Յուրաքանչյուր պլազմիդի ճակատագիրը կարգավորվում է խոնարհման օգնությամբ կայունության չափանիշով (օրինակ՝ (> >>) ): Եթե ​​(> >>) առնվազն մեկ այդպիսի զույգի համար, ապա պլազմիդը կպահպանվի, եթե որոշակի հյուրընկալող(ներ)ը կարող է երկար ժամանակ գոյակցել պոպուլյացիայի մեջ: ժամկետը (որը հիմնականում պայմանավորված է ֆիթնեսով): Կարևորն այն է, որ գոյակցող տեսակները պետք է ձեռք բերեն պլազմիդը կամ սկզբնական պոպուլյացիայի կառուցվածքում, կամ խոնարհման միջոցով: Սա հանգեցնում է մրցակցության պատճառով պլազմիդի ինքնահաստատման սկզբնական արգելքի, ինչը հանգեցնում է պլազմիդի ճակատագիրը որոշելու սկզբնական կազմից կախվածության (տես Լրացուցիչ մեթոդներ, «Երեք տեսակի երեք պլազմիդների մոդել»):

Սա փորձարկելու համար մենք կառուցեցինք երեք տեսակներից բաղկացած համայնք (E. coli շտամներ, որոնք նշվում են B 0 , R 0 և Y 0 ), որոնք փոխանցում են երեք փոխհամատեղելի պլազմիդներ (Լրացուցիչ Նկ. 5A, Լրացուցիչ մեթոդներ, Լրացուցիչ հավասարում (16), Լրացուցիչ Աղյուսակ 4): Յուրաքանչյուր պլազմիդ սկզբնավորվել է համապատասխանաբար մեկ տեսակի մեջ (RP4, R6K և R388, որոնք նշված են 1, 2 և 3 Նկ. 3d-ում, Լրացուցիչ Նկ. 5A): Այս երեք պլազմիդները հատկապես ընտրվել են, քանի որ դրանք պատկանում են անհամատեղելիության առանձին խմբերին (X, P և W) և տարբերվում են հակաբիոտիկների ընտրության միջոցով (Ստրեպոմիցին (Strep), Kan և Trimethoprim (Tm), համապատասխանաբար, Լրացուցիչ Աղյուսակ 3): Քանի որ բոլոր տեսակներն արտահայտում են քրոմոսոմային Cm R-ը, մենք օգտագործեցինք ընտրովի պլատինգ՝ պլազմիդային մասնաբաժինը որոշելու համար և հոսքի ցիտոմետրիա՝ տեսակների կազմը որոշելու համար: Այս սցենարում, չնայած պլազմիդները առանձին-առանձին օգտակար են իրենց սեփական հյուրընկալողի համար (α < 1), դրանք ցույց են տալիս ծախս՝ համեմատած մեկ այլ տեսակի/պլազմիդների զույգի հետ (օրինակ՝ համեմատել B RP4-ը R R388-ի հետ, Լրացուցիչ Նկ. 5B): Ելնելով մեր նախորդ գնահատականներից՝ մենք կանխատեսում ենք կայունություն այս համայնքի բոլոր երեք պլազմիդների համար: Իրոք, արդյունքները ցույց են տալիս, որ յուրաքանչյուր առանձին պլազմիդ դրսևորել է կայունություն փորձի ողջ ընթացքում՝ մինչև 2 շաբաթ (նկ. 3e): Խոնարհման բացակայության դեպքում (միայն R 0, B 0 և Y 0), երեք տեսակների միջև մրցակցությունը նպաստում է ամենապիտանի պոպուլյացիային (Y 0), ճնշելով R 0 և B 0 աճը (Լրացուցիչ նկար 5B):

Հակադարձ կոնյուգացիայի օգնությամբ դիմադրության համառություն

Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ տարատեսակ ամուսնական պլազմիդներն իսկապես բավական արագ են փոխանցվում պլազմիդի կայունությունը ապահովելու համար: Ըստ գոյության չափանիշի (Հավասարում (1)), այնուամենայնիվ, դիմադրության հակադարձումը կարող է իրականացվել խոնարհման արգելակման, պլազմիդի կորստի արագության խթանման կամ երկուսի միջոցով (նկ. 4ա): Այս ռազմավարության արդյունավետությունը կախված է նրանից, թե որքանով է (>) գերազանցում (>)-ը: Եթե ​​(>)-ը միայն մի փոքր ավելի է (>)-ից, ապա միայն խոնարհումը արգելակելը կարող է բավարար լինել դիմադրությունը հակադարձելու համար: Եթե ​​միայն արգելակումը թերի է, այնուամենայնիվ, խթանում է կ կարող է գործել սիներգիայով՝ ապակայունացնելու պլազմիդը:

Մենք նախ փորձարկեցինք այս արգելակման ռազմավարությունը ինժեներական խոնարհման համակարգի վրա՝ օգտագործելով լինոլային թթու 57 (Lin)՝ արգելակելու խոնարհումը (Նկար 4b, ձախ վահանակ) և ֆենոթիազին (Pheno)՝ պլազմիդների տարանջատման սխալը 58, 59 (նկ. 4b, աջ) բարձրացնելու համար։ վահանակ): Երկու միացությունները գրականության մեջ հայտնաբերվել են այս հատուկ հատկությունների համար: Կարևորն այն է, որ մեր օգտագործած կոնցենտրացիաներում ոչ մի միացություն չի ազդել բակտերիաների աճի արագության վրա (Լրացուցիչ Նկ. 6Ա): Իրոք, միայն Լինը բավարար էր ցածր խոնարհման արդյունավետությամբ պլազմիդը ապակայունացնելու համար (նկ. 4c, պլազմիդ K): Ավելի մեծ (>) պլազմիդի համար (օրինակ՝ #41 պլազմիդի համար) կամ օգուտ բերեց, միայն Lin-ը անբավարար էր, և Lin-ի սիներգետիկ համակցությունը Pheno-ի հետ վճռորոշ էր հակադարձ դիմադրության համար: (նկ. 4դ): Մենք նշում ենք, որ միայն Pheno-ն չի ազդել խոնարհման արդյունավետության վրա (Լրացուցիչ նկ. 6B):

Հակադարձ դիմադրություն՝ կապված խոնարհման օգնությամբ համառության հետ: ա Համատեղելով կոնյուգացիայի արգելակումը և պլազմիդի կորստի խթանումը դեպի հակադարձ դիմադրություն: Ակնկալվում է, որ այս ռազմավարությունը կավելացնի (>) և կնվազեցնի (>)-ը՝ պոտենցիալ ապակայունացնելով պլազմիդը (Հավասարում (1)): բ Գնահատում է կոնյուգացիայի արգելակիչ լինոլիկ թթուն (Lin) և պլազմիդի կորստի արագության խթանիչ ֆենոթիազին (Pheno): Ձախ. B K-ն և R 0-ն աճեցվել են մեկ գիշերվա ընթացքում 3,25 մՄ Lin-ով կամ առանց դրա՝ կոնյուգացիայի արդյունավետությունը քանակականացնելու համար (տես Մեթոդներ): Աջ. B K−-ն ամեն օր տարածվում էր 50 μg/mL Kan, ոչինչ կամ 120 μM Pheno-ի առկայության դեպքում: Կանը օգտագործվել է որպես հսկիչ: Յ-առանցքը B K-ի մասնաբաժինը առանց հակաբիոտիկի է, որը նորմալացվում է Kan-ով բուժվող մասնաբաժինը հոսքի ցիտոմետրիայի միջոցով: Ֆենոն զգալիորեն մեծացրել է պլազմիդի կորստի արագությունը

քառապատիկ (տես Լրացուցիչ նկ. 6B, աջ վահանակ): գ, դ R K-ի և R41-ի արգելակում: R0-ը և RK-ը կամ R41-ը խառնվում են հավասար ֆրակցիաների մեջ և նոսրացվում 10000× օրական 11 օրվա ընթացքում: Յ- առանցքը պլազմիդ կրող բջիջների մասն է և x- առանցքը օրեր են: Կանաչ ստվերումը ցույց է տալիս բուժումը մութից դեպի լույս՝ հսկողություն, ֆենո, լին և համակցված: Երկու պլազմիդներն էլ հաջողությամբ հակադարձվեցին, երբ Լինը միայն բավարար էր, Ֆենոն ուներ նվազագույն ազդեցություն (K): Եթե ​​միայն Լինն անբավարար էր, ապա Ֆենոյի հետ Լինը սիներգետիկորեն ապակայունացրեց պլազմիդը: ե Lin-ի և Pheno-ի հետ համակցված բուժումը ճնշված կամ հակադարձեց դիմադրողականությունը: Օգտագործվել են նույն շտամները և արձանագրությունը, ինչպես Նկ. 2d-ում, բացառությամբ, որ միջավայրը լրացվել է օրական 3,25 մՄ Lin-ով և 120 μM Pheno թարմ-ով (տես Մեթոդներ): Օգտագործված պլազմիդներն են (i) #168, (ii) #193, (iii) R388, (iv) C, (v) #41, (vi) RP4, (vii) K, (viii) PCU1 և (ix) ) R6K (տես Լրացուցիչ աղյուսակներ 1 և 3): Բոլոր CFU չափումները կատարվել են չորսից վեց թիթեղների կրկնօրինակներով և կրկնվել են առնվազն երկու անգամ՝ վերարտադրելիության համար: Հոսքի բոլոր չափումները տարածվել են առնվազն ութ հորերի կրկնօրինակմամբ և կրկնվել առնվազն երկու անգամ՝ վերարտադրելիության համար: Սխալների գծերը ներկայացնում են ափսեի կամ ջրհորի կրկնօրինակների ստանդարտ շեղումը

Մենք պարզեցինք, որ Լինը երեք անգամ նվազեցրեց զուգավորման արդյունավետությունը բնիկ պլազմիդների մեծ մասի համար (Լրացուցիչ նկ. 6C) և նույնիսկ 50 անգամ մեկում (տես Լրացուցիչ Աղյուսակ 3 բոլոր ծալովի փոփոխությունների համար): Կարգավորելով կանխատեսված (>) այս նվազման համար, պահպանելով նույն արժեքը (Լրացուցիչ Նկ. 6D) և ենթադրելով ֆենո-ուժեղացված պլազմիդի կորստի արագության քառապատիկ աճ (Լրացուցիչ Նկ. 6B, աջ), մեր չափանիշը կանխատեսում է, որ պլազմիդների մեծ մասի համար զուգակցման օգնությամբ կայունությունը զգալիորեն կնվազի (Լրացուցիչ Նկ. 6E, Լրացուցիչ Աղյուսակ 3): Իրոք, Lin-ի և Pheno-ի համադրությունը հանգեցրեց պլազմիդների >99% վերացման, որտեղ Δn < 0 (նկ. 4e, պլազմիդներ K, #41, #168, PCU1, Լրացուցիչ Նկ. 6F լոգամասշտաբ PCU1-ի համար՝ համեմատած լրացուցիչ Նկ. 3E-ի հետ): Եթե ​​Դn մոտ է, բայց մի փոքր ավելի, քան 0-ը, պլազմիդը դեռ պահպանվել է, բայց վարակիչության նվազեցվածությամբ (նկ. 4e պլազմիդներ C, #193): Եթե ​​Դn բավականաչափ մեծ է (>>0), պլազմիդը պահպանվել է (նկ. 4e պլազմիդներ RP4, R6K, R388): Այնուամենայնիվ, դրանք ավելի քիչ գերակշռող էին Լինի և Ֆենոյի բացակայության համեմատությամբ (նկ. 2դ), ինչը ցույց է տալիս խոնարհման դերը դրանց պահպանման գործում։ Այն, որ այս երեք պլազմիդներն ավելի դժվար էին շրջել, զարմանալի չէ, քանի որ նրանք փոքր բեռ կամ նույնիսկ օգուտ են բերում R-ին (Լրացուցիչ նկար 3B):


Պլազմիդային մեկուսացում, օգնե՞լ նոսրացման քայլին: - (ապր/16/2009)

Ես առանձնացրել և սպեցիֆիկացրել եմ իմ պլազմիդային ԴՆԹ-ն և ստացել եմ 6,645 մգ/ուլ կոնցենտրացիան: Իմ լաբորատորիան սիրում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի չափաբաժինը 200 մգ ԴՆԹ-ի չափով, և ես պետք է նոսրացնեմ պլազմիդի ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան մինչև 1 մգ/ուլ: Ինչպե՞ս կարող եմ դա անել: Ես ունեմ ընդհանուր ծավալը 98 ուլ, և այս կաղապարով, որը մենք օգտագործում ենք, ասում է, որ օգտագործեք 30,10 ուլ 200 ug-ի համար: Բայց այս կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է:

դուք ցանկանում եք նոսրացնել ձեր պլազմիդը մինչև 1 մգ/ուլտր:
Ձեր նախնական կոնցենտրացիան 6,645 մգ/ուլտր է, դուք պետք է նոսրացնեք 6,645 անգամ:
ձեր նախնական ծավալը 98 մլ է: վերջնական ծավալը կլինի 98*6.645 = 651 uL
Այսպիսով, դուք ավելացնում եք 553 uL ձեր 98 uL-ին (651 - 98 = 553 uL), որպեսզի ստանաք 1 մգ/ուլտր վերջնական կոնցենտրացիան:

եթե ուզում եք 200 մգ չափաբաժին, ապա պետք է 200 մգ (1 մգ/ուլ = 200 մգ/200 մգ)

actin_crazy 2009 թվականի ապրիլի 16-ին, առավոտյան 06ᛁ-ին ասաց.

Ես առանձնացրել և սպեցիֆիկացրել եմ իմ պլազմիդային ԴՆԹ-ն և ստացել եմ 6,645 մգ/ուլ կոնցենտրացիան: Իմ լաբորատորիան սիրում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի չափաբաժինը 200 մգ ԴՆԹ-ի չափով, և ես պետք է նոսրացնեմ պլազմիդի ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան մինչև 1 մգ/ուլ: Ինչպե՞ս կարող եմ դա անել: Ես ունեմ ընդհանուր ծավալը 98 ուլ, և այս կաղապարով, որը մենք օգտագործում ենք, ասում է, որ օգտագործեք 30,10 ուլ 200 ug-ի համար: Բայց այս կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է:

Ոչ, դուք ավելացնում եք 30,1 մգ (200 մգ) պաշար նոր խողովակի մեջ, այնուհետև ավելացնում եք MQ կամ բուֆեր 200 մլ, այնպես որ դուք ունեք 1 մգ/ուլ պլազմիդ և այն այլևս 6,645 մգ/ուլ չէ։

Բանն այն է, որ պլազմիդի քանակությունը ամրագրված է ձեր սկզբնական պաշարում, կարող եք կարգավորել կոնցենտրացիան՝ ավելացնելով բուֆերի տարբեր ծավալ:

actin_crazy 2009 թվականի ապրիլի 16-ին, 03ᛁ-ին ասաց.

Ես առանձնացրել և սպեցիֆիկացրել եմ իմ պլազմիդային ԴՆԹ-ն և ստացել եմ 6,645 մգ/ուլ կոնցենտրացիան: Իմ լաբորատորիան սիրում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի չափաբաժինը 200 մգ ԴՆԹ-ի չափով, և ես պետք է նոսրացնեմ պլազմիդի ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան մինչև 1 մգ/ուլ: Ինչպե՞ս կարող եմ դա անել: Ես ունեմ ընդհանուր ծավալը 98 ուլ, և այս կաղապարով, որը մենք օգտագործում ենք, ասում է, որ օգտագործեք 30,10 ուլ 200 ug-ի համար: Բայց այս կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է:


Որպեսզի ձեր ԴՆԹ-ն ունենա 1 մգ/ուլ կոնցենտրացիա, դուք պետք է այն նոսրացնեք 6,645 անգամ (այսինքն՝ ավելացնեք 6,645 անգամ, քան արդեն ունեք):

Սա հաշվարկելու այլ եղանակ է. C1V1=C2V2
որտեղ C1-ը ձեր սկզբնական կոնցենտրացիան է (6,645 մգ/ուլ), V1-ը՝ ձեր սկզբնական ծավալը (98 մլ), C2-ը՝ ձեր վերջնական կոնցենտրացիան (1 մգ/ուլ) և V2՝ վերջնական ծավալը, որն անհրաժեշտ է այս դեպքում.
V2=6.645*98/1= 651.21 ուլտր, այնպես որ դուք պետք է ավելացնեք 553.21 մլ այն ամենից, ինչում ձեր ԴՆԹ-ն նոսրացված է, ձեր 98 մլ-ին:

Ձեր մյուս հարցին, ձեր 6,645 մգ/ուլ 30,1 ուլտրը կպարունակի 200 մգ (այո, կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է, քանի դեռ դրան որևէ այլ բան չավելացնեք, ինչը կթուլացնի այն և կնվազեցնի կոնցենտրացիան, բայց դեռևս կլինի: 200 մգ ԴՆԹ):

Ի վերջո, եթե դուք ուզում եք 200 մգ ԴՆԹ-ի չափաբաժիններ @ 1 մգ/ուլ, դուք պարզապես պետք է բաժանեք ձեր 1 մգ/ուլ ԴՆԹ-ն (նոսրացված, ինչպես նկարագրված է վերևում) 200 մգ չափաբաժինների:

գրեթե մի բժիշկ 2009 թվականի ապրիլի 16-ին, առավոտյան 06ᛓ-ին ասաց.

actin_crazy 2009 թվականի ապրիլի 16-ին, 03ᛁ-ին ասաց.

Ես առանձնացրել և սպեցիֆիկացրել եմ իմ պլազմիդային ԴՆԹ-ն և ստացել եմ 6,645 մգ/ուլ կոնցենտրացիան: Իմ լաբորատորիան սիրում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի չափաբաժինը 200 մգ ԴՆԹ-ի չափով, և ես պետք է նոսրացնեմ պլազմիդի ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան մինչև 1 մգ/ուլ: Ինչպե՞ս կարող եմ դա անել: Ես ունեմ ընդհանուր ծավալը 98 ուլ, և այս կաղապարով, որը մենք օգտագործում ենք, ասում է, որ օգտագործեք 30,10 ուլ 200 ug-ի համար: Բայց այս կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է:


Որպեսզի ձեր ԴՆԹ-ն ունենա 1 մգ/ուլ կոնցենտրացիա, դուք պետք է այն նոսրացնեք 6,645 անգամ (այսինքն՝ ավելացնեք 6,645 անգամ, քան արդեն ունեք):

Սա հաշվարկելու այլ եղանակ է. C1V1=C2V2
որտեղ C1-ը ձեր սկզբնական կոնցենտրացիան է (6,645 մգ/ուլ), V1 ձեր սկզբնական ծավալը (98 մլ), C2 ձեր վերջնական կոնցենտրացիան (1 մգ/ուլ) և V2 վերջնական ծավալը, որն անհրաժեշտ է այս դեպքում.
V2=6.645*98/1= 651.21 ուլտր, այնպես որ դուք պետք է ավելացնեք 553.21 մլ այն ամենից, ինչում ձեր ԴՆԹ-ն նոսրացված է, ձեր 98 մլ-ին:

Ձեր մյուս հարցին, ձեր 6,645 մգ/ուլ 30,1 ուլտրը կպարունակի 200 մգ (այո, կոնցենտրացիան դեռևս 6,645 մգ/ուլ է, քանի դեռ դրան որևէ այլ բան չավելացնեք, ինչը կթուլացնի այն և կնվազեցնի կոնցենտրացիան, բայց դեռևս կլինի 200 մգ ԴՆԹ):

Ի վերջո, եթե դուք ուզում եք 200 մգ ԴՆԹ-ի չափաբաժիններ @ 1 մգ/ուլ, դուք պարզապես պետք է բաժանեք ձեր 1 մգ/ուլ ԴՆԹ-ն (նոսրացված, ինչպես նկարագրված է վերևում) 200 մգ չափաբաժինների:

Շնորհակալություն պատասխանների համար։ Ես փորձեցի նոսրացնել և տարանջատել՝ օգտագործելով վերը նկարագրված մեթոդը, սակայն ես նախանշեցի իմ 200 մլ չափաբաժինը և ստացա 1 մգ/ուլ-ից պակաս կոնցենտրացիան:

արդյո՞ք ձեր պիպետները պատշաճ չափորոշված ​​են:

պիպետները և սպեկտրոֆոտոմետրերը ճշգրիտ են +/- որոշ սխալ:

mdfenko 2009 թվականի ապրիլի 17-ին, առավոտյան 11ᛔ-ին ասաց.

արդյո՞ք ձեր պիպետները պատշաճ չափորոշված ​​են:

պիպետները և սպեկտրոֆոտոմետրերը ճշգրիտ են +/- որոշակի սխալ:

Որքան գիտեմ։ Իմ պիպետները բոլորովին նոր են, և սպեկտրոֆոտոմետրը, որը ես օգտագործում եմ, սովորական է, որն օգտագործվում է բոլորի կողմից հատակին:


Խնդրում եմ մի քանի խորհուրդ Maxiprep-ի համար. (մայիս/11/2006)

Ես անում եմ Maxi-Prep և հասել եմ միայն մեկ իսկապես հաջողակ: Իմ մնացած փորձերը իսկապես լավ չեն եղել, անկեղծ ասած:

Հետաքրքիր է, կարո՞ղ է որևէ մեկը պատասխանել հաջորդ հարցերին և նաև ինձ մի քանի խորհուրդ տալ, բացի նրանցից, որոնք տրված են Quiagen-ի անսարքությունների վերացման ուղեցույցում (ես փորձել եմ դրանցից մի քանիսը):

Նախ, որքա՞ն գումար եք սովորաբար ստանում MaxiPrep-ի ժամանակ (100 մլ լբ-ի համար, նախկինում): (ug)

Երկրորդը, ես մեկ այլ տեղ կարդացի, որ ոմանք միշտ ավելացնում են քլորամֆենիկոլ, անկախ նրանից, թե որ պլազմիդն են ուժեղացնում:

Որքա՞ն բակտերիաների OD եք հասնում մինչև սյունակի ընթացակարգը սկսելը: (Ես հավատում եմ, որ չեմ հասնում սարահարթի փուլին)

Ի՞նչ եք կարծում, որևէ խնդիր կա, եթե ձեր արդեն փոխակերպված բակտերիաները ապասառեցնելիս դրանք մի քանիսն ուղղակիորեն լցնեք LB միջավայրում (հակաբիոտիկով)՝ առանց ափսե օգտագործելու:

Դուք օգտագործում եք պոլիպրոպիլային խողովակներ MaxiPrep անելու համար: Կա՞ն ավելի հարմար այլ տեսակի խողովակներ:

Խնդրում եմ ինձ ավելի շատ առաջարկներ տվեք:

Նախ, որքա՞ն գումար եք սովորաբար ստանում MaxiPrep-ի ժամանակ (100 մլ լբ-ի համար, նախկինում): (ug)
--> ցածր պատճենված պլազմիդների համար՝ մինչև 200 մլ, բարձր պատճենահանման պլազմիդների համար՝ 50 մլ

Երկրորդը, ես մեկ այլ տեղ կարդացի, որ ոմանք միշտ ավելացնում են քլորամֆենիկոլ, անկախ նրանից, թե որ պլազմիդն են ուժեղացնում:
--> ցածր կրկնօրինակման պլազմիդների համար անհրաժեշտ է ավելի մեծ քանակությամբ բակտերիաներ: Դա կարող է առաջացնել ՌՆԹ-ի աղտոտում ձեր նախապատրաստման մեջ՝ ավելի շատ բակտերիաներից ստացվող քանակից ազատվելու դժվարությունների պատճառով: Ահա թե ինչու մարդիկ կարող են ավելացնել քլորամֆենիկոլ՝ III տառադարձումից ազատվելու համար: Բակտերիաները դադարում են աճել և միայն կրկնօրինակում են պլազմիդները, որպեսզի լինեն ընդհանուր գծերի մեջ: Դա հանգեցնում է ՌՆԹ-ի քանակի կրճատմանը, առանց կորցնելու մեծ մշակույթի օգուտները

Որքա՞ն բակտերիաների OD եք հասնում մինչև սյունակի ընթացակարգը սկսելը: (Ես հավատում եմ, որ չեմ հասնում սարահարթի փուլին)
Բարև, կատարեք 12-16 ժամ մշակույթ 37°-ում

Ի՞նչ եք կարծում, որևէ խնդիր կա, եթե ձեր արդեն փոխակերպված բակտերիաները ապասառեցնելիս դրանք մի քանիսն ուղղակիորեն լցնեք LB միջավայրում (հակաբիոտիկով)՝ առանց ափսե օգտագործելու:
Ես միշտ փորձում եմ ափսե պատրաստել: Բայց ես միշտ չեմ ափսեում (բայց այս դեպքում դա խնդիր չի առաջացնող պլազմիդների համար է)

Դուք օգտագործում եք պոլիպրոպիլային խողովակներ MaxiPrep անելու համար: Կա՞ն ավելի հարմար այլ տեսակի խողովակներ:
Ես գաղափար չունեմ իմ խողովակների կազմի վերաբերյալ: Բայց ես կարծում եմ, որ դա այդպես է: Բազեն են։

Ես սովորաբար աճեցնում եմ մաքսի պատրաստման համար 250 մլ կամ 500 մլ: 500 մլ, մինչև 1 մգ ԴՆԹ:

Բարձր պատճենված պլազմիդների դեպքում 100 մլ-ից կարող եք ստանալ ավելի քան 600 մգ:

Ես երբեք չեմ ստուգում OD-ը: Ես ունեմ իմ miniprep մշակույթը 4C-ում և օգտագործում եմ 100uL մաքսին պատվաստելու համար:

Եթե ​​ձեր բակտերիաները չեն աճում, առավոտյան սկսեք 5 մլ կուլտուրա մեկ գաղութից, այնուհետև աճեցրեք այն 9-12 ժամ, այնուհետև օգտագործեք այն մաքսի պատվաստման համար:

Ես վստահ չեմ խողովակների նյութին: Կարծում եմ, որ դա մեծ նշանակություն չպետք է ունենա:

Ես կատարում եմ Maxi-ի պատրաստում HEK293E-ի տրանսֆեկցիայի համար, որն աճեցվել է կախոցի մեջ:

Ես սովորաբար հասնում եմ 850 մկգ-ից մինչև 1 մգ/մլ (մլ TE-ով ողողելով): Սա բավարար է մեկ լիտր HEK293E պոլիէթիլենիմինով փոխակերպելու համար:

Ինչպիսի՞ բերքատվություն եք տեսնում:

Ես նախկինում օգտագործել եմ Qiagen maxipreps-ը և պարզել եմ, որ տեղումներից և ցենտրիֆուգումից հետո գնդիկը կարող է հեշտությամբ կորցնել: Decanting-ը վատ գաղափար է, և նույնիսկ պիպետտի ծայրի օգտագործումը կարող է խնդիր լինել, քանի որ կարկուտը մանր կտորների է բաժանվում կտրող ներծծման պատճառով: Դուք պետք է շատ զգույշ լինեք և հեռացնեք վերին նյութը գնդիկի նվազագույն խախտմամբ: Այլապես, իզոպրոպանոլով տեղումներ կատարելու փոխարեն, գուցե կատարեք էթանոլային տեղումներ: Գնդիկն ավելի հեշտ է տեսնել և ավելի կոմպակտ:
Ես հակված եմ նստեցնել իզոպրոպանոլով և այնուհետև լուծույթը տեղադրել 15 էպենդորֆյան խողովակների մեջ: Սա հեշտացնում է կարկուտը տեսնելը և դրանով իսկ կանխելով դրա կորուստը: Ես պտտում եմ, լվանում և չորացնում եմ գնդիկները, այնուհետև նորից կախում եմ գնդիկը ջրի մեջ՝ խողովակից խողովակ տեղափոխելով՝ լուծույթը խտացնելու համար:

Ես կատարում եմ Maxi պատրաստում HEK293E-ի տրանսֆեկցիայի համար, որն աճեցված է կախոցի մեջ:

Ես սովորաբար հասնում եմ 850 մկգ-ից մինչև 1 մգ/մլ (մլ TE-ով ողողելով): Սա բավարար է մեկ լիտր HEK293E պոլիէթիլենիմինով փոխակերպելու համար:

Ինչպիսի՞ բերքատվություն եք տեսնում:

Զարմանալի է! Թեև Maxiprep-ը մինչև 500 մգ էր, համենայն դեպս այդպես է ասված ձեռնարկում: Որքա՞ն եմ ես ստանում: Իմ լավագույն փորձով, միայն

250 մգ (և ես գոհ էի դրանով, մինչև չբացահայտեցի, թե որքան աղքատ է այն): Ես սկսում եմ հավատալ, որ անհույս եմ: :-(

Ուրիշ բան, որ մոռացել էի հարցնել, և ինձ համար կարևոր է իմանալ, սա է. Ես ենթադրում էի, որ դա բարձր պատճեն է, բայց ես կարող եմ սխալվել: Ես չեմ կարողացել գտնել այս տեղեկատվությունը ցանցում: Որևէ մեկը գիտի՞:

ML1975-ի մասին ես համարում եմ իսկապես լավ մոտեցում, ավելի շատ ժամանակատար, բայց հավանաբար ավելի հավանական է, որ հաջողակ լինի:

Scolix-ի մասին, խորհուրդ կտա՞ք ինձ փորձել աճեցնել իմ պլազմիդը ավելի միջավայրում: Ես օգտագործում եմ ընդամենը 100 մլ 12-16 ժամ, ինչպես ճիշտ է ասել Ֆրեդը։ «Ես իմ մինի պատրաստուկների կուլտուրան ունեմ 4C ջերմաստիճանում և օգտագործում եմ 100 մլ մաքսին պատվաստելու համար»: Դուք նկատի ունեք փոխակերպված բակտերիաները մինի պատրաստուկից: Քանի՞ ժամ եք թողնում, որ դրանք աճեն մինչև 4C ջերմաստիճանում պահելը: Որքա՞ն ժամանակ եք դրանք պահում 4C ջերմաստիճանում:

Մի վերջին բան. Ես արել եմ համապատասխան վերլուծական գելեր, և ես հավատում եմ, որ իմ խնդիրը առաջին մասում է, հենց այն ժամանակ, երբ դուք ունեք ձեր մշակույթի աճը, այնուհետև դուք ավելացնում եք սյունակում և ցենտրիֆուգում (ես հավաքում եմ իմ առաջին նմուշը այս վերին նյութից): Այդ պահին իմ ժապավենը գելի մեջ բավականին թույլ է: Չեմ կարծում, որ դա լիզի քայլ է, քանի որ այս նոր լիզի կապույտ ռեագենտով ամեն ինչ էլ ավելի հեշտ է դառնում:

Կներեք այսքան հարցերի համար։ Եվ բոլորիցդ շատ շնորհակալ եմ։

Ես անում եմ Maxi-Prep և հասել եմ միայն մեկ իսկապես հաջողակ: Իմ մնացած փորձերը իսկապես լավ չեն եղել, անկեղծ ասած:

Հետաքրքիր է, կարո՞ղ է որևէ մեկը պատասխանել հաջորդ հարցերին և նաև ինձ մի քանի խորհուրդներ տալ, բացի նրանցից, որոնք տրված են Quiagen-ի անսարքությունների վերացման ուղեցույցում (ես փորձել եմ դրանցից մի քանիսը):

Նախ, որքա՞ն գումար եք սովորաբար ստանում MaxiPrep-ի ժամանակ (100 մլ լբ-ի համար, նախկինում): (ug)

Երկրորդը, ես մեկ այլ տեղ կարդացի, որ ոմանք միշտ ավելացնում են քլորամֆենիկոլ, անկախ նրանից, թե որ պլազմիդն են ուժեղացնում:

Որքա՞ն բակտերիաների OD եք հասնում մինչև սյունակի ընթացակարգը սկսելը: (Ես հավատում եմ, որ չեմ հասնում սարահարթի փուլին)

Ի՞նչ եք կարծում, որևէ խնդիր կա, եթե ձեր արդեն փոխակերպված բակտերիաները ապասառեցնելիս դրանք մի քանիսն ուղղակիորեն լցնեք LB միջավայրում (հակաբիոտիկով)՝ առանց ափսե օգտագործելու:

Դուք օգտագործում եք Polypropile խողովակներ MaxiPrep անելու համար: Կա՞ն ավելի հարմար այլ տեսակի խողովակներ:

Խնդրում եմ ինձ ավելի շատ առաջարկներ տվեք:

նախ ես համաձայն եմ ML1975-ի հետ: երբեմն գնդիկը հեշտությամբ կորչում է, այնպես որ դուք պետք է շատ զգույշ լինեք SN-ը հեռացնելիս: նշեք գնդիկը խողովակից դուրս և դիտեք, թե երբ եք արտանետում վերին նյութը
Մեկ այլ կետ. երբ ես անում եմ իմ առաջին պատրաստումը, ես ունեմ նույնքան քիչ քանակությամբ ԴՆԹ, թեև ես օգտագործել էի բարձր պատճենված պլազմիդ, բայց իրավասու բջիջները փոխելուց հետո իմ նախապատրաստումը շատ հաջող էր: գուցե պահպանման ժամկետը ք. բջիջները երկար են կամ (ինչպես իմ դեպքում) փորձեք մեկ այլ բակտերիալ շտամ c.c-ի համար:
հաջողություն!
flausch

Մի անհանգստացեք, որ ցածր եկամտաբերություն եք ստանում: 1մգ ստանալու համար ես պետք է օգտագործեմ 500մլ կուլտուրա: Այնպես որ, մի անհանգստացեք: Եթե ​​ձեզ ավելի շատ ԴՆԹ է անհրաժեշտ, ապա աճեցրեք այն ավելի միջավայրում: Եվ նաև, ինչպես ես գրել եմ նախկինում, սկսեք 5 մլ մշակույթը և աճեք օրվա ընթացքում, այնուհետև օգտագործեք 5 մլ մշակույթը 500 մլ պատվաստելու համար:

Ես չգիտեմ, արդյոք pMEM-ը ցածր պատճենի պլազմիդ է, թե բարձր պատճեն:

Ես աճեցնում եմ մինի պատրաստուկներ 14-16 ժամ: Եվ ես օգտագործում եմ դրա մեծ մասը՝ ստուգելու համար, թե արդյոք կլոնավորումը ճիշտ է անցել: Իսկ մնացածը պահեք 4C ջերմաստիճանում: Ես չէի օգտագործի մեկ շաբաթից ավելի հին բան 4C-ում: Ավելի լավ կլիներ ԴՆԹ-ն վերափոխել մինիպրեպից (հաստատված է սահմանափակմամբ) և օգտագործել մեկ գաղութ՝ մաքսի աճեցնելու համար:

""Մի վերջին բան. Ես արել եմ համապատասխան վերլուծական գելեր, և ես հավատում եմ, որ իմ խնդիրն առաջին մասում է, հենց այն ժամանակ, երբ դուք ունեք ձեր մշակույթի աճը, այնուհետև դուք ավելացնում եք սյունակում և ցենտրիֆուգում (ես հավաքում եմ իմ առաջին նմուշը այս վերին նյութից): Այդ պահին իմ ժապավենը գելի մեջ բավականին թույլ է: Չեմ կարծում, որ դա լիզի քայլ է, քանի որ այս նոր լիզի կապույտ ռեագենտով ամեն ինչ ավելի հեշտացնում է: ""

Ես քեզ այստեղ չեմ հասկանում: Խնդրում եմ բացատրեք։

Մի անհանգստացեք վերջին մասի համար, դուք արդեն ինձ պատկերացում եք տվել այդ 500 մլ մշակույթի մասին: Դա առաջին բաներից մեկն է, որ ես կփորձեմ:

Ես նոր եմ սկսել կատարել այս բոլոր կլոնավորման տեխնիկան և երբեք չեմ փորձել սահմանափակող մարսողություն (կարծում եմ, շատ դեպքերում պետք է հեշտ լինի): Փոխարենը ես օգտագործում եմ PCR հատուկ պրայմերների հետ, արդյոք սա հավասարապես վավեր է, որ սահմանափակող մարսողությունը: Ո՞րն է սահմանափակող մարսողության հիմնական առավելությունը: Ժամանակ խնայե՞լ: Արժե՞ք

Որևէ մեկը գիտի pMEM-ի մասին, եթե այն ցածր կամ բարձր պատճենված պլազմիդի է: Կամ որտեղի՞ց կարող էի գտնել նման տեղեկություն։

Ես փորձեցի սա և հաջող չէր: Որքա՞ն բակտերիաներ եք ստանում: Որքա՞ն P1, P2 և P3 եք օգտագործում այդ դեպքում: Քանի որ երբ ես փորձեցի MaxiPrep-ի համար նախատեսված կրկնակի քանակով, ես ստացա շատ մածուցիկ լուծույթ (P1 և P2), և ես չկարողացա ազատվել բոլոր կուտակումներից:

Արձանագրության մեջ նրանք խորհուրդ են տալիս ձեզ կրկնակի ցենտրիֆիկացնել P1, P2 և P3 խառնուրդը և վերցնել պլազմիդ պարունակող ստացված գերնույն նյութի մասնաբաժինը անալիտիկ գել գործարկելու համար: Ես դա արեցի և իմ գելի մեջ ընդհանրապես ոչինչ չստացա: Այսպիսով, ես կարծում եմ, որ իմ խնդիրն այն է, որ հուշում որևէ բան ավելացնելուց առաջ է, երբ ես ստանում եմ իմ գնդիկը և խառնվում եմ P1, P2 և P3-ի հետ (դրանք պարունակում են նոր lysis կապույտ):

Իրավասու բջիջների մասին երկու պլազմիդներն օգտագործում էին իրավասու բջիջների նույն խմբաքանակը, նույն օրը: Առաջինը լավ էր (250 մգ), իսկ մյուսը ընդամենը 45 մգ:

Առաջին անգամ, երբ փորձեցի, լավ արդյունք ստացա (ինձ համար, որովհետև դա ընդամենը 250 մգ էր): Բայց այս պլազմիդի հետ ես այս պահին շատ եմ կորցրել: Որևէ մեկը կարող է ինձ բացատրել, թե ինչ եմ ես սխալ անում:


Խիստ արձագանք. Դրոզոֆիլայում?

Եթե ​​դուք մանրէ եք եղել, ապա պետք է պատրաստվեք դժվարությունների՝ սննդի պակասի, ջերմաստիճանի փոփոխության և այլն։ Եվ երբ դժվարությունը գալիս է, դուք պետք է համապատասխան արձագանքեք: Խիստ արձագանքման համակարգն անում է հենց դա. այն միավորում է մի քանի ներածման աղբյուրներ (ամինաթթուների, ճարպերի և ածխածնի սահմանափակում, ջերմաստիճանի բարձրացում) և փոխում է լարոնի մոլեկուլի կոնցենտրացիան ppGpp (ՀՆԱ-ն՝ 2 հավելյալ ֆոսֆատներով, որոնք կցված են շաքարի մասին):

ppGpp-ն իր հերթին կարգավորում է ամեն ինչ՝ տառադարձում, թարգմանություն, կրկնօրինակում։ Հետևաբար, անհրաժեշտ է շատ ճշգրիտ վերահսկել ppGpp մակարդակը, և այդ նպատակով բակտերիաները ունեն սպիտակուցներ, որոնք արտադրում են ppGpp (RelA), (հիմնականում) քայքայում են այն (SpoT) և անում են երկուսն էլ (Rel): Այս բոլոր սպիտակուցները միասին կոչվում են RelA-SpoT հոմոլոգներ (RSH):

Այս ամենը մանրէների մեջ է։ իսկ էուկարիոտների մասին? Դե, օրգանելներն ունեն RSH, որոնցից ոմանք բավականին յուրահատուկ են ազդանշանների առումով, որոնց արձագանքում են, օրինակ՝ Ca++ զգայուն OsCRSH1 RSH քլորոպլաստներից: Բայց ինչ վերաբերում է ցիտոզոլային սպիտակուցներին:

Հենց դա է հայտնաբերվել 2010 թվականին՝ ցիտոզոլային RSH Mesh1 դրոզոֆիլայում: Այն փոքր պրոտեին է, որն ունակ է միայն ppGpp հիդրոլիզին, ինչը նա հատուկ է անում. փորձարկված տարբեր նուկլեոտիդներից վերցնում է միայն այս նուկլեոտիդը: Նոկ-աութն ունի ուժեղ և հատուկ ֆենոտիպ, ինչը հուշում է, որ Mesh1-ը կարևոր և ֆունկցիոնալ է: Ավելին, Mesh1-ը կարող է փոխարինել SpoT-ին բակտերիաներում: Սպիտակուցի ռենտգենյան կառուցվածքը լուծվեց, ուստի հոդվածն անցավ Nature Structural Biology-ին:

Այստեղ մեծ հարցն այն է, թե ինչպես է Mech1-ը հայտնվել էուկարիոտների մեջ և ինչու է այն պահպանվում այնտեղ: Ինչպե՞ս կարող եք բակտերիաներից էուկարիոտներին փոխանցել այնպիսի բարդ համակարգը, ինչպիսին է խիստ արձագանքը:

RSH սպիտակուցներով կարելի է ոչ միայն ունենալ ppGpp արտադրող, այս դեպքում դուք արտադրում եք ppGpp, այն կուտակվում է, և սխալը մահանում է: Հետևաբար, սովորաբար սխալներն ունեն Rel. այն և՛ ստեղծում է, և՛ քայքայում է ppGpp, այնպես որ ամբողջ համակարգը գտնվում է մեկ սպիտակուցի մեջ: Mesh1-ը քայքայում է ppGpp-ն, և մինչ այժմ էուկարիոտներում սինթեզի ընդունակ ցիտոզոլային RSH չի հայտնաբերվել: Այսպիսով, ինչ է անում Mesh1-ը: ինչ դա ստորացուցիչ է?

Հնարավոր է, որ կա ppGpp արտադրող սպիտակուց, որը հոմոլոգ չէ RSH-ին, և սա ppGpp-ի աղբյուրն է, որը Mesh1-ը քայքայվում է: Այնուամենայնիվ, ամինաթթուների պակասի ժամանակ ppGpp-ն հայտնաբերելու փորձերը միշտ անհաջող էին: Այսպիսով, դա կարող է լինել, որ Mesh1-ն իրականում այլ բան է անում, քան ppGpp հիդրոլիզը:

Sun D, ​​Lee G, Lee JH, Kim HY, Rhee HW, Park SY, Kim KJ, Kim Y, Kim BY, Hong JI, Park C, Choy HE, Kim JH, Jeon YH, & Chung J (2010): SpoT-ի մետազոական օրթոլոգը հիդրոլիզացնում է ppGpp-ն և գործում է սովի արձագանքներում: Բնության կառուցվածքային և մոլեկուլային կենսաբանություն, 17 (10), 1188-94 PMID՝ 20818390

Mitkevich VA, Ermakov A, Kulikova AA, Tankov S, Shyp V, Soosaar A, Tenson T, Makarov AA, Ehrenberg M, & Hauryliuk V (2010): ppGpp-ի միացման թերմոդինամիկական բնութագրումը EF-G-ին կամ IF2-ին և նախաձեռնող tRNA-ի միացմանը ազատ IF2-ին GDP-ի, GTP-ի կամ ppGpp-ի առկայության դեպքում: Մոլեկուլային կենսաբանության ամսագիր, 402 (5), 838-46 PMID՝ 20713063

Maciag M, Kochanowska M, Lyzeń R, Wegrzyn G, & Szalewska-Pałasz A (2010): ppGpp-ն արգելակում է Escherichia coli DnaG պրիմազի ակտիվությունը: Պլազմիդ, 63 (1), 61-7 PMID՝ 19945481

Gralla JD (2005): Escherichia coli ռիբոսոմային ՌՆԹ-ի տրանսկրիպցիա. ppGpp-ի, NTP-ների, ճարտարապետական ​​սպիտակուցների և պոլիմերազային կապող սպիտակուցի կարգավորիչ դերերը: Մոլեկուլային մանրէաբանություն, 55 (4), 973-7 PMID՝ 15686546

Pollard JW, Lam T, & Stanners CP (1980): Կաթնասունների բջիջները խիստ արձագանք չունեն: Բջջային ֆիզիոլոգիայի ամսագիր, 105 (2), 313-25 PMID: 7462330

Buckstein MH, He J, & Rubin H (2008): Նուկլեոտիդային լողավազանների բնութագրումը որպես ֆիզիոլոգիական վիճակի ֆունկցիա Escherichia coli-ում: Մանրէաբանության հանդես, 190 (2), 718-26 PMID՝ 17965154


Վերանայում

Ներածություն

Կայուն պահպանումը ընդունող բջիջներում ամենակարևոր գործընթացն է ցանկացած բակտերիալ պլազմիդի համար: Դրան հասնելու համար տարբեր պլազմիդների կողմից օգտագործվում են տարբեր մեխանիզմներ: Նախ, պլազմիդները պետք է այնքան հաճախ կրկնօրինակվեն, որպեսզի արտադրեն իրենց կրկնօրինակները այն քանակությամբ, որը թույլ կտա նրանց բաշխումը երկու դուստր բջիջներին մայր բջիջի բաժանումից հետո: Մյուս կողմից, բջիջների մահվան տանող հյուրընկալողի էներգետիկ հյուծումը կանխելու համար պլազմիդի վերարտադրության հաճախականությունը չպետք է չափազանց բարձր լինի: Երկրորդ, կրկնօրինակման փուլից հետո դուստր պլազմիդի մոլեկուլները պետք է արդյունավետորեն բաժանվեն: Երրորդ, պլազմիդից զուրկ բջիջների առաջացումը բակտերիաների պոպուլյացիայի մեջ, որոնք ի սկզբանե պլազմիդներ էին կրում, լուրջ թերություն է այս արտաքրոմոսոմային գենետիկական տարրերի տեսանկյունից, քանի որ պլազմիդներից զուրկ բջիջները սովորաբար ավելի արագ են աճում, քան այդպիսի «լրացուցիչ» մոլեկուլներ կրողները: Այսպիսով, առանց պլազմիդային բջիջները կհաղթեն պլազմիդներ պարունակող բակտերիաների հետ մրցակցության մեջ՝ շրջակա միջավայրի ճնշման բացակայության դեպքում, որոնք նպաստում են պլազմիդային ԴՆԹ կրող բջիջներին: Հետևաբար, որոշ պլազմիդներ մշակել են դրանք կորցրած բակտերիաների ոչնչացման մեխանիզմներ:

Պլազմիդային ռեպլիկոնների գենետիկական կառուցվածքները, տարբեր պլազմիդների վերարտադրության մեկնարկի կենսաքիմիան, պլազմիդային մոլեկուլների բաժանման մեխանիզմները և բակտերիաների բջջային գծերում պլազմիդի կայունության հետընտրական կարգավորման գործընթացները վերջերս վերանայվել են մի քանի հիանալի հոդվածներում [1-7]: Հետևաբար, այս խնդիրները մանրամասնորեն չեն քննարկվի այս վերանայման մեջ: Այստեղ մենք կենտրոնանում ենք պլազմիդի վերարտադրության կարգավորման վրա՝ ի պատասխան տարբեր բջջային սթրեսների: Որպես մոդել՝ մենք ընտրել ենք բակտերիոֆագ λ-ից ստացված պլազմիդներ, որոնք կոչվում են λ պլազմիդներ։ Վերջերս հրապարակված արդյունքները նոր տվյալներ են տվել, որոնք թույլ են տալիս մեզ ավելի լավ հասկանալ այս պլազմիդների վերարտադրությունը շրջակա միջավայրի տարբեր պայմաններում աճող բջիջներում: Ավելին, կքննարկվեն որոշ այլ վերջին ուսումնասիրություններ այս տեսակի կարգավորման վերաբերյալ այլ պլազմիդային ռեպլիկոններում:

Λ պլազմիդներ

Բակտերիոֆագը λ բարեխառն վիրուս է, որը վարակում է Էշերիխիա կոլի բջիջները. Այս ֆագը վճռորոշ դեր է խաղացել մոլեկուլային կենսաբանության զարգացման մեջ և դեռևս չափազանց օգտակար մոդել է հիմնական բջջային ֆունկցիաների կարգավորման մոլեկուլային մեխանիզմների ուսումնասիրության մեջ՝ ծառայելով որպես պարադիգմ բազմաթիվ ընդհանուր կենսաբանական գործընթացների համար [8-11]: Ավելին, գենետիկորեն ձևափոխված λ ֆագերը և նրանց գենոմի բեկորները լայնորեն կիրառվող գործիքներ են գենային ճարտարագիտության և կենսատեխնոլոգիայի մեջ [12–17]:

Տիպիկ λ պլազմիդը բաղկացած է բակտերիոֆագի λ գենոմի մի հատվածից, որը պարունակում է բոլոր գեները և կարգավորող հաջորդականությունները, որոնք անհրաժեշտ են դրա վերարտադրությունը սկսելու համար: E. coli. Այս տեսակի առաջին պլազմիդները մեկուսացվել են որպես բակտերիոֆագի λ գենոմի ածանցյալներ, որոնք արտադրվել են in vivo ռեկոմբինացիոն իրադարձություններ [18]: Ներկայումս նման պլազմիդները կառուցվում են գենետիկական ինժեներիայի մեթոդներով և հաճախ պարունակում են, բացի λ վերարտադրության շրջանից, գենետիկական մարկեր, օրինակ. հակաբիոտիկների նկատմամբ կայուն գեն: Քանի որ λ պլազմիդների կառուցվածքը, λ վերարտադրության գեների հիմնական գործառույթները և վերարտադրության մեկնարկի մեխանիզմը օրի λ վերանայվել են վերջերս [19-22], այս հոդվածում մենք տրամադրում ենք միայն հիմնական տեղեկատվություն λ ԴՆԹ-ի վերարտադրության մեկնարկի մասին, որն անհրաժեշտ է տարբեր սթրեսային պայմաններում գործող կարգավորիչ մեխանիզմները հասկանալու համար:

λ պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը սկսվում է ժ օրի λ շրջան, որը գտնվում է կեսին Օ գեն (նկ. 1): Այս գենը ծածկագրում է վերարտադրության նախաձեռնող սպիտակուցը, որը կապվում է վերարտադրության սկզբնավորման հետ՝ ձևավորելով «O-some» կոչվող նուկլեոպրոտեինի կառուցվածքը: Հյուրընկալողի կողմից կոդավորված DnaB հելիկազան առաքվում է O-ոմանք մեկ այլ λ վերարտադրվող սպիտակուցի միջոցով՝ Պ գենային արտադրանք. Այն օրի λ-O-P-DnaB կառուցվածքը, որը կոչվում է «նախապրիմոսոմ», կայուն է, բայց ոչ ակտիվ ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը խթանելու համար, քանի որ P և DnaB սպիտակուցների միջև ուժեղ փոխազդեցությունները կանխում են վերջին բաղադրիչի հելիկազի ակտիվությունը: Ջերմային շոկի սպիտակուցների՝ DnaK, DnaJ և GrpE գործողությունները անհրաժեշտ են DnaB-ն P-ի միջնորդավորված արգելակումից ազատելու համար, թեև P սպիտակուցը կարծես դեռ առկա է համալիրում: Վերջին ուսումնասիրությունները (տես հաջորդ գլուխը) ցույց են տալիս, որ DnaK-ը նույնպես կապված է օրի λ-O-P-DnaB համալիր. Շապերոնից կախված նախապրիմոսոմային վերափոխման գործընթացը զուգորդվում է տրանսկրիպցիոն ակտիվացման հետ: օրի λ, վերարտադրության մեջ շարունակվող տառադարձություն ծագում շրջան։ -ի տառադարձային ակտիվացում ծագում անհրաժեշտ է λ ԴՆԹ-ի վերարտադրության արդյունավետ մեկնարկի համար in vivo նույնիսկ եթե վերարտադրման բոլոր սպիտակուցներն ապահովված են: Թվում է, որ տրանսկրիպցիայի ընթացքում ՌՆԹ պոլիմերազի շարժման հետևանքով առաջացած ԴՆԹ տոպոլոգիայի փոփոխությունները վճռորոշ դեր են խաղում վերարտադրության մեկնարկի խթանման գործում: լ էջՌ պրոմոուտերը տրանսկրիպցիայի բնական մեկնարկային տեղամաս է, որը արտադրում է mRNA λ-ի վերարտադրության սպիտակուցների (O և P) սինթեզի համար և ակտիվացնում է օրի լ. λ ԴՆԹ-ի վերարտադրության մեկնարկի վերջին քայլը ԴՆԹ-ի պոլիմերազ III հոլոֆերմենտի և հարակից վերարտադրվող սպիտակուցների (ԴՆԹ գիրազա, SSB և այլն) կապումն է հյուրընկալողի կողմից կոդավորված: օրի λ շրջան.

Բակտերիոֆագի λ գենոմի վերարտադրման շրջան և վերարտադրման համալիրի հավաքում: Նշված են վերարտադրության տարածաշրջանում առկա գեները, խթանողներն ու տերմինատորները: Սղագրությունները ներկայացված են սլաքներով: Սխեման գծված չէ մասշտաբով: Մանրամասների համար տե՛ս տեքստը:

Λ պլազմիդների վերարտադրությունը ամինաթթուներով քաղցած բջիջներում

Ամինաթթուների քաղցը առաջացնում է բակտերիալ բջիջների հատուկ արձագանք, որը կոչվում է խիստ արձագանք [23]: Այս պայմաններում արտադրանքը relA գենն ակտիվանում է հատուկ ազդանշանային նուկլեոտիդներ արտադրելու համար՝ գուանոզին 5'-տրիֆոսֆատ-3'դիֆոսֆատ (pppGpp) և գուանոզին 5'-դիֆոսֆատ-3'-դիֆոսֆատ (ppGpp): Այս նուկլեոտիդները փոխազդում են ՌՆԹ պոլիմերազի հետ՝ առաջացնելով տարբեր պրոմոդերներից տրանսկրիպցիայի արդյունավետության կտրուկ փոփոխություններ: Կայուն ՌՆԹ-ների սինթեզի խթանիչները (p)ppGpp-ի նկատմամբ առավել զգայուն խթանողներն են: Որոշ պրոմոութերներ չեն ազդում այս նուկլետիդի կողմից, մինչդեռ մյուս պրոմոութերները կարող են կա՛մ արգելակվել, կա՛մ խթանվել ամինաթթուներից քաղցած վայրի տիպի բակտերիաներում [23]:

լէջՌ Պարզվել է, որ պրոմոուտերը բացասաբար է կարգավորվում ppGpp-ով [24–26]: -ի գործունեության նվազում էջՌ հանգեցնում է տրանսկրիպցիոն ակտիվացման խանգարմանը օրի λ և λ պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերարտադրության արգելակում: Նման կարգավորումը տրամաբանական է, քանի որ կարելի է պատկերացնել, որ էներգիայի մեծ սպառում պահանջող գործընթացների արգելակումը (ինչպես ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը) պետք է առավելություն լինի սովից վտանգված հյուրընկալ բջիջի համար:

Հետաքրքիր է, E. coli մուտանտներ են relA գենը, որը թերի է (p)ppGpp-ի արտադրության մեջ ամինաթթուով քաղցած բջիջներում (բակտերիաների նման արձագանքը ամինաթթվային քաղցին կոչվում է թուլացած արձագանք), դեռ կարող է աջակցել λ պլազմիդների վերարտադրությանը [27, 28]: Այս հայտնագործությունն անսպասելի էր, քանի որ նախորդ ուսումնասիրությունները [29, 30] վճռականորեն ենթադրում էին, որ ԴՆԹ-ի վերարտադրության նախաձեռնողը` λ-կոդավորված O սպիտակուցը, չափազանց անկայուն է E. coli բջիջները. Առաջարկվում էր, որ յուրաքանչյուր կրկնօրինակումից հետո այս սպիտակուցը քայքայվում է, և անհրաժեշտ է O սպիտակուցի նոր մոլեկուլների սինթեզ՝ հետագա պլազմիդային վերարտադրության մեկնարկի համար [31]: Հետևաբար, կարելի է կանխատեսել, որ ամինաթթուներով քաղցած բջիջներում O սպիտակուցի սինթեզի արգելակումը, որը ցուցադրվել է փորձնականորեն [32], պետք է հանգեցնի վերարտադրության մեկնարկի կանխարգելմանը: օրի լ. Նման արգելակումը տեղի է ունեցել ամինաթթուներով քաղցած վայրի տիպի բջիջներում, բայց ոչ relA մուտանտներ. Հանգիստ արձագանքի ժամանակ λ պլազմիդի վերարտադրությունը մեծապես կախված է O սպիտակուցի ակտիվությունից [28, 33], ուստի վերարտադրման այս նախաձեռնողը դեռ պետք է գործի, քանի դեռ դրա սինթեզն արգելափակված է: Ավելի մանրամասն ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ O սպիտակուցը պաշտպանված է պրոտեոլիզից (կատարվում է ClpP/ClpX պրոտեազով [34, 35]) λ վերարտադրության համալիրի այլ բաղադրիչներով, որոնք ձևավորվում են օրի λ [32, 36, 37]: Նման համալիրը կայուն կառուցվածք է, որը ժառանգվում է երկու դուստր պլազմիդային ԴՆԹ-ի կրկնօրինակներից մեկի կողմից յուրաքանչյուր կրկնօրինակման փուլից հետո և կարող է գործել հետագա վերարտադրման իրադարձություններում [32, 38]:

Վերևում ամփոփված λ պլազմիդների վերարտադրության ուսումնասիրությունները ամինաթթուներով քաղցած բջիջներում հանգեցրել են այս ռեպլիկոնների վերարտադրության կարգավորման նոր մոդելի (նկ. 2): Ըստ այս մոդելի, գոյություն ունի λ պլազմիդի վերարտադրության երկու ուղի. Առաջին ուղին հիմնված է ժառանգական վերարտադրության համալիրի գործունեության վրա, որն առկա է կրկնօրինակման փուլից հետո միայն մեկ դուստր օրինակի վրա: Ժառանգական բարդույթից զուրկ պլազմիդի պատճենի վրա պետք է հավաքվի նոր վերարտադրման համալիր: Ե՛վ ժառանգական, և՛ նոր հավաքված բարդույթները պահանջում են ջերմային շոկի սպիտակուցների ակտիվություն (DnaK, DnaJ կամ դրա նույնական CbpA [39] և GrpE) և ծագման տրանսկրիպցիոն ակտիվացում՝ վերարտադրության նոր փուլ սկսելու համար (տե՛ս հղում [22]՝ մանրամասն վերանայման համար): Ժառանգական վերարտադրության համալիրներ գոյություն ունեն ինչպես վայրի տիպի բջիջներում, այնպես էլ relA մուտանտներ. Այնուամենայնիվ, ամինաթթուներով քաղցած բակտերիաներում, որոնք կարող են առաջացնել (p)ppGpp, ակտիվություն էջՌ խթանողը զգալիորեն նվազել է, ինչը հանգեցնում է անարդյունավետ տրանսկրիպցիոն ակտիվացման օրի λ և կրկնօրինակման մեկնարկի արգելակում: Մյուս կողմից, հանգիստ արձագանքման ժամանակ բարձր (p)ppGpp-ի բացակայության դեպքում կազմում է էջՌ պրոմոտորը լիովին ակտիվ է, և ժառանգական վերարտադրության համալիրի կողմից իրականացվող վերարտադրությունը կարող է շարունակվել:

λ պլազմիդի վերարտադրության երկու ուղիներ. Մեծ շրջանակները ներկայացնում են պլազմիդային ԴՆԹ մոլեկուլները: Փոքր լցված (նարնջագույն) շրջանակները ցույց են տալիս ժառանգական λ վերարտադրության բարդույթները: Մանրամասների համար տե՛ս տեքստը:

Նախորդ արդյունքները in vivo[36] և արհեստական ​​պայմաններում[40] փորձերը ենթադրեցին, որ ժառանգական λ վերարտադրման համալիրը պարունակում է O, P և DnaB սպիտակուցներ։ Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ այս համալիրը բաղկացած է այս սպիտակուցներից և DnaK սպիտակուցից բացի [41]: Ժառանգական համալիրի կողմից իրականացվող վերարտադրությունը կարող է ընթանալ ինչպես երկկողմանի, այնպես էլ միակողմանի (ձախ կամ աջ), ինչպես նոր հավաքված համալիրի կողմից իրականացվող կրկնօրինակումը [42]: Կրկնօրինակման համալիրը պատահականորեն ժառանգվում է կրկնօրինակման փուլից հետո՝ հավասար չափով, ծնողական ԴՆԹ պարունակող պատճենով լ թել կամ ծնողական r թել [43]:

Ամինաթթուներով քաղցած բջիջներում λ պլազմիդի վերարտադրության կարգավորման վերաբերյալ ուսումնասիրություններն ունեցել են նաև կենսատեխնոլոգիական հետևանքներ: Ամինաթթուների պակասը հանգեցնում է բջիջների աճի արգելակմանը: Հետևաբար, այս պայմաններում λ պլազմիդի մոլեկուլների արդյունավետ վերարտադրությունը հանգեցնում է բջիջներում պլազմիդային ԴՆԹ-ի ուժեղացմանը: Փաստորեն, λ պլազմիդների արդյունավետ ուժեղացում է նկատվել relA մուտանտներ, ինչպես ամինաթթուների սովի, այնպես էլ սահմանափակման ժամանակ [44, 45]: Քանի որ λ պլազմիդների ածանցյալները օգտագործվում են որպես կլոնավորման վեկտորներ [15, 16], դրանց ուժեղացումը կարող է օգտակար լինել կենսատեխնոլոգիական լաբորատորիաներում:

Λ պլազմիդի կրկնօրինակի թվի աճի արագությունից կախված կարգավորումը

Բակտերիաները կարող են մշակվել տարբեր միջավայրերում, որոնք ապահովում են աճի տարբեր տեմպեր: Բակտերիալ բջիջներում պլազմիդների կրկնօրինակների թիվը հիմնականում կախված է պլազմիդի վերարտադրության մեկնարկի հաճախականությունից, որը կարող է զգալիորեն տարբերվել՝ կախված բջջային աճի արագությունից: Պարզվել է, որ λ պլազմիդի կրկնօրինակի թիվն ավելի մեծ է ավելի արագ աճող բջիջներում [46]: Թվում է, որ դանդաղ աճող բջիջներում O սպիտակուցի մակարդակը սահմանափակող գործոն է վերարտադրության մեկնարկի համար օրի լ. Այս վարկածը հիմնված է փորձերի վրա, որոնք ցույց են տվել, որ դիսֆունկցիան clpP, clpX կամ այս երկու գեները (կոդավորում են O-քայքայող ClpP/ClpX պրոտեազի բաղադրիչները) լիովին վերացնում են λ պլազմիդի կրկնօրինակների քանակի տարբերությունները, որոնք նկատվում են վայրի տիպի հյուրընկալողներում, որոնք աճում են տարբեր միջավայրերում՝ աջակցելով աճի տարբեր տեմպերին [46]: O սպիտակուցի արհեստականորեն բարձրացված մակարդակը նաև հանգեցրեց ավելի արդյունավետ վերարտադրությանը օրի λ, բայց միայն վատ միջավայրում դանդաղ աճող բակտերիաներում [47]: Ակնհայտ է, որ λ պլազմիդի վերարտադրության ուղին, որը հիմնված է նոր հավաքված վերարտադրության համալիրների վրա (համեմատեք Նկար 2-ը) պետք է ազդի այս պայմաններում:

Այս կարգավորման մեխանիզմը պարզ չէ։ -ի գործունեությունը էջՌ խթանող, որից էլ Օ գենը տառադարձվում է, պարզվել է, որ կախված է բջջային աճի տեմպերից, չնայած տարբեր աճի տեմպերի միջև տրանսկրիպցիոն արդյունավետության տարբերություններն ավելի քիչ են արտահայտված, քան λ պլազմիդի կրկնօրինակների համարը [46]: Կարելի է ենթադրել, որ DnaA և SeqA սպիտակուցները, որոնք բակտերիալ քրոմոսոմների վերարտադրության մեկնարկի կարգավորիչներ են և նաև խթանիչներ էջՌ խթանող [48-52], դեր են խաղում ի պատասխան այս խթանող գործունեության տարբեր աճի տեմպերին: Հավանաբար, դանդաղ աճող բակտերիաներում ավելի քիչ արդյունավետ թարգմանությունը կարող է նաև պայմանավորված լինել O սպիտակուցի ցածր մակարդակով այս պայմաններում:

Ջերմային ցնցում և λ պլազմիդի վերարտադրություն

Ջերմային ցնցումների սպիտակուցները DnaK, DnaJ (որը կարող է փոխարինվել իր հոմոլոգ CbpA-ով) և GrpE-ն բացարձակապես անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ից վերարտադրումը սկսելու համար: օրի λ (ակնարկների համար տես՝ [19–22]): Այս սպիտակուցները վերափոխում են նախապրիմոսոմը, որպեսզի ազատեն DnaB հելիկազան P-միջնորդված արգելակումից, և, հավանաբար, նաև ներգրավված են վերարտադրության պատառաքաղներում հելիկազի պատշաճ տեղադրման մեջ: Վերջին արդյունքները ցույց են տալիս, որ այս սպիտակուցներից մեկը՝ DnaK-ը, հանդիսանում է λ ժառանգական վերարտադրության համալիրի բաղադրիչ [41]:

Վերը ներկայացված փաստերի հիման վրա կարելի է կանխատեսել, որ ջերմային ցնցումը կարող է խթանել λ պլազմիդների վերարտադրությունը: Այնուամենայնիվ, դա այդպես չէ, քանի որ ցույց է տրվել, որ λ պլազմիդի կրկնօրինակի թիվը նվազում է 42°C-ում՝ համեմատած ավելի ցածր ջերմաստիճանների (օրինակ՝ 30 կամ 37°C) [44]: Ավելի մանրամասն ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ վերարտադրման ուղին, որը կախված է ժառանգական վերարտադրման համալիրի գործառույթից, խաթարվում է ջերմային ցնցումների պատճառով: Մասնավորապես, ժառանգական վերարտադրման համալիրը, որը ստանդարտ լաբորատոր պայմաններում կայուն կառուցվածք է, որը կարող է գործել բազմաթիվ բջիջների սերունդների համար, ապամոնտաժվում է բակտերիաների տեղափոխումից համեմատաբար կարճ ժամանակ անց 30-ից մինչև 43°C [53]: Պարզվել է, որ այս ապամոնտաժումը կախված է GroEL և GroES ջերմային ցնցումների սպիտակուցներից [53]: Փաստորեն, սա առաջին ցուցադրումն էր, որը հաստատվել է հետագա ուսումնասիրություններով [54], որ GroEL/GroES մոլեկուլային կապերոնային համակարգը ներգրավված է in vivo բարձր կազմակերպված սպիտակուցային կառուցվածքի ապամոնտաժում:

Բացահայտված է ժառանգական λ-ի վերարտադրման համալիրի GroEL/GroES-ից կախված ջերմային ցնցումից առաջացած ապամոնտաժման մեխանիզմը: Ջերմային ցնցումը առաջացնում է գերոլորված պլազմիդային ԴՆԹ-ի մասնակի և անցողիկ թուլացում: Հետագա ԴՆԹ-գիրազից կախված վերագրանցումը հրահրում է ռեպլիկացիոն համալիրի տարանջատումը, որն այնուհետ ապամոնտաժվում է GroEL/GroES շապերոնային համակարգի միջոցով [55]: Հատուկ պայմաններում (օրինակ՝ λ Cro ռեպրեսորի բացակայությունը, որը կոդավորված է λ պլազմիդների մեծ մասի վրա առկա գենով), ժառանգական վերարտադրման համալիրը կարող է գոյատևել ջերմային ցնցում՝ այլ սպիտակուցների հետ փոխազդեցության արդյունքում ավելի կայուն կառուցվածքի ձևավորման պատճառով: 55]։ Դրանցից մեկը հյուրընկալողի կողմից կոդավորված DnaA սպիտակուցն է [56]:

Ամփոփելով, ջերմային շոկի սպիտակուցներն ունեն և՛ դրական, և՛ բացասական գործառույթներ λ պլազմիդի վերարտադրության կարգավորման գործում: Հետաքրքիր է, որ պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերալիցքավորումը նրա մասնակի թուլացումից հետո, որն առաջանում է ջերմային շոկի հետևանքով, որն անհրաժեշտ է ժառանգական վերարտադրման համալիրի ԴՆԹ-ից անջատվելու համար, կախված է DnaK ֆունկցիայից [57]: Սա էլ ավելի է բարդացնում ջերմային ցնցումների սպիտակուցների ազդեցությունը λ պլազմիդի վերարտադրության կարգավորման վրա (համեմատեք նկ. 3): Ավելին, ClpP և ClpX սպիտակուցները, որոնք ձևավորում են պրոթեզերոն, որը քայքայում է O-ի վերարտադրության նախաձեռնող սպիտակուցը, պատկանում են նաև ջերմային ցնցումների սպիտակուցների ընտանիքին:

Տարբեր գործոնների ազդեցությունը λ ժառանգական վերարտադրման համալիրի ձևավորման և կայունության վրա: Համալիրը խորհրդանշվում է մեծ նարնջագույն շրջանով։ Դրական կարգավորիչները նշված են կանաչով, իսկ բացասական կարգավորիչները՝ կապույտով: Խթանման գործընթացները ցուցադրվում են որպես սլաքներ, իսկ արգելակող գործողությունները ցուցադրվում են բութ ծայրերով: Մանրամասների համար տե՛ս տեքստը:

Բարձրացված ջերմաստիճանում (42–43°C) բակտերիաների երկարատև (մի քանի ժամ) աճեցման և ամինաթթուների սովի համակցությունը վնասակար ազդեցություն ունի պլազմիդների վրա: Մասնավորապես, այս պայմաններում նկատվել է պլազմիդային ԴՆԹ-ի քայքայումը [58]: Այս դեգրադացիան հայտնաբերվել է λ պլազմիդի վերարտադրության ուսումնասիրությունների ընթացքում, սակայն այնուհետև ապացուցվել է, որ անկախ է պլազմիդի ռեպլիկոնից [58]: Այս երևույթի մեխանիզմը մնում է անհայտ, թեև կարելի է ենթադրել, որ բակտերիալ կախվածության որոշ մոդուլներ, որոնք ակտիվանում են ամինաթթուների սովի ժամանակ, ինչպես. mazEF[59], կարող է ներգրավվել:

Λ պլազմիդների վերարտադրությունը ցածր ջերմաստիճաններում

Բակտերիոֆագ λ-ի լիտիկ զարգացումը արգելափակվում է 20-25°C ցածր ջերմաստիճանում [60, 61]: Փաստորեն, այս ֆագի պոռթկման չափը ներս է E. coli բջիջները աստիճանաբար ավելանում են 20-ից 37°C ջերմաստիճանի միջակայքում [62]: Ցածր ջերմաստիճանի դեպքում ֆագերի ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը արգելակվել է [62, 63]: Անսպասելիորեն ապացուցվեց, որ բակտերիոֆագից λ-ից ստացված պլազմիդները սովորաբար բազմանում են 25°C-ում [62]:

Ո՞րն է տարբեր λ ֆագերի և λ պլազմիդի ԴՆԹ-ի վերարտադրության կարգավորման մեխանիզմը ցածր ջերմաստիճաններում: Ցույց է տրվել, որ λ ֆագով կոդավորված CII սպիտակուցը ակտիվացնում է էջԵ խթանող (տես Նկար 1) ավելի արդյունավետ ցածր, քան բարձր ջերմաստիճաններում [62, 63]: Ընդլայնված տառադարձում-ից էջԵ կարող է խանգարել տառադարձության մեկնարկին էջՌ, որը կողմնորոշված ​​է հակառակ ուղղությամբ հարաբերական էջԵ (նկ. 1): -ի ցածր ակտիվություն էջՌ հանգեցնում է λ-ի վերարտադրության սպիտակուցների անարդյունավետ արտադրությանը: Հետևաբար, նոր վերարտադրման համալիրների ձևավորումը խաթարված է: Նկատի ունեցեք, որ ֆագային վարակի դեպքում մերկ վիրուսային ԴՆԹ-ն ներարկվում է ընդունող բջիջ, և բոլոր վերարտադրման համալիրները պետք է հավաքվեն: de novo. Երբ λ պլազմիդները հետազոտվեցին, պլազմիդ կրող բջիջները ստանդարտ ջերմաստիճանից (սովորաբար 37°C) տեղափոխվեցին ցածր ջերմաստիճանի: Հետևաբար, նախկինում հավաքված ժառանգական λ վերարտադրման համալիրները գոյություն ունեին ջերմաստիճանի փոփոխության ժամանակ և կարող էին գործել ցածր ջերմաստիճաններում՝ անկախ վերարտադրման նոր համալիրի ձևավորման արգելքից [62]:

SOS արձագանքի ազդեցությունը λ-ի վերարտադրման համալիրների ձևավորման և կայունության վրա

ԴՆԹ-ի վնասը առաջացնում է հատուկ բակտերիալ սթրեսի արձագանք, որը կոչվում է SOS պատասխան [64]: Ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը SOS արձագանքն արդյունավետ կերպով հրահրող գործոններից մեկն է: Ապացուցված է, որ հյուրընկալող բջիջների ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը կանխում է կայուն λ վերարտադրության համալիրի ձևավորումը, մինչդեռ այն չի արգելակում λ ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը [65]: Ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման տակ կարող են ձևավորվել կայուն վերարտադրման համալիրներ recA մուտանտներ [65] ենթադրելով, որ SOS արձագանքը, այլ ոչ թե ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումը ինքնին, պատասխանատու է λ-ի վերարտադրության համալիրի հավաքման գործընթացի փոփոխությունների համար։ Հետաքրքիր է, որ բակտերիաների ուլտրամանուշակագույն լույսի ազդեցությունը չի ազդել ճառագայթումից առաջ հավաքված վերարտադրության համալիրի կայունության վրա [65]: Այս արդյունքները ցույց են տալիս, որ կայուն (ժառանգական) λ վերարտադրման համալիրը, թեև զգայուն է ջերմային ցնցումների նկատմամբ, սակայն դիմացկուն է շրջակա միջավայրի որոշ այլ սթրեսների, օրինակ՝ սառը ցնցումների (տես նախորդ պարբերությունը) կամ ԴՆԹ-ի վնաս պատճառող գործոնների նկատմամբ:

λ ԴՆԹ-ի արդյունավետ վերարտադրությունը նորմալ աճի պայմաններում և ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման բջիջներում ենթադրում է, որ հնարավոր է առնվազն երկու տեսակի λ վերարտադրման համալիրների ձևավորում: Կայուն (ժառանգական) համալիրը կարող է հավաքվել նորմալ աճի պայմաններում, և անկայուն (թեև դեռևս գործում է մեկ վերարտադրության մեկնարկի համար) համալիրը կարող է հավաքվել ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման բջիջներում: Հետաքրքիր է, որ զգալի տարբերություններ ԴՆԹ-ի վերարտադրության մեկնարկի հարցում օրի λ բջիջների միջև, որոնք մշակվել են նորմալ աճի պայմաններում և ուլտրամանուշակագույն ճառագայթումից հետո, նախկինում հաղորդվել է [66]: Սովորաբար, որ օրի λ շրջանը պետք է լինի գերպտուտակային լարվածության տակ, որպեսզի համապատասխան հիմք լինի վերարտադրության մեկնարկի մեքենաների համար [19, 20]: Հետևաբար, երբ կրկնօրինակման փուլն ընթացքի մեջ է, դուստրը օրի λ հաջորդականությունները նման լարվածության տակ չէին լինի, և այդպիսով նրանք կլինեն ոչ ակտիվ: Այնուամենայնիվ, ուլտրամանուշակագույն ճառագայթման բակտերիաների դեպքում գերոլորման պահանջը ծագում Կրկնօրինակումը սկսելու տարածաշրջանը կարծես թե մեղմված է, քանի որ վերարտադրության վերսկսումը օրի λ նկատվել է հանգիստ, դեռևս վերարտադրվող, դուստր մոլեկուլներում [66]: Այս արդյունքները կարող են աջակցել վերևում ներկայացված գաղափարին, որում կարող են արդյունավետորեն գործել առնվազն երկու տարբեր տեսակի կրկնօրինակման համալիրներ օրի լ.

Որոշ վերջին ուսումնասիրություններ այլ պլազմիդների վերարտադրության վերաբերյալ տարբեր սթրեսների ներքո

Բակտերիոֆագից λ-ից ստացված պլազմիդները նկարագրված են այս հոդվածում որպես մոդելներ՝ սթրեսային պայմանների ազդեցության վերաբերյալ էքստրաքրոմոսոմային գենետիկական տարրերի վերարտադրության կարգավորման վրա: Այնուամենայնիվ, ակնհայտ է, որ բջջային սթրեսի արձագանքները զգալիորեն ազդում են պլազմիդների մեծ մասի, եթե ոչ բոլոր տեսակների վերարտադրության վրա: Օրինակ, λ ռեպլիկոնների նման, շատ պլազմիդներ պահանջում են ջերմային շոկի սպիտակուցների գործառույթներ [1]: Տարբեր պլազմիդների վերարտադրության համար տարբեր սթրեսային սպիտակուցների պահանջների կենսաքիմիական ասպեկտները վերջերս վերանայվել են [1–6], և այստեղ մանրամասնորեն չի քննարկվի: Այնուամենայնիվ, մենք դեռ հեռու ենք կարգավորիչ գործընթացների ամբողջական ըմբռնումից, որոնք վերահսկում են տարբեր պլազմիդների վերարտադրությունը սթրեսային պայմաններում: Ստորև մենք համառոտ կքննարկենք որոշ վերջին ուսումնասիրություններ, որոնք անդրադարձան այս խնդրին և զգալի տեղեկություններ ավելացրին պլազմիդի ֆիզիոլոգիայի մասին մեր դեռևս թերի գիտելիքներին:

Մի քանի պլազմիդների (ColE1 նմանվող ռեպլիկոնների ածանցյալներ, pSC101, R1, RK2, R6K, F և P1-ից ստացված ֆագի պլազմիդների ածանցյալները) հետազոտվել են ամինաթթուներով քաղցած բակտերիաների բջիջներում: Այս ուսումնասիրությունները վերջերս մանրամասնորեն վերանայվել են [67] և այստեղ դրանք կամփոփվեն միայն հակիրճ: Շատ դեպքերում, պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերարտադրության արգելակումը նկատվել է ամինաթթուներով քաղցած վայրի տիպի բջիջներում: Այնուամենայնիվ, տարբեր երևույթներ են նկատվել հանգիստ արձագանքման ժամանակ, այսինքն՝ որոշ ռեպլիկոնների վերարտադրությունը արգելակվել է ամինաթթուներով քաղցած վիճակում։ relA մուտանտներ, մինչդեռ այլ ռեպլիկոնների վերարտադրությունը արդյունավետ կերպով ընթացավ այս պայմաններում: Նման կրկնօրինակումը հանգեցրեց բակտերիաներում պլազմիդների ուժեղացմանը: Հետաքրքիր է, որ շատ դեպքերում պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերարտադրման արդյունավետությունը թուլացած պատասխանի ժամանակ կախված էր ամինաթթվի պակասի բնույթից (մանրամասների համար տե՛ս հղումը [67] և հղումները այնտեղ)։ Առաջարկություններ ամինաթթուների քաղցած որոշ պլազմիդների վերարտադրության վերահսկման հնարավոր կարգավորիչ մեխանիզմների վերաբերյալ relA ներկայացվել են մուտանտներ [67]:

Ապացուցված է, որ pSY10 պլազմիդը, որն առկա է սեռին պատկանող ծովային ցիանոբակտերիաներում Synechococcus, պահպանվում է կրկնօրինակների մեծ քանակով, երբ հյուրընկալող բջիջները աճում են ծովի ջրում և փոքր կրկնօրինակների քանակով՝ քաղցրահամ ջրերում մշակված բջիջներում [68]: Հետևաբար, այս պլազմիդի վերարտադրության կարգավորումը պետք է կախված լինի շրջակա միջավայրի աղիությունից: Ավելի մանրամասն փորձերը ցույց տվեցին, որ տառադարձումը repA գենը, որը կոդավորում է պլազմիդի վերարտադրությունը նախաձեռնող սպիտակուցը, ընկճված է քաղցրահամ ջրերում աճող բջիջներում՝ համեմատած ավելի բարձր աղի պայմաններում աճեցված ցիանոբակտերիաների հետ [68]: Ավելին, ենթադրյալ ռեպրեսոր է ներկայացուցիչ Հայտնաբերվել է գենի խթանիչ, և պարզվել է, որ այս սպիտակուցը սինթեզվում է միայն ցածր աղիության դեպքում [68]: Այս սպիտակուցը, որը կոդավորված է հյուրընկալող քրոմոսոմով, հիանալի թեկնածու է pSY10 վերարտադրության հիմնական կարգավորիչի համար՝ ի պատասխան շրջակա միջավայրի աղիության փոփոխության:

Որոշ պլազմիդներ կոդավորում են իրենց սեփական սթրեսային սպիտակուցները: Օրինակ, փոքր ջերմային ցնցումների սպիտակուցների գեները արտահայտված են pER16, pER35 և pER36 պլազմիդներից, որոնք բնականաբար հանդիպում են Streptococcus thermophilus շտամներ [69]: Այս սպիտակուցները մեծացնում են բակտերիաների կենսունակությունը էքստրեմալ միջավայրերում, և ենթադրվում է, որ պլազմիդային կոդավորված ջերմային ցնցումների սպիտակուցների առկայությունը կարող է ուժեղացնել բջիջների գոյատևումը հատուկ պայմաններում:

Դիտարկվել են ջերմաստիճանի բարձրացման և ռեկոմբինանտ սպիտակուցների բարձր մակարդակի արտադրության հետաքրքիր համակցված ազդեցություններ ColE1-ի նման պլազմիդների վերարտադրության վրա [70]: Մասնավորապես, այն պայմաններում, որոնք սովորաբար առաջացնում են պլազմիդային ԴՆԹ-ի ուժեղացում բարձր ջերմաստիճաններում, ռեկոմբինանտ սպիտակուցների միաժամանակյա գերարտահայտումը, որոնք կազմում են ներառական մարմիններ, թուլացնում է պլազմիդային ԴՆԹ-ի ուժեղացումը [70]: Փաստորեն, ռեկոմբինանտ սպիտակուցների ուժեղացված արտադրության ազդեցությունը ColE1-ի նման պլազմիդների կայունության վրա E. coli շտամներ նախկինում հաղորդվել էին [71], և ավելի վերջին ուսումնասիրությունները ցույց տվեցին, որ բակտերիաներում արտադրվող ռեկոմբինանտ սպիտակուցների առանձնահատկությունները ազդում են պլազմիդի պահպանման արդյունավետության վրա [72]: Այս կանոնակարգերի մոլեկուլային մեխանիզմները դեռ պետք է պարզաբանվեն:

Ինչպես նշվեց վերևում, ի տարբերություն բակտերիոֆագից λ-ից ստացված պլազմիդների (տես նախորդ պարբերությունները), ջերմաստիճանի բարձրացումն առաջացնում է ColE1-ի նման պլազմիդների ուժեղացում [70]: Նման պայմաններում նախկինում նկատվել է նաև բակտերիալ քրոմոսմերի վերարտադրության արագության բարձրացում [73]: Ավելի վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ ջերմային ազդեցությամբ առաջացած այս քրոմոսոմի վերարտադրությունը սկսվում է oriC (նուկլեոիդների վերարտադրության մեկնարկի նորմալ տեղամաս) և պահանջում է RNaseH1 և RecA սպիտակուցներ, բայց ոչ ՌՆԹ պոլիմերազային ակտիվություն և de novo սպիտակուցի սինթեզ [74]. Առաջարկվում էր, որ այս երևույթը կարող է բացատրվել ջերմային ազդեցությամբ թերմոդինամիկական փոփոխությամբ oriC կառուցվածքը և/կամ մեմբրանի հեղուկությունը [74]:

Ինչպես նշվեց նախորդ պարբերություններում, ռեկոմբինանտ գեների գերարտահայտումը կարող է արգելակել պլազմիդային ԴՆԹ-ի վերարտադրությունը [70]: Նման արգելակումը կարող է լինել բջջային SOS արձագանքի խթանիչ ազդանշան [75]: Փաստորեն, SOS արձագանքը կարող է առաջանալ մեկ պլազմիդի կոդավորված սպիտակուցի միջոցով, օրինակ՝ pSC101, RepA պլազմիդի վերարտադրության նախաձեռնող սպիտակուցը [76]: Առաջարկվում էր, որ SOS արձագանքի նման ինդուկցիան կարող է օգտակար լինել RepA սպիտակուցի բջջային մակարդակի և պլազմիդով փոխանցվող RepA-կապող տեղամասերի միջև անհավասարակշռության հայտնաբերման համար [76]: Այս մեխանիզմը պետք է հանգեցնի հյուրընկալող քրոմոսոմի վերարտադրության արգելմանը և պետք է հետաձգի հյուրընկալող բջիջների բաժանումը, երբ RepA-ն հարաբերական ավելցուկ է: Սա կարող է օգնել սահմանափակել պլազմիդի կրկնօրինակների թվի տարբերությունը և կանխել պլազմիդից պակաս բջիջների ձևավորումը:


Վիրուլենտային պլազմիդի կոնյուգացիա կլինիկականում Klebsiella pneumoniae Շտամներ միաձուլման պլազմիդի ձևավորման միջոցով

Ոչ կոնյուգատիվ վիրուսային պլազմիդների արագ տարածումը ոչ K1/K2 տեսակների մեջ Klebsiella pneumoniae աննախադեպ վտանգ է ներկայացնում մարդու առողջության համար, սակայն նման պլազմիդների տարածման հիմքում ընկած մեխանիզմները պարզ չեն: Այս ուսումնասիրության մեջ հայտնաբերվել է նոր 68 581 bp IncFIA պլազմիդ, որը կարող է միաձուլվել հիպերվիրուլենտություն կոդավորող պլազմիդի հետ՝ ձևավորելու հիբրիդային կոնյուգատիվ վիրուսային պլազմիդ՝ կոնյուգացիոն փորձերում, այդպիսի միաձուլման իրադարձությունները ներառում են հոմոլոգ վերահամակցում յուրաքանչյուր 241 bp հոմոլոգ շրջանի միջև։ երկու պլազմիդ. Միաձուլման հիպերվիրուլենտությունը կոդավորող պլազմիդը կարող է զուգակցվել ինչպես դասական, այնպես էլ բլաKPC-2- կրող կարբապենեմ դիմացկուն K. pneumoniae շտամներ կոնյուգացիայի միջոցով, ինչը հնարավորություն է տալիս այդպիսի շտամներին ձեռք բերել հիպերվիրուլենտության ֆենոտիպը արտահայտելու ունակություն: Այս միաձուլման վիրուսային պլազմիդի տարածումը հսկայական բեռ կդնի բազմադեղակայուն և հիպերվիրուլենտ վարակների վերահսկման և բուժման ընթացիկ ջանքերի վրա: K. pneumoniae.

Խնդրում ենք նկատի ունենալ. Հրատարակիչը պատասխանատվություն չի կրում հեղինակների կողմից տրամադրված օժանդակ տեղեկատվության բովանդակության կամ ֆունկցիոնալության համար: Ցանկացած հարցում (բացի բացակայող բովանդակությունից) պետք է ուղղվի հոդվածի համապատասխան հեղինակին:


Ե՞րբ պետք է օգտագործել խիստ պլազմիդ: - Կենսաբանություն

Պե՞տք է օգտագործեմ IRES կամ 2A իմ պոլիցիստրոնային արտահայտիչ ձայներիզում:

Գենի էքսպրեսիայի վեկտորը նախագծելիս՝ մեկ պրոմոութորի հսկողության տակ մի քանի ORF-ներ համատեղ արտահայտելու համար, դուք կարող եք ընտրել մի քանի ORF-ներ տեղադրել պրոմոութերի հետևում՝ առանձնացված կապողներով, ինչպիսիք են ներքին ռիբոսոմի մուտքի տեղամասը (IRES) կամ 2A ընտանիքի պեպտիդները: Կապակցող ցանկացած տեսակի համար մի քանի սպիտակուցներ կարտադրվեն մեկ mRNA տառադարձից:

Մեխանիզմներ

Առավել հաճախ օգտագործվող IRES տարրը, ինչպես նաև VectorBuilder-ի կողմից օգտագործվող տարրը, առաջացել է էնցեֆալոմիոկարդիտի վիրուսից (EMCV): Այն գործում է որպես ռիբոսոմների հավաքագրման լրացուցիչ տեղամաս՝ թույլ տալով թարգմանության մեկնարկը տեղի ունենալ mRNA-ի ներքին հատվածում՝ ի լրումն թարգմանության սկզբնական տեղամասի:

2A պեպտիդները կարճ են (

18-25 աա) վիրուսներից ստացված պեպտիդներ. Դրանք հաճախ կոչվում են «ինքնուրույն ճեղքող» պեպտիդներ, որոնք միևնույն տառադարձից կարտադրեն բազմաթիվ սպիտակուցներ: 2A պեպտիդներն ամբողջությամբ չեն ճեղքվում, քանի որ դրանք գործում են՝ ստիպելով ռիբոսոմին բաց թողնել 2A տարրի C-տերմինալի վերջում գլիկինի և պրոլինի պեպտիդային կապի սինթեզը՝ առաջացնելով տարանջատում 2A հաջորդականության վերջի և ներքևի պեպտիդների միջև։ . Արդյունքում, հոսանքին հակառակ սպիտակուցը կունենա մի քանի լրացուցիչ 2A մնացորդներ, որոնք կավելացվեն իր C վերջնամասում, մինչդեռ հոսանքով ներքև գտնվող սպիտակուցը կունենա լրացուցիչ պրոլին՝ ավելացված իր N վերջնակետին: Կան չորս սովորաբար օգտագործվող 2A պեպտիդներ՝ P2A, T2A, E2A և F2A, որոնք ստացվում են չորս տարբեր վիրուսներից:

Երկու տեսակի կապակցիչների առավելություններն ու թերությունները

IRES-ի հիմնական առավելությունը 2A-ի նկատմամբ այն է, որ այն չի ազդում ոչ հոսանքին հակառակ, ոչ էլ ներքևի ORF-ի սպիտակուցային հաջորդականության վրա, ինչը չի կարելի ասել 2A-ի դեպքում:

IRES-ի հիմնական թերությունն այն է, որ IRES-ից ներքև գտնվող ORF-ն արտահայտված է շատ ավելի ցածր մակարդակներում (սովորաբար 10-20%)՝ համեմատած պոլիցիստրոնի ORF-ի վերին հոսանքում: Ահա թե ինչու, երբ մարդիկ արտահայտում են լյումինեսցենտային սպիտակուցներ IRES-ից հետո, նրանք հաճախ դժվարանում են հայտնաբերել ֆլյուորեսցենտային ազդանշան ստանալ, հատկապես in vivo ծրագրերի համար, որտեղ յուրաքանչյուր բջջի սահմանափակ թվով տրանսգեներ կան: IRES տարրերը կարող են նաև խնդրահարույց լինել իրենց չափերի պատճառով (>500 bp), ինչը մեծացնում է վեկտորի կառուցման և վիրուսների փաթեթավորման դժվարությունը:

IRES-ի նկատմամբ 2A-ի հիմնական առավելությունն այն է, որ ներքևում գտնվող ORF-ը կարող է արտահայտվել մի մակարդակով, որը համեմատելի է (կամ պարզապես չափավոր ավելի քիչ, քան) ORF-ի վերին հոսանքը:

2A-ի թերությունը լրացուցիչ պեպտիդային մնացորդների անցանկալի կենսաբանական ազդեցությունների հնարավորությունն է, որոնք թողնվում են դեպի վերև կամ ներքև ORF-ի վրա: Բացի այդ, 2A-ի ինքնազատումը 100% արդյունավետ չէ, և արդյունավետության վրա կարող է մեծ ազդեցություն ունենալ ORF-ի վերին և ներքևի հոսանքով անցնող հաջորդականության համատեքստը: Որպես այդպիսին, պոլիցիստրոնից թարգմանվող արտադրանքի զգալի մասը կարող է լինել միաձուլման պրոտեին, որը չի կարողացել ինքնուրույն ճեղքվել, ինչը կարող է մտահոգիչ լինել որոշ ծրագրերում:

Եթե ​​ձեր փորձերը չեն պահանջում բիցիստրոնի երկրորդ ORF-ի բարձր մակարդակի արտահայտում (օրինակ՝ դեղամիջոցի ընտրության մարկեր), ապա IRES-ը պետք է բավարար լինի: Այնուամենայնիվ, եթե պոլիցիստրոնում կան ավելի քան երկու ORF-ներ, կամ եթե կարևոր է կանխատեսելի կամ հավասար քանակի բազմակի համակցված ORF-ներ, մենք առաջարկում ենք օգտագործել 2A պեպտիդներ:

Տարբեր 2A պեպտիդների համեմատություն

Չորս սովորաբար օգտագործվող 2A պեպտիդներից (P2A, T2A, E2A և F2A), ցույց է տրված, որ P2A-ն ընդհանուր առմամբ ունի ճեղքման ամենաբարձր արդյունավետությունը (որոշ դեպքերում մոտ 100%): Հաջորդը գալիս է T2A-ն, որին հաջորդում են E2A-ն և F2A-ն: F2A-ի ճեղքման արդյունավետությունը կազմում է ընդամենը մոտ 50%: Մենք, ընդհանուր առմամբ, խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել P2A կամ T2A պոլիցիստրոններում: